中国东北汉族人群变应性鼻炎患者HLA-DRB1基因多态性分析
作者：杨玲 张庆瑞 张平 叶晶 尹璐
单位：杨玲、张平、叶晶 沈阳 解放军第二零二医院变态反应室 110003，张庆瑞、尹璐 皮肤科
关键词：鼻炎；变应性；常年性；基因；MHC；II类；聚合酶链反应
中华耳鼻咽喉科杂志990306 【摘要】 目的 分析中国东北地区汉族人变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者与HLA(human leukocyte A system)-DRB1等位基因的关联。方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术对35例东北汉族变应性鼻炎患者的HLA-DRB1等位基因进行检测，对照组为同地区94例健康者。结果 统计学分析结果显示患者组HLA-DRB1*0101.2和*0302等位基因比正常对照组明显增高，基因频率分别为12.86%(相对危险性为15.92，校正P值<0.0004)和5.71%(相对危险性为12.00，校正P值<0.05)，其它等位基因频率在实验组和对照组之间差异无显著性。结论 提示HLA-DRB1*0101.2和DRB1*0302等位基因与AR关联。
, 百拇医药
Analysis of HLA-DRB1 allele polymorphism for patients with allergic rhinitis
YANG Ling, ZHANG Qingrui, ZHANG Ping, et al. Department of Otorhinolaryngology, The 202th Hospital of PLA. Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To analyze the association between allergic rhinitis and HLA-DRB1 in northeast area of China. Methods Using polymerase chain reaction /sequence specific primers (PCR/SSP) technique, we studied distributive speciality of HLA-DRB1 alleles in 35 patients with (AR) and 94 healthy controls. Results The statistical results showed that the frequencies of DRB1*0101.2 and DRB1*0302 alleles were significantly higher in AR patients than in those of controls. The frequencies of DRB1*0101,2 and DRB1*0302 were 12.86% (relative risk=15.92 Pc<0.0004) and 5.71% (relative risk=12.00,Pc<0.05) respectively, the other gene frequencies bore no significant difference. Conclusion AR was associated with HLA-DRB1*0101.2 and DRB1*0302 alleles.
, http://www.100md.com
【Key words】 Rhinitis,allergic,perennial Gene,MHC class II Polymerase chain reaction
变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)属Ⅰ型变应性疾病，该病具有遗传倾向。但遗传因素在其发病机制中的作用尚未彻底阐明，调查群体中某种特定遗传标记的频率，是研究某种疾病遗传背景的主要方法之一。人类主要组织相容性系统(human leukocyte A system, HLA)复合体是具有高度多态性的基因系统，控制机体的免疫应答基因(immune response gene，Ir基因)也位于HLA复合体内。通过研究AR患者中HLA-DRB1等位基因的分布情况，可为从基因水平研究遗传因素在AR发病机制中的作用和探寻疾病易感基因提供参考。
材料与方法 一、研究对象
, http://www.100md.com 患者组选择我院门诊AR患者35例，诊断符合变应性鼻炎诊断和疗效评定标准[1]，蒿属花粉变应原皮肤试验及血清特异性IgE检测(ELISA法)结果均呈阳性反应。其中男17例，女18例，年龄21～53岁(平均36.8岁)。对照组94例同地区健康者，男45例，女49例；年龄20～55岁，平均38岁。2组受试者均为东北地区汉族人，属无血缘关系的随机抽样个体。
二、实验方法
按改进的盐析法从外周血淋巴细胞提取基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA含量及纯度。HLA-DRB1等位基因特异性引物购于德国Essen大学。针对DRB1第二外显子多态性设计序列特异性引物(sequence specific primers,SSP)，其所扩增的产物具有等位基因特异性，分型结果和血清学方法测得的HLA-DR表型具有对应关系。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction , PCR)-SSP技术的方法：SSP只能与某一等位基因特异性片断的碱基序列互补性结合，从而通过PCR反应特异性地扩增该基因片断。每一PCR反应管中含有待测基因组DNA 30～60 ng，Taq(thermus aquaticus)酶0.5 μg，dNTP (dATP，dGTP，dCTP，dTTP)各200 μmol/L，SSP 2 pmol/L。PCR反应参数如下：预变性94℃，5 min；变性94℃，30 s；退火65℃，1 min；延伸72℃，1 min，共30个循环。PCR扩增产物加样至含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中，电泳20 min，经紫外透射下泳道中见明显DNA条带为阳性[2]。
, 百拇医药
三、统计处理
AR组与对照组之间逐个进行等位基因比较，以相对危险性(relative risk,RR)表示HLA与AR关联的程度。
采用四格表法进行卡方检验，对χ2>3.84者按Fisher法计算确切P值，并计算校正P值(Pc)，Pc值等于P值乘以实验系统所比较的基因数。
结果 AR患者组与对照组HLA-DRB1等位基因频率分布见表1。AR患者组HLA-DRB1*0101.2比对照组明显增高，P值经校正后差异仍有显著性意义(Pc<0.0004)，等位基因频率为12.86%(RR=15.92)；AR患者组HLA-DRB1*0302比对照组明显增高，P值经校正后仍有意义(Pc<0.05),其等位基因频率为5.71%(RR=12.00)。其它HLA-DRB1等位基因频率在AR患者组和对照组之间差异无显著性意义。
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表1 患者组与对照组HLA-DRB1基因频率比较 HLA-DRB1等位基因
血清学
表 型
患者组(n=35)
对照组(n=94)
χ2
P值
Pc值
RR
阳性例次(频率)
基因频率
阳性例次(频率)
, 百拇医药
基因频率
0101.2
(1)
9(25.71)
12.86
2(2.12)
1.06
18.659
<0.00002
<0.0004
15.92
0103
(1)
, 百拇医药
1(2.86)
1.43
0(0)
0
2.7
>0.05
>0.05
5.42
150x
(2)
12(32.29)
17.14
26(27.66)
, 百拇医药
13.83
1.001
>0.05
>0.05
1.36
160x
(2)
5(14.29)
7.14
6(6.38)
3.19
2.042
>0.05
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>0.05
2.44
0301
(3)
9(25.71)
12.86
12(12.77)
6.38
3.13
>0.05
>0.05
2.65
0302
, http://www.100md.com
(3)
4(11.43)
5.71
1(1.06)
0.53
7.354
<0.01
<0.05
12.00
040x
(4)
3(8.57)
4.29
, 百拇医药
7(7.45)
3.72
0.045
>0.05
>0.05
1.16
0701
(7)
3(8.57)
4.29
20(21.28)
10.64
2.81
, 百拇医药
>0.05
>0.05
0.35
0801
(8)
1(2.86)
1.43
2(2.13)
1.06
0.059
>0.05
>0.05
1.35
, 百拇医药
0901
(9)
5(14.29)
7.14
27(28.72)
14.36
2.850
>0.05
>0.05
0.41
1001
(10)
1(2.86)
, 百拇医药
1.43
5(5.32)
2.66
0.348
>0.05
>0.05
0.52
110x
(5)
1(2.86)
1.43
9(9.57)
4.79
, http://www.100md.com
1.609
>0.05
>0.05
0.28
120x
(5)
2(5.71)
2.86
19(20.21)
10.11
3.934
<0.05
>0.05
, http://www.100md.com
0.24
1301.2
(6)
1(2.86)
1.43
2(2.13)
1.06
0.064
>0.05
>0.05
1.35
1302.4
(6)
, http://www.100md.com
1(2.86)
1.43
11(11.70)
5.85
2.368
>0.05
>0.05
0.22
1305
(6)
0(0)
0
3(3.19)
, 百拇医药
1.59
1.144
>0.05
>0.05
0.64
1401.4.5.7.8
(6)
2(5.71)
2.86
8(8.51)
4.2
0.279
>0.05
, http://www.100md.com
>0.05
0.00
1402
(6)
0(0)
0
0(0)
0
0
>0.05
>0.05
2.64
1305-6
, 百拇医药
(6)
0(0)
0
0(0)
0
0
>0.05
>0.05
2.64
1410
(6)
1(2.86)
1.43
, http://www.100md.com
0(0)
0
2.593
>0.05
>0.05
5.42
讨论
AR的主要特征是发生于特应性(atopy)个体，而特应性在家族中的发病率高达50%。已证实特应性的发生受家族遗传背景的影响，故AR发病可能与个体的遗传特征有关。AR属Ⅰ型变应性疾病，介导该型超敏反应的主要为特异性IgE。本检测选择我国东北地区汉族人群35例蒿属花粉致敏的AR患者，进行HLA-DRB1基因多态性分析。结果表明，AR患者HLA-DRB1*0101.2和*0302等位基因频率较对照组明显增高，RR值分别为15.92(Pc<0.0004)和12.00(Pc<0.05)。
, 百拇医药
近年来，国外已有人对AR与HLA-DRB1基因的关联进行了研究，文献报道[3]，美国人群中抗豚草(Ambav)变应原IgE类抗体与HLA-DRB1*150x相关；抗保加利亚白桦变应原(Bet Ⅵ)IgE类抗体与DRB1*080x关联；抗日本雪杉变应原的IgE类抗体与DRB1*110x相关。
Sadanaga等[4]报道AR与某些HLA单倍型相关。本检测应用PCR/SSP技术，在DNA水平分析中国东北汉族人群35例AR患者的DRB1基因多态性分布，发现AR与HLA-DRB1*0101.2和DRB1*0302等位基因关联。本实验结果对AR的预防及流行病学研究提供了有意义的参考。
有关HLA与某些疾病(特别是自身免疫病)关联的机制尚不清楚。本实验结果并非表明HLA-DRB1*0101.2和*0302，或其它与AR关联的HLA基因即是AR的易感基因。但可以预期，随着在基因水平深入研究不同群体和家系中HLA与AR的关联，有可能揭示AR发病的遗传背景和分子机制，并有助于探寻AR的易感基因。
, 百拇医药
志谢 本研究得到同济医科大学免疫学教研室龚非力教授的指导和帮助参考文献
1 顾之燕.变应性鼻炎诊断和疗效评定标准.中华耳鼻咽喉科杂志,1991,26:134.
2 杨颖，熊平，魏承洪，等.HLA-DRB1等位基因与中国湘北汉族人SLE关联的研究.中华微生物学和免疫学杂志,1996,16:340-342.
3 石川哮.Ⅰ型あレルギの遗传要因,あレルギとHLA.あレルギ,1994,43:1295-1300.
4 Sadanaga Y, Uno M, Kitao Y,et al.Investigation of the genetic regulation in allergic rhinitis. Auris Nasus Larynx, 1990,17:23-32.
(收稿：1998-05-18 修回：1998-12-20), http://www.100md.com
单位：杨玲、张平、叶晶 沈阳 解放军第二零二医院变态反应室 110003，张庆瑞、尹璐 皮肤科
关键词：鼻炎；变应性；常年性；基因；MHC；II类；聚合酶链反应
中华耳鼻咽喉科杂志990306 【摘要】 目的 分析中国东北地区汉族人变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者与HLA(human leukocyte A system)-DRB1等位基因的关联。方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术对35例东北汉族变应性鼻炎患者的HLA-DRB1等位基因进行检测，对照组为同地区94例健康者。结果 统计学分析结果显示患者组HLA-DRB1*0101.2和*0302等位基因比正常对照组明显增高，基因频率分别为12.86%(相对危险性为15.92，校正P值<0.0004)和5.71%(相对危险性为12.00，校正P值<0.05)，其它等位基因频率在实验组和对照组之间差异无显著性。结论 提示HLA-DRB1*0101.2和DRB1*0302等位基因与AR关联。
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Analysis of HLA-DRB1 allele polymorphism for patients with allergic rhinitis
YANG Ling, ZHANG Qingrui, ZHANG Ping, et al. Department of Otorhinolaryngology, The 202th Hospital of PLA. Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To analyze the association between allergic rhinitis and HLA-DRB1 in northeast area of China. Methods Using polymerase chain reaction /sequence specific primers (PCR/SSP) technique, we studied distributive speciality of HLA-DRB1 alleles in 35 patients with (AR) and 94 healthy controls. Results The statistical results showed that the frequencies of DRB1*0101.2 and DRB1*0302 alleles were significantly higher in AR patients than in those of controls. The frequencies of DRB1*0101,2 and DRB1*0302 were 12.86% (relative risk=15.92 Pc<0.0004) and 5.71% (relative risk=12.00,Pc<0.05) respectively, the other gene frequencies bore no significant difference. Conclusion AR was associated with HLA-DRB1*0101.2 and DRB1*0302 alleles.
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【Key words】 Rhinitis,allergic,perennial Gene,MHC class II Polymerase chain reaction
变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)属Ⅰ型变应性疾病，该病具有遗传倾向。但遗传因素在其发病机制中的作用尚未彻底阐明，调查群体中某种特定遗传标记的频率，是研究某种疾病遗传背景的主要方法之一。人类主要组织相容性系统(human leukocyte A system, HLA)复合体是具有高度多态性的基因系统，控制机体的免疫应答基因(immune response gene，Ir基因)也位于HLA复合体内。通过研究AR患者中HLA-DRB1等位基因的分布情况，可为从基因水平研究遗传因素在AR发病机制中的作用和探寻疾病易感基因提供参考。
材料与方法 一、研究对象
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二、实验方法
按改进的盐析法从外周血淋巴细胞提取基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA含量及纯度。HLA-DRB1等位基因特异性引物购于德国Essen大学。针对DRB1第二外显子多态性设计序列特异性引物(sequence specific primers,SSP)，其所扩增的产物具有等位基因特异性，分型结果和血清学方法测得的HLA-DR表型具有对应关系。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction , PCR)-SSP技术的方法：SSP只能与某一等位基因特异性片断的碱基序列互补性结合，从而通过PCR反应特异性地扩增该基因片断。每一PCR反应管中含有待测基因组DNA 30～60 ng，Taq(thermus aquaticus)酶0.5 μg，dNTP (dATP，dGTP，dCTP，dTTP)各200 μmol/L，SSP 2 pmol/L。PCR反应参数如下：预变性94℃，5 min；变性94℃，30 s；退火65℃，1 min；延伸72℃，1 min，共30个循环。PCR扩增产物加样至含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中，电泳20 min，经紫外透射下泳道中见明显DNA条带为阳性[2]。
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三、统计处理
AR组与对照组之间逐个进行等位基因比较，以相对危险性(relative risk,RR)表示HLA与AR关联的程度。
采用四格表法进行卡方检验，对χ2>3.84者按Fisher法计算确切P值，并计算校正P值(Pc)，Pc值等于P值乘以实验系统所比较的基因数。
结果 AR患者组与对照组HLA-DRB1等位基因频率分布见表1。AR患者组HLA-DRB1*0101.2比对照组明显增高，P值经校正后差异仍有显著性意义(Pc<0.0004)，等位基因频率为12.86%(RR=15.92)；AR患者组HLA-DRB1*0302比对照组明显增高，P值经校正后仍有意义(Pc<0.05),其等位基因频率为5.71%(RR=12.00)。其它HLA-DRB1等位基因频率在AR患者组和对照组之间差异无显著性意义。
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表1 患者组与对照组HLA-DRB1基因频率比较 HLA-DRB1等位基因
血清学
表 型
患者组(n=35)
对照组(n=94)
χ2
P值
Pc值
RR
阳性例次(频率)
基因频率
阳性例次(频率)
, 百拇医药
基因频率
0101.2
(1)
9(25.71)
12.86
2(2.12)
1.06
18.659
<0.00002
<0.0004
15.92
0103
(1)
, 百拇医药
1(2.86)
1.43
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2.7
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>0.05
5.42
150x
(2)
12(32.29)
17.14
26(27.66)
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13.83
1.001
>0.05
>0.05
1.36
160x
(2)
5(14.29)
7.14
6(6.38)
3.19
2.042
>0.05
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>0.05
2.44
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(3)
9(25.71)
12.86
12(12.77)
6.38
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>0.05
>0.05
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1(2.86)
1.43
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2.593
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>0.05
5.42
讨论
AR的主要特征是发生于特应性(atopy)个体，而特应性在家族中的发病率高达50%。已证实特应性的发生受家族遗传背景的影响，故AR发病可能与个体的遗传特征有关。AR属Ⅰ型变应性疾病，介导该型超敏反应的主要为特异性IgE。本检测选择我国东北地区汉族人群35例蒿属花粉致敏的AR患者，进行HLA-DRB1基因多态性分析。结果表明，AR患者HLA-DRB1*0101.2和*0302等位基因频率较对照组明显增高，RR值分别为15.92(Pc<0.0004)和12.00(Pc<0.05)。
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近年来，国外已有人对AR与HLA-DRB1基因的关联进行了研究，文献报道[3]，美国人群中抗豚草(Ambav)变应原IgE类抗体与HLA-DRB1*150x相关；抗保加利亚白桦变应原(Bet Ⅵ)IgE类抗体与DRB1*080x关联；抗日本雪杉变应原的IgE类抗体与DRB1*110x相关。
Sadanaga等[4]报道AR与某些HLA单倍型相关。本检测应用PCR/SSP技术，在DNA水平分析中国东北汉族人群35例AR患者的DRB1基因多态性分布，发现AR与HLA-DRB1*0101.2和DRB1*0302等位基因关联。本实验结果对AR的预防及流行病学研究提供了有意义的参考。
有关HLA与某些疾病(特别是自身免疫病)关联的机制尚不清楚。本实验结果并非表明HLA-DRB1*0101.2和*0302，或其它与AR关联的HLA基因即是AR的易感基因。但可以预期，随着在基因水平深入研究不同群体和家系中HLA与AR的关联，有可能揭示AR发病的遗传背景和分子机制，并有助于探寻AR的易感基因。
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志谢 本研究得到同济医科大学免疫学教研室龚非力教授的指导和帮助参考文献
1 顾之燕.变应性鼻炎诊断和疗效评定标准.中华耳鼻咽喉科杂志,1991,26:134.
2 杨颖，熊平，魏承洪，等.HLA-DRB1等位基因与中国湘北汉族人SLE关联的研究.中华微生物学和免疫学杂志,1996,16:340-342.
3 石川哮.Ⅰ型あレルギの遗传要因,あレルギとHLA.あレルギ,1994,43:1295-1300.
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(收稿：1998-05-18 修回：1998-12-20), http://www.100md.com