离体灌注溶液快速置换法及其在细胞内记录中的应用
作者：高翠英 吕国蔚
单位：首都医科大学神经生物学研究室
关键词：
首都医科大学学报/990321 应用离体制备进行科学研究，是神经生理学、药理学等学科中常用的方法之一。药物的加入及溶液的置换是离体实验的一个重要环节。原有的置换方法一般存在置换时间偏长(几分钟或更长)，直接向灌注槽内压力注药易造成浓度不均及液面波动，从而影响实验结果等不足。这些不足，在细胞内记录中显得尤为突出。国外在膜片钳技术中采用了药物快速供给方法并取得满意实验结果[1] 。但国内尚未见到有关报道。
根据细胞内记录的特点，在已建立的离体制备细胞内记录技术的基础上[2]，我们在实验中制作了一种溶液快速置换装置，并以蟾蜍离体脊神经节为标本，记录细胞内动作电位，观察正常溶液和含谷氨酸(Glu)或含γ-氨基丁酸(GABA)溶液交替灌注时，实现溶液完全置换所需时间以及对记录的影响，取得了较好的实验结果，建立了离体灌注快速置换法，从而解决了离体灌注溶液的置换及加药问题。
, 百拇医药
1 材料、方法和结果
用1段长50 mm、内径1 mm的硅橡胶管弯成U字形，U形底部插入一长5 mm、内径50 μm的细管，粘接制成1个Y形管。将其固定在宽40 mm、长10 mm的有机玻璃板上，以20°角斜向固定在灌流前缓冲槽边。U字形管的一端接长400 mm、内径3 mm的硅胶管，将其插入灌流液瓶中。实验前，硅胶管用一小夹子夹闭。U形管的另一端接一始终保持一定负压的300 mL广口瓶，瓶口塞一橡胶塞，由塞再引出1管，通过1个一般情况下关闭的三通开关，接一20 mL注射器。正常灌流液、含Glu及含GABA溶液瓶并排放在高于灌流槽约350 mm的小架子上。
灌注开始时，松开小夹子，打开三通，抽动注射器，待正常灌流液流至U形管底部时，关闭三通。此后，溶液即可靠吸力按预定速度流出。灌流速度与Y形管管径及放置溶液瓶架的高度有关。需要置换其他溶液时，只需将硅胶管移入欲置换之溶液瓶内，其他步骤同前。 用带有不同颜色的液体进行交替置换，溶液实现完全置换的时间为20 s。用手术显微镜观察，进行溶液置换时，未见液面波动。
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实验选取雌雄兼有的蟾蜍，按文献[3]介绍方法切除椎板，分离第9或第10对脊神经节(DRG)及与之相连的背根(Dr)和坐骨神经(Sc)，将其固定于0.5 mL的灌流槽底部的硅胶板上，进行表面灌注。在体视显微镜下，剥去DRG周围的结缔组织，实验进行中分别用正常溶液和含Glu或含GABA的溶液进行交替灌注。正常溶液的成分为(mmol/L)：NaCl 114，KCl 2，CaCl2 2，Tris 10，葡萄糖 5.6；含Glu和含GABA溶液中Glu、GABA浓度分别为(mol/L)：Glu 1×10-4 ， GABA 1×10-3，溶液的pH均为7.2～7.4，均以100%O2饱和，灌流速度均为1～3 mL/min。
刺激电极为铂金丝(直径0.3 mm)和细玻璃管(直径:Sc 1.2 mm, Dr 1.0 mm) 制成的双极吸引电极，细玻璃管的一端拉制成锥体形状；另一端通过一细硅胶管接注射器为吸神经干用，玻璃管内外各固定一铂金丝制成刺激电极的2极。实验时抽动注射器将与脊神经节相连的Dr或Sc断端吸入细玻璃管内，并使其与玻璃管内的阴极接触。Dr和Sc上的刺激电极与脊神经节中点间的距离约为10～15 mm。刺激电极经隔离器与刺激器相接。记录电极为充3 mol/L KCl的玻璃微电极，尖端直径小于1 μm,阻抗为40～60 MΩ。记录电极经微电极放大器与VC-6记忆示波器和X-Y记录仪相接。
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用步进式微电极推进器，将记录电极由脊神经节表面，以1 μm/步的步幅向下推进，最深深度为脊神经节表面下100 μm。推进过程中，用记忆示波器和微电极放大器对膜电位水平进行图像和数字监视。一矣微电极刺入细胞内，膜电位水平降至-50 mV或更负，即以约高于Dr 2倍阈强度的0.3 ms方波电脉冲，交替刺激Dr和Sc，记录动作电位。所诱发的细胞内动作电位，由记忆示波器显示，经X-Y记录仪描记。
实验在室温与灌流液温度为18～20 ℃条件下进行。实验开始时，先用正常溶液进行灌注，以此作为前对照。所记录的细胞内动作电位，在1～500 Hz频率范围内测定其频率跟随能力。随后，用溶液快速置换装置进行溶液置换，即换用含Glu或含GABA溶液进行灌注，也测定其频率跟随能力，与前对照进行比较，记录变化情况。此后，再换回正常溶液进行灌注，作为后对照。结果显示，前、后对照波形基本相同。整个实验过程一般需要20～60 min。在此期间，记录没有因溶液置换而受到影响。含Glu或含GABA溶液灌注时动作电位的变化为药物对其影响所致(图1)。
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图1 正常与含Glu或含GABA溶液灌注对DRG神经元动作电位的影响
校正：10 ms, 20 mV
2 讨论
在离体制备上进行细胞内记录，在技术方面要求较高。当微电极插入细胞内，稳定地做完预定的步骤已属不易，而想在记录过程中加入药液或置换溶液，采用以往的方法，常因换液时间长、液面波动、压力注药易造成灌流槽内药物浓度不均、温差等问题，影响了实验的进行和实验结果。离体溶液快速置换法无疑解决了这些难点。它具有装置制作简单、实用、性能稳定，可以在短时间内实现溶液的完全置换或药物的加入，可精确地控制灌流液的成分和浓度，还可实现多次置换等优点。由于将Y形管放在灌流前缓冲槽中，溶液经过小孔再平缓进入灌流槽，因此置换时不易引起液面波动，从而保证了实验的稳定性。
Glu和GABA是中枢和外周神经系统均含有的兴奋性和抑制性神经递质，脊神经节内也含有相应的受体[4]。Glu与非NMDA受体及NMDA受体结合，使Na+和Ca2+内流，对神经元产生去极化作用和兴奋作用[5]。故外加适宜剂量的Glu后，使诱发的动作电位振幅增高以及对重复刺激的跟随能力增强。GABA作为抑制性神经递质，与GABAA受体结合，直接开放Cl-通道，引起Cl-内流，使膜电位稳定，导致超极化；与GABAB受体结合，导致K+外流(超极)和Ca2+内流(去极)[6]。本工作的结果提示人工施加外源性GABA后，DRG神经元细胞内动作电位振幅降低及频率跟随能力的改变，这可能与GABA和突触后膜上的2种受体相互作用有关。这些结果与Murase等人的工作在理论上是一致的[1，2]。
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离体灌注溶液快速置换法的建立，不仅为离体脊神经节、海马脑片等离体制备及膜片钳实验时的溶液置换及加入药物，提供了一个快速、便利、稳定的技术手段。而且，它也适用于其他离体制备实验的加药及溶液置换过程。
参考文献
1.Takashi Nakagawa, Shizuo Komune, Takuya Uemura, et al. Excitatory amino acid response in isolated spiral ganglion cells of guinea pig cochlea. J Neurophysiol, 1991,65(3):715～723
2.吕国蔚,高翠英.蟾蜍脊神经节神经元对外周重复刺激的反应.生理学报,1991,43(3):220～226
3.吕国蔚,高翠英.蟾蜍离体脊神经节神经元对其外周突与中枢突重复刺激的反应.生理学报,1993,45(1):8～14
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4.Yamada K A, Dubinsky J M, Rothman S M. Quantitative physiological characterization of a quinoxalinedione non-NMDA receptor antagonist. J Neurosci,1989,9:3230～3236
5.黄诒森,卢步峰.氨基酸递质.见:王尧,杜子威主编.神经生物化学与分子生物学.北京:人民卫生出版社,1997.200～203
6.Shepherd G M. Neurobiology. 2nd ed. New York/Oxford: Oxford Univ Press, 1988.161～162
收稿日期:1998-12-29
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单位：首都医科大学神经生物学研究室
关键词：
首都医科大学学报/990321 应用离体制备进行科学研究，是神经生理学、药理学等学科中常用的方法之一。药物的加入及溶液的置换是离体实验的一个重要环节。原有的置换方法一般存在置换时间偏长(几分钟或更长)，直接向灌注槽内压力注药易造成浓度不均及液面波动，从而影响实验结果等不足。这些不足，在细胞内记录中显得尤为突出。国外在膜片钳技术中采用了药物快速供给方法并取得满意实验结果[1] 。但国内尚未见到有关报道。
根据细胞内记录的特点，在已建立的离体制备细胞内记录技术的基础上[2]，我们在实验中制作了一种溶液快速置换装置，并以蟾蜍离体脊神经节为标本，记录细胞内动作电位，观察正常溶液和含谷氨酸(Glu)或含γ-氨基丁酸(GABA)溶液交替灌注时，实现溶液完全置换所需时间以及对记录的影响，取得了较好的实验结果，建立了离体灌注快速置换法，从而解决了离体灌注溶液的置换及加药问题。
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1 材料、方法和结果
用1段长50 mm、内径1 mm的硅橡胶管弯成U字形，U形底部插入一长5 mm、内径50 μm的细管，粘接制成1个Y形管。将其固定在宽40 mm、长10 mm的有机玻璃板上，以20°角斜向固定在灌流前缓冲槽边。U字形管的一端接长400 mm、内径3 mm的硅胶管，将其插入灌流液瓶中。实验前，硅胶管用一小夹子夹闭。U形管的另一端接一始终保持一定负压的300 mL广口瓶，瓶口塞一橡胶塞，由塞再引出1管，通过1个一般情况下关闭的三通开关，接一20 mL注射器。正常灌流液、含Glu及含GABA溶液瓶并排放在高于灌流槽约350 mm的小架子上。
灌注开始时，松开小夹子，打开三通，抽动注射器，待正常灌流液流至U形管底部时，关闭三通。此后，溶液即可靠吸力按预定速度流出。灌流速度与Y形管管径及放置溶液瓶架的高度有关。需要置换其他溶液时，只需将硅胶管移入欲置换之溶液瓶内，其他步骤同前。 用带有不同颜色的液体进行交替置换，溶液实现完全置换的时间为20 s。用手术显微镜观察，进行溶液置换时，未见液面波动。
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实验选取雌雄兼有的蟾蜍，按文献[3]介绍方法切除椎板，分离第9或第10对脊神经节(DRG)及与之相连的背根(Dr)和坐骨神经(Sc)，将其固定于0.5 mL的灌流槽底部的硅胶板上，进行表面灌注。在体视显微镜下，剥去DRG周围的结缔组织，实验进行中分别用正常溶液和含Glu或含GABA的溶液进行交替灌注。正常溶液的成分为(mmol/L)：NaCl 114，KCl 2，CaCl2 2，Tris 10，葡萄糖 5.6；含Glu和含GABA溶液中Glu、GABA浓度分别为(mol/L)：Glu 1×10-4 ， GABA 1×10-3，溶液的pH均为7.2～7.4，均以100%O2饱和，灌流速度均为1～3 mL/min。
刺激电极为铂金丝(直径0.3 mm)和细玻璃管(直径:Sc 1.2 mm, Dr 1.0 mm) 制成的双极吸引电极，细玻璃管的一端拉制成锥体形状；另一端通过一细硅胶管接注射器为吸神经干用，玻璃管内外各固定一铂金丝制成刺激电极的2极。实验时抽动注射器将与脊神经节相连的Dr或Sc断端吸入细玻璃管内，并使其与玻璃管内的阴极接触。Dr和Sc上的刺激电极与脊神经节中点间的距离约为10～15 mm。刺激电极经隔离器与刺激器相接。记录电极为充3 mol/L KCl的玻璃微电极，尖端直径小于1 μm,阻抗为40～60 MΩ。记录电极经微电极放大器与VC-6记忆示波器和X-Y记录仪相接。
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用步进式微电极推进器，将记录电极由脊神经节表面，以1 μm/步的步幅向下推进，最深深度为脊神经节表面下100 μm。推进过程中，用记忆示波器和微电极放大器对膜电位水平进行图像和数字监视。一矣微电极刺入细胞内，膜电位水平降至-50 mV或更负，即以约高于Dr 2倍阈强度的0.3 ms方波电脉冲，交替刺激Dr和Sc，记录动作电位。所诱发的细胞内动作电位，由记忆示波器显示，经X-Y记录仪描记。
实验在室温与灌流液温度为18～20 ℃条件下进行。实验开始时，先用正常溶液进行灌注，以此作为前对照。所记录的细胞内动作电位，在1～500 Hz频率范围内测定其频率跟随能力。随后，用溶液快速置换装置进行溶液置换，即换用含Glu或含GABA溶液进行灌注，也测定其频率跟随能力，与前对照进行比较，记录变化情况。此后，再换回正常溶液进行灌注，作为后对照。结果显示，前、后对照波形基本相同。整个实验过程一般需要20～60 min。在此期间，记录没有因溶液置换而受到影响。含Glu或含GABA溶液灌注时动作电位的变化为药物对其影响所致(图1)。
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图1 正常与含Glu或含GABA溶液灌注对DRG神经元动作电位的影响
校正：10 ms, 20 mV
2 讨论
在离体制备上进行细胞内记录，在技术方面要求较高。当微电极插入细胞内，稳定地做完预定的步骤已属不易，而想在记录过程中加入药液或置换溶液，采用以往的方法，常因换液时间长、液面波动、压力注药易造成灌流槽内药物浓度不均、温差等问题，影响了实验的进行和实验结果。离体溶液快速置换法无疑解决了这些难点。它具有装置制作简单、实用、性能稳定，可以在短时间内实现溶液的完全置换或药物的加入，可精确地控制灌流液的成分和浓度，还可实现多次置换等优点。由于将Y形管放在灌流前缓冲槽中，溶液经过小孔再平缓进入灌流槽，因此置换时不易引起液面波动，从而保证了实验的稳定性。
Glu和GABA是中枢和外周神经系统均含有的兴奋性和抑制性神经递质，脊神经节内也含有相应的受体[4]。Glu与非NMDA受体及NMDA受体结合，使Na+和Ca2+内流，对神经元产生去极化作用和兴奋作用[5]。故外加适宜剂量的Glu后，使诱发的动作电位振幅增高以及对重复刺激的跟随能力增强。GABA作为抑制性神经递质，与GABAA受体结合，直接开放Cl-通道，引起Cl-内流，使膜电位稳定，导致超极化；与GABAB受体结合，导致K+外流(超极)和Ca2+内流(去极)[6]。本工作的结果提示人工施加外源性GABA后，DRG神经元细胞内动作电位振幅降低及频率跟随能力的改变，这可能与GABA和突触后膜上的2种受体相互作用有关。这些结果与Murase等人的工作在理论上是一致的[1，2]。
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离体灌注溶液快速置换法的建立，不仅为离体脊神经节、海马脑片等离体制备及膜片钳实验时的溶液置换及加入药物，提供了一个快速、便利、稳定的技术手段。而且，它也适用于其他离体制备实验的加药及溶液置换过程。
参考文献
1.Takashi Nakagawa, Shizuo Komune, Takuya Uemura, et al. Excitatory amino acid response in isolated spiral ganglion cells of guinea pig cochlea. J Neurophysiol, 1991,65(3):715～723
2.吕国蔚,高翠英.蟾蜍脊神经节神经元对外周重复刺激的反应.生理学报,1991,43(3):220～226
3.吕国蔚,高翠英.蟾蜍离体脊神经节神经元对其外周突与中枢突重复刺激的反应.生理学报,1993,45(1):8～14
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4.Yamada K A, Dubinsky J M, Rothman S M. Quantitative physiological characterization of a quinoxalinedione non-NMDA receptor antagonist. J Neurosci,1989,9:3230～3236
5.黄诒森,卢步峰.氨基酸递质.见:王尧,杜子威主编.神经生物化学与分子生物学.北京:人民卫生出版社,1997.200～203
6.Shepherd G M. Neurobiology. 2nd ed. New York/Oxford: Oxford Univ Press, 1988.161～162
收稿日期:1998-12-29
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