人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序
作者：潘海燕 王珏 田竟生 陈德高 徐群渊 戴晓玲
单位：首都医科大学北京神经科学研究所
关键词：hGDNF；神经生长因子；基因克隆
首都医科大学学报990403 提要： 为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)在神经系统疾病中的作用，根据GDNF的cDNA序列设计并合成引物，以流产胎儿脑组织为来源，分别提取RNA和基因组DNA作模板，经RT-PCR和PCR技术扩增人GDNF基因片段，采用DNA重组技术将其克隆于pGEM-T Easy载体中并测序。结果：RNA和基因组DNA体外扩增得到的片段均是410 bp，两者无差异。PGEM-GDNF经酶切鉴定正确，测序结果与Genebank比较基本相同。由于RNA和基因组DNA扩增得到的片段大小相同，证实该基因片段内无内含子插入，该片段可用于真核及原核表达。
, 百拇医药
中图分类号： Q784
Cloning and Sequencing the Gene of Human Glial Cell Line-derived Neurotropic Factor
Pan Haiyan, Wang Jue, Tian Jingsheng, Chen Degao, Xu Qunyuan, Dai Xiaoling
Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences
Abstract：To clone the gene of human glial cell line-derived neurotropic factor for researching its effects in the nervous system diseases PCR primers were synthesized based on the hGDNF cDNA sequence, RT-PCR and PCR were performed respectively on RNA and genomic DNA extracted from fetal brain. The PCR fragment was subcloned into pGEM-T easy vector and then was confirmed by DNA sequencing. Results: The length of the two DNA fragments amplified by RNA and genomic DNA was both 410 bp. There was no difference between them. Restriction digests were analyzed to determine insert orientation. the fragment DNA sequences were homology with corresponding sequences published in Genebank. Conclusion: The hGDNF fragment has no intron because RT-PCR and PCR amplifications are the same size, this fragment can be used in eukaryotic and prokaryotic gene expression.
, 百拇医药
Key words：human GDNF; neurotropic factor; gene clone
帕金森病(Parkinson disease, PD)是以中脑黑质的多巴胺能神经元进行性退变为主要特征的神经系统疾病。以补充多巴胺的前体左旋多巴(levodopa)为主的药物治疗在一定程度上控制症状，但不能阻止神经元的继续变性、死亡的趋势[1]。近年来发现的一系列神经营养因子如脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)[2]，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)[3]及胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)等能特异性防止多巴胺能神经元的变性，并能提高残存多巴胺神经元的功能活性。本研究拟以PCR技术从流产胎儿脑组织中扩增GDNF基因片段，并对扩增的cDNA片段进行分析，从而探讨体内、体外实验中GDNF对神经性疾病治疗中的可能性。
, 百拇医药
1 对象和方法
标本为4月龄流产胎儿脑组织。
引物序列：引物1：
5′端
引物2：
5′端由美国Cybersn公司合成，并在引物外侧端加上酶切位点(5′ NdeⅠ，3′ BamHⅠ)，PCR扩增片段长度为410 bp左右。
基因组DNA的提取：将胎脑组织捣碎，加入10倍体积的抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0,20 mg/L胰RNA酶，0.5% SDS)，37 ℃温育1 h，加入蛋白酶K(Merck E公司)至终质量浓度为100 mg/L，50 ℃水溶3 h，待冷却至室温后，用酚抽提3次，将水相移至一洁净管中，加入0.2体积的乙酸铵和2倍体积的乙醇沉淀DNA，以70%乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后用TE(pH 8.0)溶解。
, 百拇医药
mRNA的提取及cDNA的合成：用PolyATtract Series 9600 TM mRNA分离及cDNA合成试剂盒(Promega公司)提取胎脑组织的mRNA并逆转录合成cDNA。
PCR扩增：以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR反应。扩增体积为50 μL，首先97 ℃变性10 min，加入Taq DNA聚合酶后，进行扩增反应。循环条件为：94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35个循环，最后1次72 ℃下延伸5 min。电泳检测扩增结果。
PCR产物纯化与克隆：PCR产物用PCR Clean up试剂盒(Boehringer Mannheim公司)纯化后，克隆于pGEM-TEasy载体(Promega公司)，蓝白斑筛选后酶切鉴定方向，并进行序列测定(Cybersyn公司)。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 GDNF基因片段扩增
以胎脑基因组DNA及cDNA为模板扩增得到的PCR产物于1.2%琼脂糖中电泳结果均为410 bp片段(图1、2)，与理论值相符。
图1 RT-PCR产物的电泳检测
A：RT-PCR，B：pBR322/BstN1
图2 PCR产物及pGEM-GDNF重组载体的鉴定
A：PCR产物，B：385 bp，C：λ/HindⅢ+EcoRⅠ，D：pGEM-GDNF/EcoRⅠ，E：pGEM-GDNF/ApaI+BamHⅠ，F：pGEM-GDNF/BamHⅠ
2.2 GDNF基因cDNA片段的克隆
, 百拇医药 该片段纯化后，克隆于pGEM-T Easy载体，pGEM-GDNF用BamHⅠ单酶切得到3.4 kb的片段，用EcoRⅠ及BamHⅠ/ApaⅠ酶切，得到3.0 kb、410 bp及3.0 kb、448 bp的2组片段(图2)，说明该质粒中有GDNF片段的插入，且5′端在T7启动子一侧。
2.3 基因序列测定与分析
该质粒经测序得到GDNF片段的核苷酸序列(图3)。
图3 GDNF基因片段核苷酸序列
3 讨论
GDNF是近来新克隆和纯化的一种对多巴胺能神经元有特异保护与营养作用的神经营养因子，因最初从鼠胶质细胞系B49中纯化而得名[4]。GDNF首先以前体形式合成，后在细胞中加工成含134个氨基酸的成熟蛋白并分泌出来。成熟蛋白是相对分子质量为2万的糖基多肽，以二硫键连接的二聚体形式存在，属于转化生长因子超家庭(TGF-β superfamily)中的一员[4，5]，但是成熟的GDNF与TGF-β中任一亚家庭不超过20%的同源性，因此被认为代表了一个新的TGF-β亚家庭[4]。
, 百拇医药
实验证明GDNF对多巴胺能神经元有特异性的保护作用，能促进新生神经元的发育和分化，有效防止多巴胺神经元的变性死亡，在神经元受损后还具有修复功能[5～7]，因此是治疗帕金森病的一个很有潜力的神经营养因子。进一步研究发现GDNF的分布是十分广泛的，在神经系统中，大脑皮质、下丘脑、丘脑、脑干、黑质、小脑、脊髓均有GDNF表达[8]，这表明GDNF在神经系统中具有多种作用。以胎脑组织为标本，分别采用PCR和RT-PCR方法扩增出GDNF基因片段，因两者产物均为410 bp片段，故证实该基因片段中无内含子。可用于真核及原核系统的表达。测序结果与Genebank中已发表的序列基本相同，只有TGT(Genebank)→TGC(图3)，这可能是胎脑本身特有的核苷酸序列所决定，或是Taq DNA聚合酶扩增时出现了错误，但两者都编码半胱氨酸，对蛋白质序列并无影响。因此可以利用我们克隆的GDNF基因片段研究它在中枢及外周神经系统中的分布、功能以及在神经系统疾病治疗中的作用。
参考文献
, 百拇医药
1 Hughes A J, Daniel S E, Blankson S, et al. A clinicopathologic study of 100 cases of Parkinson′s disease. Arch Neurol, 1993,50:140～148
2 Hofer H C, Brade M, Juhasz Y A, et al. BDNF is a neurotropic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra. Nature, 1991,350:230～235
3 Hagg T, Varous S. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of adult rat substantia nigra dopaminergic neurons in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90:6315～6319
, http://www.100md.com
4 Lin L H, Doherty D H, Lile J D, et al. GDNF: A glial cell line-derived neurotropic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 1993,260:1130～1132
5 Beck K D, Valverde J, Alexl T, et al. Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature, 1995, 373:339～341
6 Choilundberg D L, Lin Q, Chang Y N, et al. Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science, 1997,275:838～841
, http://www.100md.com
7 Lapchak P A, Araujo D M, Hilt D C, et al. Adenoviral Vector-Mediated GDNF gene therapy in a rodent lesion model of late stage Parkinson′s disease. Brain Res, 1997, 777(1-2):153～160
8 Pochon N A, Menonol A, Tseng I L, et al. Neuronal GDNF expression in the adult rat nervous system identified by in situ hybridization. Eur J Neurosci, 1997,9:46:463～471
收稿日期：1998-07-14, 百拇医药
单位：首都医科大学北京神经科学研究所
关键词：hGDNF；神经生长因子；基因克隆
首都医科大学学报990403 提要： 为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)在神经系统疾病中的作用，根据GDNF的cDNA序列设计并合成引物，以流产胎儿脑组织为来源，分别提取RNA和基因组DNA作模板，经RT-PCR和PCR技术扩增人GDNF基因片段，采用DNA重组技术将其克隆于pGEM-T Easy载体中并测序。结果：RNA和基因组DNA体外扩增得到的片段均是410 bp，两者无差异。PGEM-GDNF经酶切鉴定正确，测序结果与Genebank比较基本相同。由于RNA和基因组DNA扩增得到的片段大小相同，证实该基因片段内无内含子插入，该片段可用于真核及原核表达。
, 百拇医药
中图分类号： Q784
Cloning and Sequencing the Gene of Human Glial Cell Line-derived Neurotropic Factor
Pan Haiyan, Wang Jue, Tian Jingsheng, Chen Degao, Xu Qunyuan, Dai Xiaoling
Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences
Abstract：To clone the gene of human glial cell line-derived neurotropic factor for researching its effects in the nervous system diseases PCR primers were synthesized based on the hGDNF cDNA sequence, RT-PCR and PCR were performed respectively on RNA and genomic DNA extracted from fetal brain. The PCR fragment was subcloned into pGEM-T easy vector and then was confirmed by DNA sequencing. Results: The length of the two DNA fragments amplified by RNA and genomic DNA was both 410 bp. There was no difference between them. Restriction digests were analyzed to determine insert orientation. the fragment DNA sequences were homology with corresponding sequences published in Genebank. Conclusion: The hGDNF fragment has no intron because RT-PCR and PCR amplifications are the same size, this fragment can be used in eukaryotic and prokaryotic gene expression.
, 百拇医药
Key words：human GDNF; neurotropic factor; gene clone
帕金森病(Parkinson disease, PD)是以中脑黑质的多巴胺能神经元进行性退变为主要特征的神经系统疾病。以补充多巴胺的前体左旋多巴(levodopa)为主的药物治疗在一定程度上控制症状，但不能阻止神经元的继续变性、死亡的趋势[1]。近年来发现的一系列神经营养因子如脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)[2]，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)[3]及胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)等能特异性防止多巴胺能神经元的变性，并能提高残存多巴胺神经元的功能活性。本研究拟以PCR技术从流产胎儿脑组织中扩增GDNF基因片段，并对扩增的cDNA片段进行分析，从而探讨体内、体外实验中GDNF对神经性疾病治疗中的可能性。
, 百拇医药
1 对象和方法
标本为4月龄流产胎儿脑组织。
引物序列：引物1：
5′端
引物2：
5′端由美国Cybersn公司合成，并在引物外侧端加上酶切位点(5′ NdeⅠ，3′ BamHⅠ)，PCR扩增片段长度为410 bp左右。
基因组DNA的提取：将胎脑组织捣碎，加入10倍体积的抽提缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA pH 8.0,20 mg/L胰RNA酶，0.5% SDS)，37 ℃温育1 h，加入蛋白酶K(Merck E公司)至终质量浓度为100 mg/L，50 ℃水溶3 h，待冷却至室温后，用酚抽提3次，将水相移至一洁净管中，加入0.2体积的乙酸铵和2倍体积的乙醇沉淀DNA，以70%乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后用TE(pH 8.0)溶解。
, 百拇医药
mRNA的提取及cDNA的合成：用PolyATtract Series 9600 TM mRNA分离及cDNA合成试剂盒(Promega公司)提取胎脑组织的mRNA并逆转录合成cDNA。
PCR扩增：以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR反应。扩增体积为50 μL，首先97 ℃变性10 min，加入Taq DNA聚合酶后，进行扩增反应。循环条件为：94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35个循环，最后1次72 ℃下延伸5 min。电泳检测扩增结果。
PCR产物纯化与克隆：PCR产物用PCR Clean up试剂盒(Boehringer Mannheim公司)纯化后，克隆于pGEM-TEasy载体(Promega公司)，蓝白斑筛选后酶切鉴定方向，并进行序列测定(Cybersyn公司)。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 GDNF基因片段扩增
以胎脑基因组DNA及cDNA为模板扩增得到的PCR产物于1.2%琼脂糖中电泳结果均为410 bp片段(图1、2)，与理论值相符。
图1 RT-PCR产物的电泳检测
A：RT-PCR，B：pBR322/BstN1
图2 PCR产物及pGEM-GDNF重组载体的鉴定
A：PCR产物，B：385 bp，C：λ/HindⅢ+EcoRⅠ，D：pGEM-GDNF/EcoRⅠ，E：pGEM-GDNF/ApaI+BamHⅠ，F：pGEM-GDNF/BamHⅠ
2.2 GDNF基因cDNA片段的克隆
, 百拇医药 该片段纯化后，克隆于pGEM-T Easy载体，pGEM-GDNF用BamHⅠ单酶切得到3.4 kb的片段，用EcoRⅠ及BamHⅠ/ApaⅠ酶切，得到3.0 kb、410 bp及3.0 kb、448 bp的2组片段(图2)，说明该质粒中有GDNF片段的插入，且5′端在T7启动子一侧。
2.3 基因序列测定与分析
该质粒经测序得到GDNF片段的核苷酸序列(图3)。
图3 GDNF基因片段核苷酸序列
3 讨论
GDNF是近来新克隆和纯化的一种对多巴胺能神经元有特异保护与营养作用的神经营养因子，因最初从鼠胶质细胞系B49中纯化而得名[4]。GDNF首先以前体形式合成，后在细胞中加工成含134个氨基酸的成熟蛋白并分泌出来。成熟蛋白是相对分子质量为2万的糖基多肽，以二硫键连接的二聚体形式存在，属于转化生长因子超家庭(TGF-β superfamily)中的一员[4，5]，但是成熟的GDNF与TGF-β中任一亚家庭不超过20%的同源性，因此被认为代表了一个新的TGF-β亚家庭[4]。
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实验证明GDNF对多巴胺能神经元有特异性的保护作用，能促进新生神经元的发育和分化，有效防止多巴胺神经元的变性死亡，在神经元受损后还具有修复功能[5～7]，因此是治疗帕金森病的一个很有潜力的神经营养因子。进一步研究发现GDNF的分布是十分广泛的，在神经系统中，大脑皮质、下丘脑、丘脑、脑干、黑质、小脑、脊髓均有GDNF表达[8]，这表明GDNF在神经系统中具有多种作用。以胎脑组织为标本，分别采用PCR和RT-PCR方法扩增出GDNF基因片段，因两者产物均为410 bp片段，故证实该基因片段中无内含子。可用于真核及原核系统的表达。测序结果与Genebank中已发表的序列基本相同，只有TGT(Genebank)→TGC(图3)，这可能是胎脑本身特有的核苷酸序列所决定，或是Taq DNA聚合酶扩增时出现了错误，但两者都编码半胱氨酸，对蛋白质序列并无影响。因此可以利用我们克隆的GDNF基因片段研究它在中枢及外周神经系统中的分布、功能以及在神经系统疾病治疗中的作用。
参考文献
, 百拇医药
1 Hughes A J, Daniel S E, Blankson S, et al. A clinicopathologic study of 100 cases of Parkinson′s disease. Arch Neurol, 1993,50:140～148
2 Hofer H C, Brade M, Juhasz Y A, et al. BDNF is a neurotropic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra. Nature, 1991,350:230～235
3 Hagg T, Varous S. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of adult rat substantia nigra dopaminergic neurons in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90:6315～6319
, http://www.100md.com
4 Lin L H, Doherty D H, Lile J D, et al. GDNF: A glial cell line-derived neurotropic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science, 1993,260:1130～1132
5 Beck K D, Valverde J, Alexl T, et al. Mesencephalic dopaminergic neurons protected by GDNF from axotomy-induced degeneration in the adult brain. Nature, 1995, 373:339～341
6 Choilundberg D L, Lin Q, Chang Y N, et al. Dopaminergic neurons protected from degeneration by GDNF gene therapy. Science, 1997,275:838～841
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7 Lapchak P A, Araujo D M, Hilt D C, et al. Adenoviral Vector-Mediated GDNF gene therapy in a rodent lesion model of late stage Parkinson′s disease. Brain Res, 1997, 777(1-2):153～160
8 Pochon N A, Menonol A, Tseng I L, et al. Neuronal GDNF expression in the adult rat nervous system identified by in situ hybridization. Eur J Neurosci, 1997,9:46:463～471
收稿日期：1998-07-14, 百拇医药