高效毛细管电泳检测人精浆蛋白
作者：唐轶 张宁 郝冬梅 鲁海鸥 邱广斌
单位：解放军第202医院优生优育中心实验室，沈阳110003
关键词：毛细管区带电泳；精浆蛋白
高效毛细管电泳检测人精浆蛋白 摘要 用贝克曼公司的P/ACE 5000型毛细管电泳仪成功分离人精浆蛋白组份20余种，分析20例正常精浆和13例无精子精浆蛋白。结果：有4种蛋白组分差异显著(P<0.05)或差异非常显著(P≤0.01)，将毛细管电泳与醋纤膜电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳比较，前者具有高分辨率、快速、自动化程度高、样品用量少等特点。对无精子精液精浆蛋白分析，毛细管电泳提供了新的诊断技术。
高效毛细管电泳技术是近年发展起来的一种新型的分离分析技术，尤其对蛋白质和核酸的分析技术日趋成熟。我们用高效毛细管电泳技术分析人精浆蛋白，能分离出20余种组分，并且正常精液组和无精子症精液有4种组分有显著差异，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毛细管电泳仪 Beckman公司P/ACE 5000型。
1.1.2 石英毛细管(河北永年光导纤维厂出品)50 μm(id)×375 μm(od)，长度47 cm，有效长度40 cm。
1.1.3 运行缓冲液 终浓度为12.5 mmol/L四硼酸钠，1 mmol/L乳酸钙，0.7 mmol/L硫酸镁，1 mmol/L EDTA，pH 9.70，经0.22 μm滤膜过滤。
1.1.4 所有试剂均为分析纯试剂，水为MILLI-Q超纯水(密理博公司产品)。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 仪器工作参数 电压23 kV,电流24～26 μA,温度20℃，检测波长200 nm，气压进样5 s。
1.2.2 样品采集及制备 禁欲2～3天，手淫法采集的样品，置37℃水浴液化，液化后的精液分2份，一份按WHO标准进行常规检验，精子数在40×109/L以上，活动力在Ⅲ、Ⅳ级，活动率在40%以上，形态正常，无炎症，果糖阳性的分为一组称正常精液组。而在600 g下离心15 min弃上清，再镜检仍无精子的精液分为一组称无精子组。
1.2.3 样品制备 将另一份精液3 500 r/min离心15 min，取上清20 μl，加运行缓冲液380 μl，经0.45 μm滤膜过滤，制成1∶20待测样品。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献[1]操作并进行银染，用光密度仪扫描。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 缓冲体系的选择 在乳酸钙1 mmol/L条件下，改变运行缓冲液的pH值(9.23、9.30、9.40、9.50、9.60、9.70)，随着pH值增加，15号与16号峰得到分离，pH 9.70时达到最佳分离；在pH 9.70、0.1 mmol/L乳酸钙的硼砂缓冲液中，增加0.9 mmol/L硫酸镁以增加阳离子浓度，此时5号、6号与15、16号同时得到分离，但不稳定。因此增加EDTA以络合Ca2+、Mg2+离子，可以达到最佳分离。我们选择最佳缓冲液体系是四硼酸钠12.5 mmol/L、乳酸钙1 mmol/L、硫酸镁0.7 mmol/L、EDTA 1 mmol/L的混合液。
2.2 毛细管长度对实验的影响 在同一缓冲体系下，改变毛细管的长度(27 cm、37 cm、47 cm、57 cm)，随着毛细管增长，迁移时间增加，而在27 cm、37 cm时，分离不完全，57 cm时迁移时间达18 min，因此选用47 cm。
, 百拇医药
2.3 临床应用 测定20例正常精浆和13例无精子精浆，在精浆的毛细管电泳图谱中有20余种蛋白成分(见图1-1，1-2)，对所有组分进行峰面积相对百分比统计学分析，发现有2种蛋白组分(10、14号)差异显著，2种(13、16号)差异非常显著(见表1)。
2.4 正常精浆和无精子精浆毛细管电泳图谱与醋纤膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱比较(见图1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3) 醋纤膜电泳分离的精浆蛋白顺序与毛细管电泳图正好相反。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离精浆蛋白为7～8条带。出峰顺序按分子量大小排列，从左至右分子量逐渐增大。低分子量蛋白标准为1.44、2.90、4.50、6.60、13.20(万)。
表1 用毛细管电泳测定正常精浆和无精子精浆峰面积相对百分比(
±s)
, 百拇医药
峰号
正常精液组
(n=20)
无精子精液组
(n=13)
t
1
2
3
4
5
5-1
6
, http://www.100md.com 7
7-1
8
9
9-1
10
11
12
12-1
12-2
13
14
15
16
, 百拇医药
17
2.708±1.220
1.900±1.138
1.634±0.996
1.696±1.360
3.620±1.840
0.394±0.413
4.532±1.797
1.816±1.060
0.323±0.576
3.361±1.471
, 百拇医药
1.584±1.707
0.628±0.678
11.770±4.200
3.350±1.839
1.653±0.942
0.678±0.629
1.086±1.135
5.328±1.826
16.53±5.230
0.672±0.685
31.800±3.980
, http://www.100md.com
2.087±1.070
2.640±0.970
2.070±1.350
1.595±0.998
1.422±1.422
4.140±2.100
0.359±0.445
3.789±2.180
2.135±1.567
0.387±0.515
2.779±1.360
, 百拇医药
1.248±1.630
0.763±1.380
8.420±4.300
3.129±1.010
1.159±0.789
0.568±0.786
0.569±0.567
7.190±1.910
23.520±6.340
0.922±1.520
28.106±3.440
, http://www.100md.com
2.108±1.090
0.17
0.39
0.11
0.56
1.31
0.23
1.05
0.69
0.27
1.17
0.56
0.38
, 百拇医药
2.06*
0.67
1.54
0.44
1.52
2.82**
2.71*
0.64
2.75**
1.07
注：*P<0.05，**P≤0.01
, http://www.100md.com 3 讨论
3.1 精浆中的蛋白成分主要来自前列腺、附睾、精囊等性腺分泌的混合物。其中蛋白质中的获能因子影响精子生成与生存。因此精浆蛋白对精子的生成及生殖功能有重要影响。测定精浆蛋白可以评价附性腺的病变。本文发现，无精子精浆的第14、13号峰面积相对百分比高于正常精浆的峰面积相对百分比，而正常精浆第10、16号峰面积相对百分比高于无精子精浆。由于精浆蛋白与抗体、激素和某些酶有关，精浆蛋白的量和组成上在一定程度也反映了机体的免疫功能，某些蛋白含量高或低，直接影响精子的生成，干扰精子的获能[2]。
3.2 醋纤膜电泳分离带模糊且界限不清，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的区带少于毛细管电泳，由于目前尚无精浆蛋白标准品，但根据聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量标准可以确定白蛋白峰，其峰面积值在电泳图中为最高(图中带A字)，同时在同一条件下测定人血清蛋白毛细管电泳图谱[3]进行比较确认精浆毛细管电泳中的第16号峰为白蛋白峰，第13、14号峰可能位于α蛋白区域，第10号峰可能位于β蛋白区域，究竟是何种组分还有待于进一步鉴定。
, 百拇医药
1-1 毛细管电泳
1-2 醋纤膜电泳 1-3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
图1 正常精浆蛋白的电泳扫描图
2-1 毛细管电泳
, http://www.100md.com
2-2 醋纤膜电泳 2-3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
图2 无精子精浆蛋白的电泳扫描图
参考文献
[1]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.77～79
[2]张秀成著.精子检测与分离.北京：北京科学技术出版社，1993.43～59
[3]张宁，等.毛细管电泳测定人血清蛋白方法研究.沈阳医学杂志，1998，18(4)：1
(1998-08-03收稿，1998-11-04修回), http://www.100md.com
单位：解放军第202医院优生优育中心实验室，沈阳110003
关键词：毛细管区带电泳；精浆蛋白
高效毛细管电泳检测人精浆蛋白 摘要 用贝克曼公司的P/ACE 5000型毛细管电泳仪成功分离人精浆蛋白组份20余种，分析20例正常精浆和13例无精子精浆蛋白。结果：有4种蛋白组分差异显著(P<0.05)或差异非常显著(P≤0.01)，将毛细管电泳与醋纤膜电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳比较，前者具有高分辨率、快速、自动化程度高、样品用量少等特点。对无精子精液精浆蛋白分析，毛细管电泳提供了新的诊断技术。
高效毛细管电泳技术是近年发展起来的一种新型的分离分析技术，尤其对蛋白质和核酸的分析技术日趋成熟。我们用高效毛细管电泳技术分析人精浆蛋白，能分离出20余种组分，并且正常精液组和无精子症精液有4种组分有显著差异，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毛细管电泳仪 Beckman公司P/ACE 5000型。
1.1.2 石英毛细管(河北永年光导纤维厂出品)50 μm(id)×375 μm(od)，长度47 cm，有效长度40 cm。
1.1.3 运行缓冲液 终浓度为12.5 mmol/L四硼酸钠，1 mmol/L乳酸钙，0.7 mmol/L硫酸镁，1 mmol/L EDTA，pH 9.70，经0.22 μm滤膜过滤。
1.1.4 所有试剂均为分析纯试剂，水为MILLI-Q超纯水(密理博公司产品)。
1.2 方法
, 百拇医药 1.2.1 仪器工作参数 电压23 kV,电流24～26 μA,温度20℃，检测波长200 nm，气压进样5 s。
1.2.2 样品采集及制备 禁欲2～3天，手淫法采集的样品，置37℃水浴液化，液化后的精液分2份，一份按WHO标准进行常规检验，精子数在40×109/L以上，活动力在Ⅲ、Ⅳ级，活动率在40%以上，形态正常，无炎症，果糖阳性的分为一组称正常精液组。而在600 g下离心15 min弃上清，再镜检仍无精子的精液分为一组称无精子组。
1.2.3 样品制备 将另一份精液3 500 r/min离心15 min，取上清20 μl，加运行缓冲液380 μl，经0.45 μm滤膜过滤，制成1∶20待测样品。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献[1]操作并进行银染，用光密度仪扫描。
, http://www.100md.com 2 结果
2.1 缓冲体系的选择 在乳酸钙1 mmol/L条件下，改变运行缓冲液的pH值(9.23、9.30、9.40、9.50、9.60、9.70)，随着pH值增加，15号与16号峰得到分离，pH 9.70时达到最佳分离；在pH 9.70、0.1 mmol/L乳酸钙的硼砂缓冲液中，增加0.9 mmol/L硫酸镁以增加阳离子浓度，此时5号、6号与15、16号同时得到分离，但不稳定。因此增加EDTA以络合Ca2+、Mg2+离子，可以达到最佳分离。我们选择最佳缓冲液体系是四硼酸钠12.5 mmol/L、乳酸钙1 mmol/L、硫酸镁0.7 mmol/L、EDTA 1 mmol/L的混合液。
2.2 毛细管长度对实验的影响 在同一缓冲体系下，改变毛细管的长度(27 cm、37 cm、47 cm、57 cm)，随着毛细管增长，迁移时间增加，而在27 cm、37 cm时，分离不完全，57 cm时迁移时间达18 min，因此选用47 cm。
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2.3 临床应用 测定20例正常精浆和13例无精子精浆，在精浆的毛细管电泳图谱中有20余种蛋白成分(见图1-1，1-2)，对所有组分进行峰面积相对百分比统计学分析，发现有2种蛋白组分(10、14号)差异显著，2种(13、16号)差异非常显著(见表1)。
2.4 正常精浆和无精子精浆毛细管电泳图谱与醋纤膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱比较(见图1-1、1-2、1-3、2-1、2-2、2-3) 醋纤膜电泳分离的精浆蛋白顺序与毛细管电泳图正好相反。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离精浆蛋白为7～8条带。出峰顺序按分子量大小排列，从左至右分子量逐渐增大。低分子量蛋白标准为1.44、2.90、4.50、6.60、13.20(万)。
表1 用毛细管电泳测定正常精浆和无精子精浆峰面积相对百分比(
±s), 百拇医药
峰号
正常精液组
(n=20)
无精子精液组
(n=13)
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2.708±1.220
1.900±1.138
1.634±0.996
1.696±1.360
3.620±1.840
0.394±0.413
4.532±1.797
1.816±1.060
0.323±0.576
3.361±1.471
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1.584±1.707
0.628±0.678
11.770±4.200
3.350±1.839
1.653±0.942
0.678±0.629
1.086±1.135
5.328±1.826
16.53±5.230
0.672±0.685
31.800±3.980
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2.087±1.070
2.640±0.970
2.070±1.350
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1.422±1.422
4.140±2.100
0.359±0.445
3.789±2.180
2.135±1.567
0.387±0.515
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1.248±1.630
0.763±1.380
8.420±4.300
3.129±1.010
1.159±0.789
0.568±0.786
0.569±0.567
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28.106±3.440
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注：*P<0.05，**P≤0.01
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3.1 精浆中的蛋白成分主要来自前列腺、附睾、精囊等性腺分泌的混合物。其中蛋白质中的获能因子影响精子生成与生存。因此精浆蛋白对精子的生成及生殖功能有重要影响。测定精浆蛋白可以评价附性腺的病变。本文发现，无精子精浆的第14、13号峰面积相对百分比高于正常精浆的峰面积相对百分比，而正常精浆第10、16号峰面积相对百分比高于无精子精浆。由于精浆蛋白与抗体、激素和某些酶有关，精浆蛋白的量和组成上在一定程度也反映了机体的免疫功能，某些蛋白含量高或低，直接影响精子的生成，干扰精子的获能[2]。
3.2 醋纤膜电泳分离带模糊且界限不清，而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的区带少于毛细管电泳，由于目前尚无精浆蛋白标准品，但根据聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量标准可以确定白蛋白峰，其峰面积值在电泳图中为最高(图中带A字)，同时在同一条件下测定人血清蛋白毛细管电泳图谱[3]进行比较确认精浆毛细管电泳中的第16号峰为白蛋白峰，第13、14号峰可能位于α蛋白区域，第10号峰可能位于β蛋白区域，究竟是何种组分还有待于进一步鉴定。
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1-1 毛细管电泳
1-2 醋纤膜电泳 1-3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
图1 正常精浆蛋白的电泳扫描图
2-1 毛细管电泳
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2-2 醋纤膜电泳 2-3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
图2 无精子精浆蛋白的电泳扫描图
参考文献
[1]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.77～79
[2]张秀成著.精子检测与分离.北京：北京科学技术出版社，1993.43～59
[3]张宁，等.毛细管电泳测定人血清蛋白方法研究.沈阳医学杂志，1998，18(4)：1
(1998-08-03收稿，1998-11-04修回), http://www.100md.com