原发性肝细胞癌中P16/CDKN2基因表达的研究
作者：孙宝华 王涛 武忠弼 阮幼冰 杨木兰 刘冰
单位：孙宝华 武忠弼 阮幼冰 杨木兰 刘冰，同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室， 武汉 430030；王涛，武汉市第四医院内科，武汉 430022
关键词：肝细胞癌；基因；P16；CDK4；原位杂交；免疫组织化学
同济医科大学学报990402 摘要 应用原位杂交技术检测了28例原发性肝细胞癌(HCC)中P16/CDKN2基因mRNA的表达，并用免疫组织化学法检测了P16蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)蛋白的表达。结果显示：7例HCC 的P16基因mRNA为阴性，13例为异质性减弱，8例为保留表达。mRNA阳性的HCC中，均可见到P16蛋白表达。P16/CDKN2基因表达与HCC 的分级、分化及转移无关。28例HCC中共有6例出现CDK4蛋白阳性，这6例HCC均有不同程度的P16蛋白表达，提示CDK4蛋白表达可能是灭活P16 蛋白的又一途径。
, 百拇医药
中图法分类号 R730， Q343.1， R392.11
Expression of P16/CDKN2 Gene in Primary Human Hepatocellular Carcinoma
Sun Baohua, Wu Zhongbi et al
Department of Ultrastructural Pathology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Wang Tao
Department of Internal Medicine, Wuhan Fourth Hospital, Wuhan 430022
, 百拇医药
Abstract P16/CDKN2 gene encodes a 16KD cyclin kinase inhibitor (P16) which is a critical regulator of the cell cycle. Frequent deletion and mutation of this gene have been documented in different types of human tumors. Alteration of P16 protein expression in human tumors also have been reported. In this paper, the P16/cyclin-dependent kinase inhibitor 2 (P16/CDKN2) gene expression at mRNA level was detected by using in situ hybridization(ISH) in 28 cases of primary human hepatocellular carcinoma(HCC). Immunohistochemistry was also employed to detect the p16 and cyclin-dependent kinase 4(CDK4) protein expression. The results showed that 7 cases of HCC failed to express P16/CDKN2 mRNA, and 8 cases were almost homogenous labeling of all cells. The remaining 13 cases were found labeling of a variable proportion of cells. P16 protein expression was detectable in all cases positive for mRNA. P16/CDKN2 gene expression had no correlation to tumor grade, differentiation or metastasis. CDK4 protein were detected in 6 cases out of 28 cases of HCC. The 6 cases showed p16 protein positive to some extent. It suggests that the expression of CDK4 is an alternative mechanism of inactivation of p16 protein.
, 百拇医药
Key words hepatocellular carcinoma; gene; p16; CDK4; in situ hybridization; immunohistochemistry
P16 基因也称为多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制因子(cyclin-dependent kinase 4 inhibitor, CDK4I)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2(cyclin-dependent kinase inhibitor 2,CDKN2)、P16INK4A基因, 由美国盐湖城Kamb[1]和圣地亚哥的Noborl[2] 于1994 年同时报道，并预示其抑癌作用不亚于视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和P53，甚至比后两者更为重要。 P16 蛋白的氨基末端含有一个与细胞周期蛋白盒(cyclin box) 同源性序列，可与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)竞争结合CDK4。P16 蛋白与CDK4 结合时，可阻止细胞从G1期进入S 期[3]， 从而影响细胞周期的进程，在抑制肿瘤形成中发挥重要作用。 P16 基因缺失或突变，会使P16蛋白抑制CDK4的作用消失，使细胞进入S 期，这样，细胞失去G1期检查点(check point), 就可能复制受损的DNA， 使细胞癌变潜能增加。
, 百拇医药
本研究应用原位杂交及免疫组织化学等技术观察了28例原发性HCC 中P16 mRNA和蛋白的表达， 并探讨了P16基因表达与CDK4表达的关系，为研究HCC 的发病机理提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
本研究共收集同济医科大学附属同济医院1995年手术切除的HCC标本28例。分别取癌组织及5例远离癌组织的非癌肝组织供检。28例中，男性23例， 女性5例， 年龄27岁至64岁，平均50.3岁。肿瘤组织包括14例低分化、9例中等分化和5例高分化肝细胞癌，其中2例有肝内转移，4例有肝外转移。根据TNM分级，2例Ⅰ级，13例Ⅱ级，8例Ⅲ级和5例Ⅳ级。所有标本均选自术前未经放疗、化疗，且无坏死的肿瘤组织。
1.2 原位杂交
全长的P16/MTS1 cDNA 探针由美国A. Kamb 教授惠赠。探针用地高辛标记及检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品)进行标记。按我们以前报道的方法[4]进行原位杂交。7 μm厚的40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片常规脱蜡、水化，0.2 N HCl预处理20 min，蛋白酶K(10 μg/ml) 37℃消化30 min，42℃预杂交2 h，杂交液中含探针2 μg/ml, 42℃杂交36 h，加入抗地高辛抗体(1:800)，37℃ 孵育1 h，NBT显色37℃ 3 h左右，典型切片加上不含探针的杂交液做阴性对照。
, 百拇医药
1.3 免疫组化
兔抗人P16蛋白的多克隆抗体及抗人CDK4蛋白的单克隆抗体是Santa Cruz公司产品。SABC试剂盒购自武汉博士德公司。7 μm厚的40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织常规脱蜡、水化，在0.01 mol/L 柠檬酸钠溶液中94℃～96℃预处理10 min。1:30 稀释一抗。典型切片用PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
2.1 原位杂交
28例HCC 中有21例(75%)为P16 mRNA 阳性表达，阳性信号主要分布在胞浆、为均匀分布的紫蓝色颗粒，细胞核内有少许阳性颗粒(图1)。 有的癌巢均呈阳性，有的癌巢部分细胞呈强阳性、另一部分细胞则呈弱阳性或阴性，显示P16 mRNA 在HCC 中的表达呈异质性。21例阳性表达的HCC中，低分化HCC 为9例(64%)，中等分化为8例(89%)，高分化为4例(80%)，提示P16 mRNA 在 HCC中的表达与HCC 的分化无关(P>0.05)。P16 mRNA表达在I-II级HCC 中的阳性率(80%)与III-IV级中阳性率(69%)差别无显著性意义(P>0.05), 与HCC转移、大小、HBV感染等无关。
, 百拇医药
图1 P16基因原位杂交阳性信号主要分布在胞浆，有的癌巢均呈阳性(×200)
2.2 免疫组织化学
阳性信号为棕黄色颗粒，主要位于胞浆， 间质细胞未见表达。P16 蛋白阳性的HCC 中，有的癌巢中肿瘤细胞均呈阳性，有的癌巢中阳性细胞位于癌巢周边，而癌巢中央部分则无P16蛋白表达，有的癌巢中阳性细胞与一些细胞混杂，但阳性细胞的染色程度大体一致。CDK4阳性的HCC共6例，阳性细胞在癌巢中与阴性细胞混杂存在，阳性细胞之间染色程度不一(图2)。CDK4阳性的HCC 均显示P16蛋白阳性。
图2 CDK4免疫组化阳性的HCC,阳性细胞在癌巢中与阴性细胞混杂存在，阳性细胞之间染色程度不一(×200)
3 讨论
, 百拇医药
细胞周期失控是细胞癌变的重要原因。细胞的生长过程总是处在增殖与抑制增殖的动态平衡之中。促增殖系统成分过度表达与抑制增殖系统成分的缺失或表达减弱都会使细胞增殖失控而导致恶变。哺乳动物细胞受损后，迅速引起细胞在G1和G2期的生长抑制。G1期抑制可使细胞在DNA合成之前有足够的时间修复受损的DNA。P16 蛋白与CDK4 结合时，可阻止细胞从G1期进入S 期[3]， 从而影响细胞周期的进程，在抑制肿瘤形成中发挥重要作用。研究证实，P16基因突变或缺失存在于多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中， 说明P16基因在许多人类肿瘤的发生、发展中起重要作用。我们发现：28例HCC中有21例(75%)呈P16基因阳性表达，说明P16基因失表达(loss of expression)只在部分HCC的发生中起作用。参与调控P16的基因很多，除基因缺失和突变外， Rb蛋白、P53 蛋白及TGFb、CDK4等也参与对P16蛋白表达和功能的调控[5]。由于正常功能的P53能诱导P21WAF1蛋白表达，后者阻止Rb蛋白磷酸化，使P16基因的转录被抑制，所以，P53对P16基因表达起负调控作用。已经证实，丧失P53功能的细胞其P16 mRNA水平较高。而在HCC中，P53基因突变较多，这可能是P16基因在HCC中表达较高的原因之一。另外，Rb蛋白能通过结合转录因子(E2F)而抑制P16蛋白表达[6,7],导致含正常Rb 蛋白的细胞中，不含或含极低的P16蛋白。在HCC中，Rb蛋白无明显表达，这可能是HCC中P16蛋白表达阳性率较高的又一原因。Otterson[7]等报道在肺癌中也有类似的发现。
, 百拇医药
P16基因的改变可能与某些肿瘤的进展有关，表现为恶性程度高的肿瘤及转移性肿瘤中P16基因的改变高于恶性程度低的肿瘤中的改变。Schmidt等[8]发现星形细胞瘤中P16基因较少发生缺失,但间变型星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中则半数以上肿瘤有P16基因缺失。转移性非小细胞性肺癌中P16基因的改变高于非转移性非小细胞性肺癌中P16基因的改变。 Reed等研究不同阶段恶性黑色素瘤时发现,原位癌及早期浸润癌中均表达P16蛋白, 而72%有转移的肿瘤中有P16蛋白的部分或全部丢失。 本研究发现, P16蛋白部分及全部丢失与HCC 的分级、分化无关。虽然在有转移的HCC 中表达阴性率(50%)高于无转移的HCC中阴性率(18%), 但经统计学处理发现差异无显著性(P>0.05)。 因此, 我们认为, P16基因表达改变可能只与部分肿瘤的进展、转移有关。
CDK4是P16 蛋白发挥作用的首要因素。由于P16蛋白通过与CDK4 结合而发挥其抑制细胞周期的功能。CDK4基因扩增和表达增加能灭活P16蛋白的功能，Schmidt等发现25例无P16基因缺失的胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤中，10例有CDK4扩增，而32例有P16缺失的胶质母细胞瘤中，只2例出现CDK4扩增。CDK4 过表达还可以使P16抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和转录因子E2F基因的转录减弱[9]。 P16阻滞Ha-ras 引起的促细胞进入S期的作用可被同时表达的无活性的CDK4抑制。我们发现，6例CDK4蛋白表达的HCC 中均可检测到P16蛋白,提示CDK4蛋白表达在HCC 中也可能起到灭活P16蛋白的作用。但Kitahara等[10]发现：CDK4 的表达只出现在P16蛋白阴性的食管癌细胞系中，说明CDK4蛋白的表达与P16蛋白表达关系非常复杂，可能与肿瘤的类型有关。
, 百拇医药
作者简介:孙宝华，男，1968年生，医学博士
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994,264:436
2 Nobori T, Miura K, Wu D J et al. Deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature,1994,368:753
3 Marx J. New tumor suppressor may rival P53. Science,1994,264:344
, http://www.100md.com
4 Sun B H, Wu Z B, Yuan R B et al. P21WAF1 gene expression in primary human hepatocellular carcinoma and its relationship with p53 gene mutation. J of Tongji Med Univ, 1999，19:1
5 Florenes V A, Maelandsmo G M, Hovig E et al. CDKN2 gene inactivation and expression levels in sporadic human malignant melanomas. Relationship to the status of CDK4, CycllinD1 and pRb. Proc Am Assoc Can Res,1995,36:572
6 Shapiro G I, Rollins B J. P16 as a human tumor suppressor. Biochimica et Biophysica Acta,1996,1242:165
, 百拇医药
7 Otterson G A, Kratzke R A, Coxon A et al. Absence of p16 protein is restricted to the subset of lung cancer lines that retains wild type Rb. Oncogene, 1994,9:3375
8 Schmidt E E , Ichimura K, Reifen G et al. CDKN2 gene deletion or CDK4 amplification occurs in the majority of glioblastomas. Can Res,1994,54:6321
9 Schulze A, Zerfass K, Spitkovsky D et al. Activation of the E2F transcription factor by cyclinD1 is blocked by p16. Oncogene,1994,9:3475
10 Kitahara K, Yasui W, Yokozaki H et al. Expression of cyclinD1, CDK4, p27 is associated with the p16 gene status in human esophageal cancer cell lines. J Exp Ther Oncol, 1996,1:7
(1998-04-06 收稿), 百拇医药
单位：孙宝华 武忠弼 阮幼冰 杨木兰 刘冰，同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究室， 武汉 430030；王涛，武汉市第四医院内科，武汉 430022
关键词：肝细胞癌；基因；P16；CDK4；原位杂交；免疫组织化学
同济医科大学学报990402 摘要 应用原位杂交技术检测了28例原发性肝细胞癌(HCC)中P16/CDKN2基因mRNA的表达，并用免疫组织化学法检测了P16蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)蛋白的表达。结果显示：7例HCC 的P16基因mRNA为阴性，13例为异质性减弱，8例为保留表达。mRNA阳性的HCC中，均可见到P16蛋白表达。P16/CDKN2基因表达与HCC 的分级、分化及转移无关。28例HCC中共有6例出现CDK4蛋白阳性，这6例HCC均有不同程度的P16蛋白表达，提示CDK4蛋白表达可能是灭活P16 蛋白的又一途径。
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中图法分类号 R730， Q343.1， R392.11
Expression of P16/CDKN2 Gene in Primary Human Hepatocellular Carcinoma
Sun Baohua, Wu Zhongbi et al
Department of Ultrastructural Pathology, Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Wang Tao
Department of Internal Medicine, Wuhan Fourth Hospital, Wuhan 430022
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Abstract P16/CDKN2 gene encodes a 16KD cyclin kinase inhibitor (P16) which is a critical regulator of the cell cycle. Frequent deletion and mutation of this gene have been documented in different types of human tumors. Alteration of P16 protein expression in human tumors also have been reported. In this paper, the P16/cyclin-dependent kinase inhibitor 2 (P16/CDKN2) gene expression at mRNA level was detected by using in situ hybridization(ISH) in 28 cases of primary human hepatocellular carcinoma(HCC). Immunohistochemistry was also employed to detect the p16 and cyclin-dependent kinase 4(CDK4) protein expression. The results showed that 7 cases of HCC failed to express P16/CDKN2 mRNA, and 8 cases were almost homogenous labeling of all cells. The remaining 13 cases were found labeling of a variable proportion of cells. P16 protein expression was detectable in all cases positive for mRNA. P16/CDKN2 gene expression had no correlation to tumor grade, differentiation or metastasis. CDK4 protein were detected in 6 cases out of 28 cases of HCC. The 6 cases showed p16 protein positive to some extent. It suggests that the expression of CDK4 is an alternative mechanism of inactivation of p16 protein.
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Key words hepatocellular carcinoma; gene; p16; CDK4; in situ hybridization; immunohistochemistry
P16 基因也称为多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1, MTS1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制因子(cyclin-dependent kinase 4 inhibitor, CDK4I)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2(cyclin-dependent kinase inhibitor 2,CDKN2)、P16INK4A基因, 由美国盐湖城Kamb[1]和圣地亚哥的Noborl[2] 于1994 年同时报道，并预示其抑癌作用不亚于视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和P53，甚至比后两者更为重要。 P16 蛋白的氨基末端含有一个与细胞周期蛋白盒(cyclin box) 同源性序列，可与细胞周期蛋白D1(cyclin D1)竞争结合CDK4。P16 蛋白与CDK4 结合时，可阻止细胞从G1期进入S 期[3]， 从而影响细胞周期的进程，在抑制肿瘤形成中发挥重要作用。 P16 基因缺失或突变，会使P16蛋白抑制CDK4的作用消失，使细胞进入S 期，这样，细胞失去G1期检查点(check point), 就可能复制受损的DNA， 使细胞癌变潜能增加。
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本研究应用原位杂交及免疫组织化学等技术观察了28例原发性HCC 中P16 mRNA和蛋白的表达， 并探讨了P16基因表达与CDK4表达的关系，为研究HCC 的发病机理提供进一步的实验依据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
本研究共收集同济医科大学附属同济医院1995年手术切除的HCC标本28例。分别取癌组织及5例远离癌组织的非癌肝组织供检。28例中，男性23例， 女性5例， 年龄27岁至64岁，平均50.3岁。肿瘤组织包括14例低分化、9例中等分化和5例高分化肝细胞癌，其中2例有肝内转移，4例有肝外转移。根据TNM分级，2例Ⅰ级，13例Ⅱ级，8例Ⅲ级和5例Ⅳ级。所有标本均选自术前未经放疗、化疗，且无坏死的肿瘤组织。
1.2 原位杂交
全长的P16/MTS1 cDNA 探针由美国A. Kamb 教授惠赠。探针用地高辛标记及检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品)进行标记。按我们以前报道的方法[4]进行原位杂交。7 μm厚的40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织切片常规脱蜡、水化，0.2 N HCl预处理20 min，蛋白酶K(10 μg/ml) 37℃消化30 min，42℃预杂交2 h，杂交液中含探针2 μg/ml, 42℃杂交36 h，加入抗地高辛抗体(1:800)，37℃ 孵育1 h，NBT显色37℃ 3 h左右，典型切片加上不含探针的杂交液做阴性对照。
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1.3 免疫组化
兔抗人P16蛋白的多克隆抗体及抗人CDK4蛋白的单克隆抗体是Santa Cruz公司产品。SABC试剂盒购自武汉博士德公司。7 μm厚的40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织常规脱蜡、水化，在0.01 mol/L 柠檬酸钠溶液中94℃～96℃预处理10 min。1:30 稀释一抗。典型切片用PBS代替一抗作为阴性对照。
2 结果
2.1 原位杂交
28例HCC 中有21例(75%)为P16 mRNA 阳性表达，阳性信号主要分布在胞浆、为均匀分布的紫蓝色颗粒，细胞核内有少许阳性颗粒(图1)。 有的癌巢均呈阳性，有的癌巢部分细胞呈强阳性、另一部分细胞则呈弱阳性或阴性，显示P16 mRNA 在HCC 中的表达呈异质性。21例阳性表达的HCC中，低分化HCC 为9例(64%)，中等分化为8例(89%)，高分化为4例(80%)，提示P16 mRNA 在 HCC中的表达与HCC 的分化无关(P>0.05)。P16 mRNA表达在I-II级HCC 中的阳性率(80%)与III-IV级中阳性率(69%)差别无显著性意义(P>0.05), 与HCC转移、大小、HBV感染等无关。
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图1 P16基因原位杂交阳性信号主要分布在胞浆，有的癌巢均呈阳性(×200)
2.2 免疫组织化学
阳性信号为棕黄色颗粒，主要位于胞浆， 间质细胞未见表达。P16 蛋白阳性的HCC 中，有的癌巢中肿瘤细胞均呈阳性，有的癌巢中阳性细胞位于癌巢周边，而癌巢中央部分则无P16蛋白表达，有的癌巢中阳性细胞与一些细胞混杂，但阳性细胞的染色程度大体一致。CDK4阳性的HCC共6例，阳性细胞在癌巢中与阴性细胞混杂存在，阳性细胞之间染色程度不一(图2)。CDK4阳性的HCC 均显示P16蛋白阳性。
图2 CDK4免疫组化阳性的HCC,阳性细胞在癌巢中与阴性细胞混杂存在，阳性细胞之间染色程度不一(×200)
3 讨论
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细胞周期失控是细胞癌变的重要原因。细胞的生长过程总是处在增殖与抑制增殖的动态平衡之中。促增殖系统成分过度表达与抑制增殖系统成分的缺失或表达减弱都会使细胞增殖失控而导致恶变。哺乳动物细胞受损后，迅速引起细胞在G1和G2期的生长抑制。G1期抑制可使细胞在DNA合成之前有足够的时间修复受损的DNA。P16 蛋白与CDK4 结合时，可阻止细胞从G1期进入S 期[3]， 从而影响细胞周期的进程，在抑制肿瘤形成中发挥重要作用。研究证实，P16基因突变或缺失存在于多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中， 说明P16基因在许多人类肿瘤的发生、发展中起重要作用。我们发现：28例HCC中有21例(75%)呈P16基因阳性表达，说明P16基因失表达(loss of expression)只在部分HCC的发生中起作用。参与调控P16的基因很多，除基因缺失和突变外， Rb蛋白、P53 蛋白及TGFb、CDK4等也参与对P16蛋白表达和功能的调控[5]。由于正常功能的P53能诱导P21WAF1蛋白表达，后者阻止Rb蛋白磷酸化，使P16基因的转录被抑制，所以，P53对P16基因表达起负调控作用。已经证实，丧失P53功能的细胞其P16 mRNA水平较高。而在HCC中，P53基因突变较多，这可能是P16基因在HCC中表达较高的原因之一。另外，Rb蛋白能通过结合转录因子(E2F)而抑制P16蛋白表达[6,7],导致含正常Rb 蛋白的细胞中，不含或含极低的P16蛋白。在HCC中，Rb蛋白无明显表达，这可能是HCC中P16蛋白表达阳性率较高的又一原因。Otterson[7]等报道在肺癌中也有类似的发现。
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P16基因的改变可能与某些肿瘤的进展有关，表现为恶性程度高的肿瘤及转移性肿瘤中P16基因的改变高于恶性程度低的肿瘤中的改变。Schmidt等[8]发现星形细胞瘤中P16基因较少发生缺失,但间变型星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中则半数以上肿瘤有P16基因缺失。转移性非小细胞性肺癌中P16基因的改变高于非转移性非小细胞性肺癌中P16基因的改变。 Reed等研究不同阶段恶性黑色素瘤时发现,原位癌及早期浸润癌中均表达P16蛋白, 而72%有转移的肿瘤中有P16蛋白的部分或全部丢失。 本研究发现, P16蛋白部分及全部丢失与HCC 的分级、分化无关。虽然在有转移的HCC 中表达阴性率(50%)高于无转移的HCC中阴性率(18%), 但经统计学处理发现差异无显著性(P>0.05)。 因此, 我们认为, P16基因表达改变可能只与部分肿瘤的进展、转移有关。
CDK4是P16 蛋白发挥作用的首要因素。由于P16蛋白通过与CDK4 结合而发挥其抑制细胞周期的功能。CDK4基因扩增和表达增加能灭活P16蛋白的功能，Schmidt等发现25例无P16基因缺失的胶质母细胞瘤和间变型星形细胞瘤中，10例有CDK4扩增，而32例有P16缺失的胶质母细胞瘤中，只2例出现CDK4扩增。CDK4 过表达还可以使P16抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和转录因子E2F基因的转录减弱[9]。 P16阻滞Ha-ras 引起的促细胞进入S期的作用可被同时表达的无活性的CDK4抑制。我们发现，6例CDK4蛋白表达的HCC 中均可检测到P16蛋白,提示CDK4蛋白表达在HCC 中也可能起到灭活P16蛋白的作用。但Kitahara等[10]发现：CDK4 的表达只出现在P16蛋白阴性的食管癌细胞系中，说明CDK4蛋白的表达与P16蛋白表达关系非常复杂，可能与肿瘤的类型有关。
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作者简介:孙宝华，男，1968年生，医学博士
参 考 文 献
1 Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science,1994,264:436
2 Nobori T, Miura K, Wu D J et al. Deletion of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature,1994,368:753
3 Marx J. New tumor suppressor may rival P53. Science,1994,264:344
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4 Sun B H, Wu Z B, Yuan R B et al. P21WAF1 gene expression in primary human hepatocellular carcinoma and its relationship with p53 gene mutation. J of Tongji Med Univ, 1999，19:1
5 Florenes V A, Maelandsmo G M, Hovig E et al. CDKN2 gene inactivation and expression levels in sporadic human malignant melanomas. Relationship to the status of CDK4, CycllinD1 and pRb. Proc Am Assoc Can Res,1995,36:572
6 Shapiro G I, Rollins B J. P16 as a human tumor suppressor. Biochimica et Biophysica Acta,1996,1242:165
, 百拇医药
7 Otterson G A, Kratzke R A, Coxon A et al. Absence of p16 protein is restricted to the subset of lung cancer lines that retains wild type Rb. Oncogene, 1994,9:3375
8 Schmidt E E , Ichimura K, Reifen G et al. CDKN2 gene deletion or CDK4 amplification occurs in the majority of glioblastomas. Can Res,1994,54:6321
9 Schulze A, Zerfass K, Spitkovsky D et al. Activation of the E2F transcription factor by cyclinD1 is blocked by p16. Oncogene,1994,9:3475
10 Kitahara K, Yasui W, Yokozaki H et al. Expression of cyclinD1, CDK4, p27 is associated with the p16 gene status in human esophageal cancer cell lines. J Exp Ther Oncol, 1996,1:7
(1998-04-06 收稿), 百拇医药