明胶-阿霉素抗癌缓释剂对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制研究*
作者：陈杰 叶章群 周惜才 张旭 章咏裳
单位：同济医科大学附属协和医院外科,武汉 430022 陈杰；同济医科大学附属同济医院外科,武汉 430030 叶章群 周惜才 张旭 章咏裳
关键词：明胶；阿霉素；膀胱肿瘤
同济医科大学学报990318 摘要 应用含20 ml/L小牛血清的完全培养基浸泡明胶-阿霉素抗癌缓释剂,每隔24 h重复更换培养基,而后将每d浸泡所得的培养基与BIU-87细胞混合培养。结果发现，直至第19 d经抗癌缓释剂浸泡过的培养基仍对BIU-87细胞具有生长抑制作用,其中第1 d BIU-87细胞生长率仅为10%,第5 d BIU-87细胞生长率为60%,第19 d BIU-87细胞生长率仍低于80%。这为明胶-阿霉素抗癌缓释剂应用于临床治疗膀胱肿瘤提供了实验依据。
Study on Growth Suppression of Gelatia-adriamycin Antineoplastic
, http://www.100md.com
Sustained Release Drug System on the Bladder Tumor Cell Line BIU-87
Chen Jie1, Ye Zhangqun2, Zhou Xicai2 et al
1 Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430030
2 Department of Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract Gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system was impregnated into the culture- medium containing 20% bovine serum.The medium was substituted every 24 h. Then the human bladder tumor cell line BIU-87 was coincubated with the substituted medium every day. It was found that the substituted medium on 19 day still had growth suppression effects on the BIU-87 cells.The growth rate of BIU-87 cells at first, 5th and 19th day was only 10 %, 60 % and less than 80 %, respectively. Therefore, the results provided experimental evidences for the possibility that gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system could be used in the therapy for bladder tumors.
, 百拇医药
Key words gelatia; adriamycin; bladder tumors
近30年来,在缓释和控释药物治疗方面取得了很大进展, 人体内各种可降解性高分子材料被广泛运用。作为药物载体,一方面形成分子网络将 药物包埋于其中,另一方面在机体内组织蛋白酶的作用下,交联结构,主链及侧链水解断裂,使药物得以缓慢释放。医用明胶即为人体内可降解性高分子材料,长期临床应用表明该物质组织相容性好,且价格便宜。 我们选用它作为药物载体,将抗癌药阿霉素掺入,经戊二醛分子交联后制得明胶-阿霉素抗癌缓释剂。通过观察抗癌缓释剂对BIU-87 膀胱肿瘤细胞株的生长抑制作用,以初步判断明胶-阿霉素抗癌缓释剂治疗膀胱肿瘤的临床可行性。
1 材料与方法
1.1 抗癌缓释剂的制备
称取10 g医用明胶置于烧杯,以注射用水溶解10 mg阿霉素,并加注射用水至50 ml处,充分搅拌,浸泡12 h。然后置60 ℃水浴箱内水浴15 min,待明胶及阿霉素充分溶解后,以洁净之青霉素小瓶分装,数 min后冷却成凝胶状,封瓶,用60Co照射消毒,备用。将上述明胶- 阿霉素混合剂置温水中浸泡5 min,充分溶解呈液体状,每5 ml加入25 g/L戊二醛0.2 ml, 混 匀,保持流动性30～60 min,即为明胶-阿霉素抗癌缓释剂。
, 百拇医药
1.2 明胶-阿霉素抗癌缓释剂对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制实验
于超净工作台取明胶-阿霉素抗癌缓释剂0.5 ml及20 g/L明胶-25 g/L戊二醛混合剂0.5 ml(已消毒,明胶∶戊二醛=20∶1),分别注入消毒培养瓶中。 待其凝固后加入含20 ml/L小牛血清的完全培养基4 ml,置于恒温培养箱内, 于37 ℃下培养24 h后等量更换培养基,重复上述过程。将每 d所得之明胶阿霉素抗癌缓释剂及20 g/L明胶25 g/L戊二醛混合剂浸泡过的培养基置于 4 ℃冰箱待检。
取25 ml无菌培养瓶若干个,每瓶接种BIU-87细胞2 ml,浓度为4×104 /ml,分两组进行细胞培养。实验组∶浸泡过明胶阿霉素抗癌缓释剂的培养基1 ml+完全培养基2 ml;对照组∶浸泡过明胶-戊二醛混合剂的培养基1 ml+完全培养基2 ml。
将每d浸泡所得之8 ml培养基分别与8瓶BIU-87细胞培养,37 ℃下培养3 ～4 d后于倒置显微镜下观察BIU-87细胞的形态,而后以胰蛋白酶消化, 收获细胞行台盼蓝染色,计算活细胞数,然后按下式求出实验组BIU-87细胞的生长率。
, 百拇医药
生长率(%)=实验组活细胞均数/对照组活细胞均数×100%
按细胞生物学实验原则,生长率<80%为释出药物对BIU-87细胞具有生 长抑制作用。
1.3 统计学处理
实验数据输入微机,应用SAS软件系统进行统计学处理。
2 结果
对照组可见BIU-87细胞生长良好,呈典型铺路石状改变,胞体大,胞浆丰富,绝大部分细胞贴壁生长,见图1。
实验组则表现出对BIU-87细胞明显的生长抑制作用,如细胞脱壁, 胞内颗粒增多,部分细胞解体及悬浮等现象,见图2。
, 百拇医药
图1 对照组之BIU-87细胞 ×160
图2 实验组之BIU-87细胞 ×160
明胶-阿霉素抗癌缓释剂在不同时间对BIU-87细胞生长率的影响见图3。
由图3可见,明胶-阿霉素抗癌缓释剂对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制作用达19 d。早期对BIU-87细胞生长抑制作用十分显著,如第 1 d BIU-87细胞生长率仅为10%。随后杀伤作用逐渐减弱,至第5 d BIU-87细胞生长率为60%,但明胶-阿霉素抗癌缓释剂保持这一生长抑制水平直至第15 d,随后又逐渐下降,第19 d BIU-87细胞生长率仍低于80%。第20 d释出药物与BIU-87细胞培养,其生长率为92.7%,超过80%,视为对BIU-87 细胞无生长抑制作用。
, 百拇医药
图3 明胶-阿霉素抗癌缓释剂在不同时间对BIU-87细胞生长率的影响
3 讨论
膀胱肿瘤为泌尿生殖系最常见的肿瘤,近年来其发病率呈上升趋势[1]。目前对表浅性膀胱肿瘤经尿道切除和膀胱部分切除术后多采用膀胱内药物灌注进行治疗,但复发率仍较高,有文献报道[2]高达27.2%,吴荣杨等[3]对134例膀胱肿瘤患者术后立即粘膜下注射化疗药物(噻替哌、5-FU、环磷酰胺、氮芥任选一种),随访1～15年,复发率为18.7%,说明术后粘膜下注射化疗药物有助于降低膀胱肿瘤的复发率。 但于粘膜下注射化疗药物,类似于肌肉注射,局部作用时间短暂,如果开发出一种能在膀胱局部缓慢释放的化疗药物新剂型,则膀胱肿瘤的复发率可望进一步降低, 正是基于这一目的,我们进行了明胶-阿霉素抗癌缓释剂的研制。
本实验先将明胶及抗癌药阿霉素溶解,而后加入少量戊二醛(明胶∶戊二醛=20∶1),则先前溶解之阿霉素即包埋于明胶与戊二醛形成的分子网络中。而交联结构,明胶主链以及明胶侧链均可在体内各种组织蛋白酶作用下水解,因而阿霉素得以缓慢释放。
, 百拇医药
我们选用阿霉素作为治疗药物的原因:①阿霉素是一种强效广谱抗肿瘤药,尽管其骨髓抑制及心脏毒性发生率较高, 但近年来开发出的一系列阿霉素缓释剂表明,阿霉素缓慢释出后其毒副作用发生率明显降低[4～6]。②阿霉素对膀胱肿瘤治疗有效,这已为大量临床实践所证实。而且近年来有研究表明阿霉素对病理分级较高的表浅性膀胱肿瘤的疗效优于其它化疗药物[7～9]。
明胶-阿霉素抗癌缓释剂对BIU-87细胞的生长抑制作用长达19 d,这表 明该抗癌缓释剂的缓释特性良好,其对BIU-87细胞的生长抑制作用表现出一定的规律性,即早期(第1～4 d)生长抑制作用明显,而后稳定于一定生长抑制水平10 d左右。这不仅符合一般抗癌缓释剂的药代动力学要求, 也符合肿瘤化疗药物治疗学的要求,即早期大量杀伤肿瘤细胞, 而后于多个细胞增殖周期内对残留的肿瘤细胞发挥持续抗瘤效应。[10]
综上所述,我们认为明胶-阿霉素抗癌缓释剂释药特性良好,对人膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制作用明显,持续时间较长, 为较理想的抗膀胱肿瘤缓释剂。
, 百拇医药
* 国家教委资助课题(教外留[1995]806号)
作者简介:陈杰,男,1971年生,硕士,住院医师
参考文献
1 虞颂庭. 尿路上皮性肿瘤概论. 见:吴阶平主编.泌尿外科学 .济南: 山东科学技术出版社, 1993.421～424
2 顾方六. 第四届全国泌尿外科学术会议总结. 中华泌尿外科杂志 ,1993,14(1):5
3 吴荣扬,詹炳炎,王令珑等. 膀胱粘膜下注射抗癌药物的实验研究与临床观察. 中华泌尿外科杂志, 1993,14(2):108
4 Gabizon A, Sulkes N, Ben- Baruch T et al. Exploratory clinical phase of limpsome- entrapped doxorubicin. J Cell Biochem,1988,12:251
, http://www.100md.com
5 Delgado G, Potkul P K， Treat J A et al. Aphase Ⅰ/Ⅱ study of intraperitoneally administered doxorubicin entrapped in cardiolipid limpsomes in patients with ovarian cancer. Am J Obstet Cynecol, 1989,160:812
6 Kim S, Turker M S, Chi E Y et al. Preparation of multivesicular liposomes. Biochim Biphys Acta, 1983,728:339
7 Glashan R W. Tratment of carcinoma in situ of the bladder with doxoruboicin. Cancer Chemother Pharmacol, 1983,11:35
, http://www.100md.com
8 Matsumura Y. Intravesical adriamycin chemotherapy in bladder cancer. Cancer Chemother Pharmacol, 1983,11:69
9 Bono A V, Benventi C, Damiano G et al. Results of transurethral resection and intravesical doxorubicin proghylaxis in patients with T1G3 blader cancer. Urology, 1994, 4:329
10 韩锐. 癌化学治疗基础. 见：韩锐主编:肿瘤化学预防及药物治疗. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1991.352～357
(1998-04-06 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院外科,武汉 430022 陈杰；同济医科大学附属同济医院外科,武汉 430030 叶章群 周惜才 张旭 章咏裳
关键词：明胶；阿霉素；膀胱肿瘤
同济医科大学学报990318 摘要 应用含20 ml/L小牛血清的完全培养基浸泡明胶-阿霉素抗癌缓释剂,每隔24 h重复更换培养基,而后将每d浸泡所得的培养基与BIU-87细胞混合培养。结果发现，直至第19 d经抗癌缓释剂浸泡过的培养基仍对BIU-87细胞具有生长抑制作用,其中第1 d BIU-87细胞生长率仅为10%,第5 d BIU-87细胞生长率为60%,第19 d BIU-87细胞生长率仍低于80%。这为明胶-阿霉素抗癌缓释剂应用于临床治疗膀胱肿瘤提供了实验依据。
Study on Growth Suppression of Gelatia-adriamycin Antineoplastic
, http://www.100md.com
Sustained Release Drug System on the Bladder Tumor Cell Line BIU-87
Chen Jie1, Ye Zhangqun2, Zhou Xicai2 et al
1 Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430030
2 Department of Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract Gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system was impregnated into the culture- medium containing 20% bovine serum.The medium was substituted every 24 h. Then the human bladder tumor cell line BIU-87 was coincubated with the substituted medium every day. It was found that the substituted medium on 19 day still had growth suppression effects on the BIU-87 cells.The growth rate of BIU-87 cells at first, 5th and 19th day was only 10 %, 60 % and less than 80 %, respectively. Therefore, the results provided experimental evidences for the possibility that gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system could be used in the therapy for bladder tumors.
, 百拇医药
Key words gelatia; adriamycin; bladder tumors
近30年来,在缓释和控释药物治疗方面取得了很大进展, 人体内各种可降解性高分子材料被广泛运用。作为药物载体,一方面形成分子网络将 药物包埋于其中,另一方面在机体内组织蛋白酶的作用下,交联结构,主链及侧链水解断裂,使药物得以缓慢释放。医用明胶即为人体内可降解性高分子材料,长期临床应用表明该物质组织相容性好,且价格便宜。 我们选用它作为药物载体,将抗癌药阿霉素掺入,经戊二醛分子交联后制得明胶-阿霉素抗癌缓释剂。通过观察抗癌缓释剂对BIU-87 膀胱肿瘤细胞株的生长抑制作用,以初步判断明胶-阿霉素抗癌缓释剂治疗膀胱肿瘤的临床可行性。
1 材料与方法
1.1 抗癌缓释剂的制备
称取10 g医用明胶置于烧杯,以注射用水溶解10 mg阿霉素,并加注射用水至50 ml处,充分搅拌,浸泡12 h。然后置60 ℃水浴箱内水浴15 min,待明胶及阿霉素充分溶解后,以洁净之青霉素小瓶分装,数 min后冷却成凝胶状,封瓶,用60Co照射消毒,备用。将上述明胶- 阿霉素混合剂置温水中浸泡5 min,充分溶解呈液体状,每5 ml加入25 g/L戊二醛0.2 ml, 混 匀,保持流动性30～60 min,即为明胶-阿霉素抗癌缓释剂。
, 百拇医药
1.2 明胶-阿霉素抗癌缓释剂对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制实验
于超净工作台取明胶-阿霉素抗癌缓释剂0.5 ml及20 g/L明胶-25 g/L戊二醛混合剂0.5 ml(已消毒,明胶∶戊二醛=20∶1),分别注入消毒培养瓶中。 待其凝固后加入含20 ml/L小牛血清的完全培养基4 ml,置于恒温培养箱内, 于37 ℃下培养24 h后等量更换培养基,重复上述过程。将每 d所得之明胶阿霉素抗癌缓释剂及20 g/L明胶25 g/L戊二醛混合剂浸泡过的培养基置于 4 ℃冰箱待检。
取25 ml无菌培养瓶若干个,每瓶接种BIU-87细胞2 ml,浓度为4×104 /ml,分两组进行细胞培养。实验组∶浸泡过明胶阿霉素抗癌缓释剂的培养基1 ml+完全培养基2 ml;对照组∶浸泡过明胶-戊二醛混合剂的培养基1 ml+完全培养基2 ml。
将每d浸泡所得之8 ml培养基分别与8瓶BIU-87细胞培养,37 ℃下培养3 ～4 d后于倒置显微镜下观察BIU-87细胞的形态,而后以胰蛋白酶消化, 收获细胞行台盼蓝染色,计算活细胞数,然后按下式求出实验组BIU-87细胞的生长率。
, 百拇医药
生长率(%)=实验组活细胞均数/对照组活细胞均数×100%
按细胞生物学实验原则,生长率<80%为释出药物对BIU-87细胞具有生 长抑制作用。
1.3 统计学处理
实验数据输入微机,应用SAS软件系统进行统计学处理。
2 结果
对照组可见BIU-87细胞生长良好,呈典型铺路石状改变,胞体大,胞浆丰富,绝大部分细胞贴壁生长,见图1。
实验组则表现出对BIU-87细胞明显的生长抑制作用,如细胞脱壁, 胞内颗粒增多,部分细胞解体及悬浮等现象,见图2。
, 百拇医药
图1 对照组之BIU-87细胞 ×160
图2 实验组之BIU-87细胞 ×160
明胶-阿霉素抗癌缓释剂在不同时间对BIU-87细胞生长率的影响见图3。
由图3可见,明胶-阿霉素抗癌缓释剂对膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制作用达19 d。早期对BIU-87细胞生长抑制作用十分显著,如第 1 d BIU-87细胞生长率仅为10%。随后杀伤作用逐渐减弱,至第5 d BIU-87细胞生长率为60%,但明胶-阿霉素抗癌缓释剂保持这一生长抑制水平直至第15 d,随后又逐渐下降,第19 d BIU-87细胞生长率仍低于80%。第20 d释出药物与BIU-87细胞培养,其生长率为92.7%,超过80%,视为对BIU-87 细胞无生长抑制作用。
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图3 明胶-阿霉素抗癌缓释剂在不同时间对BIU-87细胞生长率的影响
3 讨论
膀胱肿瘤为泌尿生殖系最常见的肿瘤,近年来其发病率呈上升趋势[1]。目前对表浅性膀胱肿瘤经尿道切除和膀胱部分切除术后多采用膀胱内药物灌注进行治疗,但复发率仍较高,有文献报道[2]高达27.2%,吴荣杨等[3]对134例膀胱肿瘤患者术后立即粘膜下注射化疗药物(噻替哌、5-FU、环磷酰胺、氮芥任选一种),随访1～15年,复发率为18.7%,说明术后粘膜下注射化疗药物有助于降低膀胱肿瘤的复发率。 但于粘膜下注射化疗药物,类似于肌肉注射,局部作用时间短暂,如果开发出一种能在膀胱局部缓慢释放的化疗药物新剂型,则膀胱肿瘤的复发率可望进一步降低, 正是基于这一目的,我们进行了明胶-阿霉素抗癌缓释剂的研制。
本实验先将明胶及抗癌药阿霉素溶解,而后加入少量戊二醛(明胶∶戊二醛=20∶1),则先前溶解之阿霉素即包埋于明胶与戊二醛形成的分子网络中。而交联结构,明胶主链以及明胶侧链均可在体内各种组织蛋白酶作用下水解,因而阿霉素得以缓慢释放。
, 百拇医药
我们选用阿霉素作为治疗药物的原因:①阿霉素是一种强效广谱抗肿瘤药,尽管其骨髓抑制及心脏毒性发生率较高, 但近年来开发出的一系列阿霉素缓释剂表明,阿霉素缓慢释出后其毒副作用发生率明显降低[4～6]。②阿霉素对膀胱肿瘤治疗有效,这已为大量临床实践所证实。而且近年来有研究表明阿霉素对病理分级较高的表浅性膀胱肿瘤的疗效优于其它化疗药物[7～9]。
明胶-阿霉素抗癌缓释剂对BIU-87细胞的生长抑制作用长达19 d,这表 明该抗癌缓释剂的缓释特性良好,其对BIU-87细胞的生长抑制作用表现出一定的规律性,即早期(第1～4 d)生长抑制作用明显,而后稳定于一定生长抑制水平10 d左右。这不仅符合一般抗癌缓释剂的药代动力学要求, 也符合肿瘤化疗药物治疗学的要求,即早期大量杀伤肿瘤细胞, 而后于多个细胞增殖周期内对残留的肿瘤细胞发挥持续抗瘤效应。[10]
综上所述,我们认为明胶-阿霉素抗癌缓释剂释药特性良好,对人膀胱肿瘤细胞株BIU-87的生长抑制作用明显,持续时间较长, 为较理想的抗膀胱肿瘤缓释剂。
, 百拇医药
* 国家教委资助课题(教外留[1995]806号)
作者简介:陈杰,男,1971年生,硕士,住院医师
参考文献
1 虞颂庭. 尿路上皮性肿瘤概论. 见:吴阶平主编.泌尿外科学 .济南: 山东科学技术出版社, 1993.421～424
2 顾方六. 第四届全国泌尿外科学术会议总结. 中华泌尿外科杂志 ,1993,14(1):5
3 吴荣扬,詹炳炎,王令珑等. 膀胱粘膜下注射抗癌药物的实验研究与临床观察. 中华泌尿外科杂志, 1993,14(2):108
4 Gabizon A, Sulkes N, Ben- Baruch T et al. Exploratory clinical phase of limpsome- entrapped doxorubicin. J Cell Biochem,1988,12:251
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5 Delgado G, Potkul P K， Treat J A et al. Aphase Ⅰ/Ⅱ study of intraperitoneally administered doxorubicin entrapped in cardiolipid limpsomes in patients with ovarian cancer. Am J Obstet Cynecol, 1989,160:812
6 Kim S, Turker M S, Chi E Y et al. Preparation of multivesicular liposomes. Biochim Biphys Acta, 1983,728:339
7 Glashan R W. Tratment of carcinoma in situ of the bladder with doxoruboicin. Cancer Chemother Pharmacol, 1983,11:35
, http://www.100md.com
8 Matsumura Y. Intravesical adriamycin chemotherapy in bladder cancer. Cancer Chemother Pharmacol, 1983,11:69
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10 韩锐. 癌化学治疗基础. 见：韩锐主编:肿瘤化学预防及药物治疗. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1991.352～357
(1998-04-06 收稿), 百拇医药