小鼠Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF-β1基因的研究
作者：李勇 薛蔚 陈道达 杨业金 田园 郑启昌
单位：李勇 田园 陈道达 郑启昌，同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022；薛蔚，同济医科大学附属同济医院眼科，武汉 430030；杨业金，同济医科大学实验医学中心分子生物学教研室，武汉 430030
关键词：Ehrlich瘤；基因转染；原位杂交；转化生长因子β1
同济大学学报990408 摘要 研究Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF-β1基因的治疗效果。将真核表达载体pSVTGF-β1直接瘤周转染Ehrlich实体瘤，用原位杂交方法检测靶基因的表达，MTT法检测脾脏细胞免疫功能，并观察小鼠生存期及肿瘤生长速度。治疗组肿瘤细胞及瘤周组织有靶基因mRNA表达，脾脏细胞免疫功能高于对照组，肿瘤生长受到抑制，治疗组小鼠生存期较对照组明显延长。TGF-β1 基因DNA直接转染法可以明显抑制肿瘤生长，不影响全身细胞免疫功能，具有较大的潜在临床应用价值。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R273， R459.9
Study on TGF-β1 Gene DNA Direct Transfer on Mice Bearing Ehrlich Carcinoma
Li Yong, Chen Daoda et al
Department of General Surgery, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Xue Wei
Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Yang Yiejin
Department of Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji
Medical University, Wuhan 430030
Abstract The therapeutic effect of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) gene nude DNA direct transfer on mice bearing Ehrlich carcinoma was studied. After plasmid vector pSVTGF-β1 was injected into mice tissue around Ehrlich carcinoma, target gene expression was detected by in situ hybridization. The spleen cells function was measured by MTT assay. The growth speed of the tumor and survival time was also observed. The results showed that target gene mRNA expression was found in tumor cells and tissue around tumor. The immune function of spleen cells was better in the treated group than in the control group. The tumor growth was inhibited by nude DNA-transferred TGF-β1 gene. Survival time was longer in treating group than in control group. It was concluded that the direct gene transfer of TGF-β1 could inhibit tumor growth, but had no influence on the immune function of body, suggesting the method may be of great clinical practical value.
, http://www.100md.com
Key words Ehrlich ascites carcinoma; gene transfer; in situ hybridization; transforming growth factor beta 1
转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是一种对多种肿瘤细胞具有强烈抑制作用的细胞因子，在多种肿瘤的细胞模型上已证明可以抑制肿瘤的生长和恶性表型。本文用DNA局部浸润注射小鼠实体瘤的方法，将TGF-β1基因转染至Ehrlich腹水瘤的实体瘤模型，并对其疗效、机体免疫状况及转染效率进行了讨论和研究。
1 材料与方法
真核表达载体pSVTGF-β1由本校分子生物学研究室提供。pSVTGF-β1质粒转化、扩增、提取及纯化方法见参考文献[1]。
, 百拇医药 动物模型及基因转染：6周龄的昆明种健康雄性小鼠60只，分为实验组30只和对照组30只，同侧腋下接种5×106/ml Ehrlich 腹水瘤细胞，5 d后肿瘤长至0.4～0.5 cm时，局部给予100 μl的pSVTGF-β1真核表达质粒(100 μg)和等体积的50 g/L蔗糖溶液及PBS的混合液100 μl瘤周浸润注射。每日测量、记录肿瘤直径并记录生存期。
T淋巴细胞增殖实验：基因转染2周后断颈处死小鼠，实验组、对照组各10只。无菌取出小鼠的脾脏，匀浆制成细胞悬液，用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，在含100 ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中以4×106 /ml细胞浓度(100 μl)在96孔板中培养并加入刀豆蛋白ConA至5 μg/ml，72 h后，用MTT(4甲基偶氮唑盐)法测淋巴细胞增殖率。淋巴细胞净增殖率＝ConA刺激组OD值-未刺激组OD值。
原位杂交：TGF-β1 cDNA探针自行制备，用EcoRⅠ(SABC公司产品)在多克隆位点切下1.8 kb的cDNA片断。质粒的酶切和基因片断回收按文献[1]。探针的标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(Boehringer Mannheim 公司产品)说明书。主要操作步骤如下：基因转染2周后断颈处死小鼠，剥离肿瘤标本，40 g/L多聚甲醛固定4 h后，200 g/L蔗糖过夜至组织块饱和下沉，制成8～10 μm冰冻切片，再40 g/L多聚甲醛后固定，依次PBS浸洗、0.2 mol/L HCl 处理、蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37 ℃预杂交1～2 h，以2 μg / ml 的探针浓度配成杂交液，在42 ℃恒温水浴中杂交36 h，其后分别经浓度递减的系列标准柠檬酸盐溶液(SSC)漂洗，再转入地高辛抗体工作液(1∶1000)中37 ℃ 1 h，完成后又经PBS、Buffer I和Ⅲ漂洗，加入新鲜配置的显色液中，于室温避光显色1～2 h，用Buffer Ⅲ 终止反应，最后酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
, 百拇医药
原位杂交阴性对照采用：杂交前用RNA酶(100 U/ ml)于37 ℃预处理切片30 min；杂交液中不含标记探针。
统计学分析：所有数据均进行t检验分析，数据用
表示。
2 结果
2.1 TGF-β1对肿瘤的生长抑制作用
2.1.1 肿瘤的生长曲线：见图1，在肿瘤局部及周围浸润注射pSVTGF-β1真核表达质粒3～4d 后，实验组肿瘤平均直径(0.60±0.03)cm ，明显小于对照组肿瘤平均直径(1.27±0.06)cm(P<0.01)。3周后，实验组2只(2/20)肿瘤缩小至0.2～0.3 cm，其余小鼠肿瘤大小也明显小于对照组。7周后，实验组肿瘤平均直径(1.76±0.53) cm，对照组肿瘤平均直径(4.57±1.06) cm(P<0.01)。
, 百拇医药
接种时间(d)
图1 两组肿瘤生长比较
2.1.2 TGF-β1对荷瘤小鼠生存期的影响：实验组平均生存期(50.67±17.18)d，对照组平均生存期(35.2±18.03)d(P<0.01)。部分实验组凋亡细胞可以长期存活(2/20)。
2.2 T淋巴细胞增殖实验
实验组淋巴细胞净增殖值为2.33±0.31，对照组淋巴细胞净增殖值为1.09±0.35(P<0.05)。表明实验组动物细胞免疫功能高于对照组。
图2 实验组肿瘤细胞胞浆内有阳性杂交信号 图3 对照组肿瘤细胞中未见阳性杂交信号
, 百拇医药
2.3 原位杂交
原位杂交显示的阳性杂交信号为深蓝色颗粒，主要分布于胞浆及核仁。反映了TGF-β1的mRNA表达情况。实验组切片见部分肿瘤细胞的胞浆内有明显的阳性杂交信号(图2)；对照组切片中未见阳性杂交信号(图3)。表明在治疗组部分肿瘤细胞中TGF-β1获得了表达，而对照组无表达。
3 讨论
近年来，对恶性肿瘤的分子机制研究表明，肿瘤是多种癌基因突变引起的细胞生长控制失调累积的结果。因此许多学者预见基因治疗是人类克服肿瘤的希望。随着基因重组技术和真核细胞基因表达研究取得重大进展，肿瘤基因治疗成为当前的研究热点。
TGF-β1是一种具有多种功能的多肽生长因子，可抑制多种肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞的恶性程度降低，生长速度下降，可望用于临床肿瘤的治疗[2]。但是细胞因子在体内半衰期很短，极易分解，而且对包括淋巴细胞在内的多种细胞也有抑制作用，如果全身给药将带来巨大的毒副反应，特别是可能引起机体的免疫功能抑制，产生严重后果。局部基因治疗是一种高效、低毒的治疗方法，而瘤周直接浸润注射比其他基因转移的方法具有简单方便、经济、易重复使用的优点。且真核表达质粒在体内可以逐渐被分解，不整合到染色体中，稳定表达的时间从数月到一年。从理论上讲比病毒载体安全，比较容易控制，因此有望成为临床药物。本文采用了肿瘤周围直接浸润注射PSTVGF-β1获得了真核表达质粒裸DNA的基因转染方法。经原位杂交检测，证明在治疗组部分肿瘤细胞中TGF-β1获得了表达，而对照组呈阴性，表明这种转染方法是成功的。有研究表明，裸DNA转染的效率与转染液的体积有关，本文适当增加转染液的体积可以增加转染效率[3]。本文还在转染液中加入葡萄糖，也可以增加转染效率。肿瘤中心组织有缺血坏死，外周组织及瘤周正常组织血运丰富，是转染的靶组织。外源性DNA被组织细胞吸收，在细胞内表达TGF-β1，抑制肿瘤细胞生长，并且分泌到细胞外，抑制周围肿瘤细胞的生长，即旁观者效应。研究结果表明TGF-β1的肿瘤抑制作用包括：抑制肿瘤的生长速度，延长荷瘤小鼠的生存期。其机制目前尚不完全清楚。有研究认为，TGF-β1通过抑癌基因P53、RB基因的低能磷酸化[4,5]，进一步抑制C-MYC的作用，使细胞分裂停留在G1后期，使肿瘤细胞的分裂停止。TGF-β1还参与促进肿瘤细胞的凋亡[6,7]，也是其机理之一。T淋巴细胞增殖实验表明，局部转染TGF-β1并不影响全身的免疫功能。而且由于其治疗作用，治疗组动物肿瘤负荷小于对照组，因此治疗组动物的细胞免疫功能高于对照组。
, 百拇医药
总之，基因治疗方法的前景越来越明朗，但是仍然有许多问题需要解决。特别是裸DNA直接转染法，需要提高转染效率和表达效率，建立特异性的转染方法，使外源性DNA可以在特异的靶细胞中高效表达，而在非靶细胞中低表达或不表达。选择适当的靶基因，构建新载体，或者联合多个靶基因，研究其基因转染的理论依据，探讨其安全性，减少可能的副作用，实现真正安全有效的基因治疗。
作者简介:李勇，男，1970年生，医学博士
参 考 文 献
1 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T.Molecular cloning: a Laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory CSH, 1998.66～69
2 Wu S P, Theodorescu D, Kerbel R S et al. TGF-beta 1 is an autocrine negative growth regulator of human colon carcinoma FET cells in vivo as revealed by transfection of an antisense expression vector. J Cell Biol, 1992，116， 187
, 百拇医药
3 Davis H L, Whalen R G, Demeneix B A. Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Hum Gene Ther, 1993,4:733
4 Ludlow J W, DeCaprio J A, Huang C M et al. SV40 large T antigen binds preferentially to an underphosphorylated member of the retinoblastoma susceptibility gene product family. Cell， 1989， 13， 56:57
5 Mogi Y, Kato J, Horimoto M et al. Close correlation between the dephosphorylation of p53 and growth suppression by transforming growth factor-beta 1 in nasopharynegeal cacinoma cells transduced with adenovirus early region genes. Jpn J Cancer Res, 1994，85:459
, 百拇医药
6 Yanagihara K, Tsumuraya M. Transforming growth factor beta 1 induces apoptotic cell death in cultured human gastric carcinoma cells. Cancer Res， 1992，52:4042
7 Bies J, Wolff L. Acceleration of apoptosis in transforming growth factor β1 treated M1 cells ectopically expressing B-myb. Cancer Research， 1995， 55:501
(1998-10-13收稿)
, 百拇医药
单位：李勇 田园 陈道达 郑启昌，同济医科大学附属协和医院外科，武汉 430022；薛蔚，同济医科大学附属同济医院眼科，武汉 430030；杨业金，同济医科大学实验医学中心分子生物学教研室，武汉 430030
关键词：Ehrlich瘤；基因转染；原位杂交；转化生长因子β1
同济大学学报990408 摘要 研究Ehrlich实体瘤局部DNA直接转染TGF-β1基因的治疗效果。将真核表达载体pSVTGF-β1直接瘤周转染Ehrlich实体瘤，用原位杂交方法检测靶基因的表达，MTT法检测脾脏细胞免疫功能，并观察小鼠生存期及肿瘤生长速度。治疗组肿瘤细胞及瘤周组织有靶基因mRNA表达，脾脏细胞免疫功能高于对照组，肿瘤生长受到抑制，治疗组小鼠生存期较对照组明显延长。TGF-β1 基因DNA直接转染法可以明显抑制肿瘤生长，不影响全身细胞免疫功能，具有较大的潜在临床应用价值。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R273， R459.9
Study on TGF-β1 Gene DNA Direct Transfer on Mice Bearing Ehrlich Carcinoma
Li Yong, Chen Daoda et al
Department of General Surgery, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Xue Wei
Department of Ophthalmology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药
Yang Yiejin
Department of Molecular Biology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji
Medical University, Wuhan 430030
Abstract The therapeutic effect of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) gene nude DNA direct transfer on mice bearing Ehrlich carcinoma was studied. After plasmid vector pSVTGF-β1 was injected into mice tissue around Ehrlich carcinoma, target gene expression was detected by in situ hybridization. The spleen cells function was measured by MTT assay. The growth speed of the tumor and survival time was also observed. The results showed that target gene mRNA expression was found in tumor cells and tissue around tumor. The immune function of spleen cells was better in the treated group than in the control group. The tumor growth was inhibited by nude DNA-transferred TGF-β1 gene. Survival time was longer in treating group than in control group. It was concluded that the direct gene transfer of TGF-β1 could inhibit tumor growth, but had no influence on the immune function of body, suggesting the method may be of great clinical practical value.
, http://www.100md.com
Key words Ehrlich ascites carcinoma; gene transfer; in situ hybridization; transforming growth factor beta 1
转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是一种对多种肿瘤细胞具有强烈抑制作用的细胞因子，在多种肿瘤的细胞模型上已证明可以抑制肿瘤的生长和恶性表型。本文用DNA局部浸润注射小鼠实体瘤的方法，将TGF-β1基因转染至Ehrlich腹水瘤的实体瘤模型，并对其疗效、机体免疫状况及转染效率进行了讨论和研究。
1 材料与方法
真核表达载体pSVTGF-β1由本校分子生物学研究室提供。pSVTGF-β1质粒转化、扩增、提取及纯化方法见参考文献[1]。
, 百拇医药 动物模型及基因转染：6周龄的昆明种健康雄性小鼠60只，分为实验组30只和对照组30只，同侧腋下接种5×106/ml Ehrlich 腹水瘤细胞，5 d后肿瘤长至0.4～0.5 cm时，局部给予100 μl的pSVTGF-β1真核表达质粒(100 μg)和等体积的50 g/L蔗糖溶液及PBS的混合液100 μl瘤周浸润注射。每日测量、记录肿瘤直径并记录生存期。
T淋巴细胞增殖实验：基因转染2周后断颈处死小鼠，实验组、对照组各10只。无菌取出小鼠的脾脏，匀浆制成细胞悬液，用淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，在含100 ml/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中以4×106 /ml细胞浓度(100 μl)在96孔板中培养并加入刀豆蛋白ConA至5 μg/ml，72 h后，用MTT(4甲基偶氮唑盐)法测淋巴细胞增殖率。淋巴细胞净增殖率＝ConA刺激组OD值-未刺激组OD值。
原位杂交：TGF-β1 cDNA探针自行制备，用EcoRⅠ(SABC公司产品)在多克隆位点切下1.8 kb的cDNA片断。质粒的酶切和基因片断回收按文献[1]。探针的标记和检测按地高辛DNA标记与检测试剂盒(Boehringer Mannheim 公司产品)说明书。主要操作步骤如下：基因转染2周后断颈处死小鼠，剥离肿瘤标本，40 g/L多聚甲醛固定4 h后，200 g/L蔗糖过夜至组织块饱和下沉，制成8～10 μm冰冻切片，再40 g/L多聚甲醛后固定，依次PBS浸洗、0.2 mol/L HCl 处理、蛋白酶K消化、甘氨酸浸洗后，37 ℃预杂交1～2 h，以2 μg / ml 的探针浓度配成杂交液，在42 ℃恒温水浴中杂交36 h，其后分别经浓度递减的系列标准柠檬酸盐溶液(SSC)漂洗，再转入地高辛抗体工作液(1∶1000)中37 ℃ 1 h，完成后又经PBS、Buffer I和Ⅲ漂洗，加入新鲜配置的显色液中，于室温避光显色1～2 h，用Buffer Ⅲ 终止反应，最后酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。
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原位杂交阴性对照采用：杂交前用RNA酶(100 U/ ml)于37 ℃预处理切片30 min；杂交液中不含标记探针。
统计学分析：所有数据均进行t检验分析，数据用
表示。2 结果
2.1 TGF-β1对肿瘤的生长抑制作用
2.1.1 肿瘤的生长曲线：见图1，在肿瘤局部及周围浸润注射pSVTGF-β1真核表达质粒3～4d 后，实验组肿瘤平均直径(0.60±0.03)cm ，明显小于对照组肿瘤平均直径(1.27±0.06)cm(P<0.01)。3周后，实验组2只(2/20)肿瘤缩小至0.2～0.3 cm，其余小鼠肿瘤大小也明显小于对照组。7周后，实验组肿瘤平均直径(1.76±0.53) cm，对照组肿瘤平均直径(4.57±1.06) cm(P<0.01)。
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接种时间(d)
图1 两组肿瘤生长比较
2.1.2 TGF-β1对荷瘤小鼠生存期的影响：实验组平均生存期(50.67±17.18)d，对照组平均生存期(35.2±18.03)d(P<0.01)。部分实验组凋亡细胞可以长期存活(2/20)。
2.2 T淋巴细胞增殖实验
实验组淋巴细胞净增殖值为2.33±0.31，对照组淋巴细胞净增殖值为1.09±0.35(P<0.05)。表明实验组动物细胞免疫功能高于对照组。
图2 实验组肿瘤细胞胞浆内有阳性杂交信号 图3 对照组肿瘤细胞中未见阳性杂交信号
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2.3 原位杂交
原位杂交显示的阳性杂交信号为深蓝色颗粒，主要分布于胞浆及核仁。反映了TGF-β1的mRNA表达情况。实验组切片见部分肿瘤细胞的胞浆内有明显的阳性杂交信号(图2)；对照组切片中未见阳性杂交信号(图3)。表明在治疗组部分肿瘤细胞中TGF-β1获得了表达，而对照组无表达。
3 讨论
近年来，对恶性肿瘤的分子机制研究表明，肿瘤是多种癌基因突变引起的细胞生长控制失调累积的结果。因此许多学者预见基因治疗是人类克服肿瘤的希望。随着基因重组技术和真核细胞基因表达研究取得重大进展，肿瘤基因治疗成为当前的研究热点。
TGF-β1是一种具有多种功能的多肽生长因子，可抑制多种肿瘤细胞的生长，使肿瘤细胞的恶性程度降低，生长速度下降，可望用于临床肿瘤的治疗[2]。但是细胞因子在体内半衰期很短，极易分解，而且对包括淋巴细胞在内的多种细胞也有抑制作用，如果全身给药将带来巨大的毒副反应，特别是可能引起机体的免疫功能抑制，产生严重后果。局部基因治疗是一种高效、低毒的治疗方法，而瘤周直接浸润注射比其他基因转移的方法具有简单方便、经济、易重复使用的优点。且真核表达质粒在体内可以逐渐被分解，不整合到染色体中，稳定表达的时间从数月到一年。从理论上讲比病毒载体安全，比较容易控制，因此有望成为临床药物。本文采用了肿瘤周围直接浸润注射PSTVGF-β1获得了真核表达质粒裸DNA的基因转染方法。经原位杂交检测，证明在治疗组部分肿瘤细胞中TGF-β1获得了表达，而对照组呈阴性，表明这种转染方法是成功的。有研究表明，裸DNA转染的效率与转染液的体积有关，本文适当增加转染液的体积可以增加转染效率[3]。本文还在转染液中加入葡萄糖，也可以增加转染效率。肿瘤中心组织有缺血坏死，外周组织及瘤周正常组织血运丰富，是转染的靶组织。外源性DNA被组织细胞吸收，在细胞内表达TGF-β1，抑制肿瘤细胞生长，并且分泌到细胞外，抑制周围肿瘤细胞的生长，即旁观者效应。研究结果表明TGF-β1的肿瘤抑制作用包括：抑制肿瘤的生长速度，延长荷瘤小鼠的生存期。其机制目前尚不完全清楚。有研究认为，TGF-β1通过抑癌基因P53、RB基因的低能磷酸化[4,5]，进一步抑制C-MYC的作用，使细胞分裂停留在G1后期，使肿瘤细胞的分裂停止。TGF-β1还参与促进肿瘤细胞的凋亡[6,7]，也是其机理之一。T淋巴细胞增殖实验表明，局部转染TGF-β1并不影响全身的免疫功能。而且由于其治疗作用，治疗组动物肿瘤负荷小于对照组，因此治疗组动物的细胞免疫功能高于对照组。
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总之，基因治疗方法的前景越来越明朗，但是仍然有许多问题需要解决。特别是裸DNA直接转染法，需要提高转染效率和表达效率，建立特异性的转染方法，使外源性DNA可以在特异的靶细胞中高效表达，而在非靶细胞中低表达或不表达。选择适当的靶基因，构建新载体，或者联合多个靶基因，研究其基因转染的理论依据，探讨其安全性，减少可能的副作用，实现真正安全有效的基因治疗。
作者简介:李勇，男，1970年生，医学博士
参 考 文 献
1 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T.Molecular cloning: a Laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory CSH, 1998.66～69
2 Wu S P, Theodorescu D, Kerbel R S et al. TGF-beta 1 is an autocrine negative growth regulator of human colon carcinoma FET cells in vivo as revealed by transfection of an antisense expression vector. J Cell Biol, 1992，116， 187
, 百拇医药
3 Davis H L, Whalen R G, Demeneix B A. Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Hum Gene Ther, 1993,4:733
4 Ludlow J W, DeCaprio J A, Huang C M et al. SV40 large T antigen binds preferentially to an underphosphorylated member of the retinoblastoma susceptibility gene product family. Cell， 1989， 13， 56:57
5 Mogi Y, Kato J, Horimoto M et al. Close correlation between the dephosphorylation of p53 and growth suppression by transforming growth factor-beta 1 in nasopharynegeal cacinoma cells transduced with adenovirus early region genes. Jpn J Cancer Res, 1994，85:459
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6 Yanagihara K, Tsumuraya M. Transforming growth factor beta 1 induces apoptotic cell death in cultured human gastric carcinoma cells. Cancer Res， 1992，52:4042
7 Bies J, Wolff L. Acceleration of apoptosis in transforming growth factor β1 treated M1 cells ectopically expressing B-myb. Cancer Research， 1995， 55:501
(1998-10-13收稿)
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