筑巢式PCR等多项指标对小儿急性白血病微量残留病的监测
作者：谷仁凯 卢 洁 孙立荣 李学荣 庞秀英 董增义
单位：青岛医学院儿科研究所(青岛 2660 03)
关键词：白血病；微量残留病；聚合酶链反应；姐妹染色单体交换；儿童
青岛医学院990401 【摘 要】 ①目的 探讨采用筑巢式聚合酶链反应 (Nest-PCR)等多项指标监测小儿急性白血病(AL)微量残留病(MRD)的临床意义。②方法 对152例AL在形态学、免疫学和细胞遗传学(MIC)分型诊断的 基础上，结合Nest-PCR，姐妹染色单体交换(SCE)、染色体核型分析方法进行MRD监测。 ③结果 对58例急性淋巴细胞白血病(ALL)进行了T细胞受体(TC R)Vδ2Dδ3基因重排监测，其中83%的B-ALL和25%的T-ALL具有此基因重排，检测灵敏度 为10-5～10-6.对44例ALL进行了MRD动态监测，结果显示化疗期间PCR由阴性转 为阳性或持续阳性者，易引起骨髓复发、死亡。PCR转阴时间有明显个体差异性。持续完全 缓解3年以上的ALL病儿PCR持续阴性可作为停药治疗的可靠指标。对76例AL进行了SCE动态监 测，结果表明SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系。对61例AL进行了染色体核型动态 监测，结果表明初发AL染色体核型正常者亦有DNA严重损伤。④结论 在MIC分 型诊断的基础上，采用Nest-PCR，SCE，染色体核型分析等多项指标进行AL的MRD动态监 测、综合分析评价，对指导治疗、预测复发及判断预后更有临床意义。
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中国图书馆分类法分类号 R725.5
DYNAMIC DETECTION OF MINIMAL R ESIDUAL DISEASE IN
CHILDREN WITH ACUTE LEUKEMIA BY NEST-PCR
AND OTHER DET ECTING INDICES
Gu Renkai, Lu Jie, Sun Lirong, et al
Institute of Pediatrics, Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To explore the clinical significan ce of detecting minimal residual disease (MRD) in children with acute leu kemia (AL) by using the methods of nest-polymerize chain reaction (Nest-PC R) and other detecting indexes. MethodsBased on the morphological， immunological and cytogen etic (MIC) classification, Nest-Polymerize chain reaction (Nest-PCR), the frequency of the sister chromatic exchange (SCE) and the chromosome kar yotype analysis were used to detect MRD in 152 children with AL. Results Among the 58 cases with ALL, the positive rates of T cell receptor (TCR) Vδ2 Dδ3 gene rearrangement were 83% in B- ALL and 25% in T-ALL. The detecting sensitivities of MRD was 10-5 -10-6. The MRD in 44 of 58 patients with ALL was dynamically detected and the result showed that when PCR was converted into positive from negative or per sistent positive, death was possible because of the bone marrow relapse. The tim e of PCR from negative to positive had obviously individual difference. It shou ld be as an index of terminating chemotherapy that the MRD-PCR was pe rsistent negative in ALL children over 3 years of the continuous and complete r emission. The frequency of SCE of bone marrow cell was dynamically detect ed in 76 cases with AL and the result showed that there was a parallel rel ation between the frequency of SCE and the serious degree of the disease. Th e chromosome karyotype was dynamically analyzed in 61 cases with AL and the re sult showed that DNA in the initial AL cases with normal chromosome karyotype was also severely damaged. Conclusion Based on the typing and diagnosis of MIC, by using PCR ,SCE and chromosome karyotype analysis, dynamically detecting, analysing and evaluating generally MRD in AL children is of clinical significance in guiding treatment, predicting bone marrow relapse and evaluating prognosis.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 leukemia; minimal residual disease; polymer ase chain reaction; sister chromatic exchange; child
我们应用筑巢式聚合酶链反应(Nest-PCR)、姐妹染色单体交换(SCE)、染色体核型 分析、免疫分型及形态学分型相结合的方法，对152例小儿急性白血病(AL)进行了分型诊 断和微量残留病(MRD)动态监测的研究。从而探讨其对指导临床治疗、制订个体化治疗方 案，预测骨髓复发，决定终止化疗时间和判断预后的临床意义。现报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
1980年1月～1997年12月在我院就诊的AL病儿152例,男104例，女48例；年龄1～13岁，中位年 龄6岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)98例(L1型21例，L2型75例，L3型2例);急 性髓细胞白血病(AML)49例(AUL 2例，M1 7例，M2a 21例，M2b 6例，M 3a 7例，M4 3例，M5 2例，M6 1例);混合细胞性白血病(HAL)5例，按其形态 学分型为M1 2例、M2a 2例、M4 1例。
, 百拇医药
1.2 免疫学分型
标本取自骨髓，采用间接免疫荧光方法，以阳性细胞数>30%为阳性标准。
1.3 染色体制备与分析
染色体标本取自于骨髓，ALL经24h，AML经48～72h培养后按常规法收集细胞制片，经G显带 ，根据国际人类细胞遗传学命名法进行染色体中期分裂象核型分析。
1.4 SCE频率分析
经培养、制片、SCE分色和计数。镜检时每例分析20～50个分散良好的中期分裂象，计数 SCE频率(每个中期象和每条染色体)。
1.5 Nest-PCR检测
所用标本为ALL病儿的骨髓液或骨髓涂片，分别参照文献〔1,2〕方法提取骨髓液或骨髓涂片 中 的DNA，采用Nest-PCR技术扩增T细胞受体(TCR)Vδ2Dδ3基因重排片断〔3〕。所 用寡核苷酸引物序列如下。
, 百拇医药
外侧引物：
5′-TCA TCC ATC TCT CTC TCT TC-3′
5′-AAA TGC TAG CTA TTT CAC CCA-3′
内侧引物：
5′-GCA CCA TCA GAG AGA GAT GA-3′
5′-TTG TAG CAC TGT GCG TAT CC-3′
每次实验均设阳性、阴性对照，阳性对照来自诊断明确、具有TCRVδ2Dδ3基因重排ALL 病儿的骨髓DNA.阳性条带清晰、光亮;如条带弥漫或无特异性条带形成则为阴性。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
实验数据以±s表示，各组统计学处理采用秩和检验。
2 结 果
2.1 免疫学分型
139例AL进行了免疫学分型检查，其中81例为非T-ALL，按六型分类法〔4〕，BⅠ 型4例，BⅡ型6例，BⅢ型41例，BⅣ型26例，BⅤ型3例，BⅥ型1例；4例T-ALL 按三型分类法〔5〕，TⅡ型3例，TⅢ型1例;49例AML由于缺乏亚型的特异性McAb ，不能作出亚型分类;5例HAL分别为AML/BⅢ，AML/BⅣ，AML/BⅥ，AML/TⅡ，AML/T Ⅲ混合表型。
, 百拇医药
2.2 染色体分析
152例AL中,有149例进行了272例次的染色体检查。136例在确诊时进行了染色体检查，结果 为正常核型60例，异常核型76例(55.9%)，其中数目异常41例，结构异常20例，数目及结 构均异常15例。61例AL在发病过程中进行了染色体动态观察，共查染色体184例次。61例AL 中,ALL 41例，AML 18例及HAL 2例。41例ALL分为3组进行动态观察：①非T-ALL初发时染色 体核型正常组；②非T-ALL初发时染色体核型异常组；③T-ALL组。20例AML及HAL也分为3 组：①AML初发时染色体核型正常组；②AML初发时染色体核型异常组；③HAL组。结果显示 ，确诊时染色体核型正常的非T-ALL或AML分别比核型异常的非T-ALL或AML的完全缓解(CR )率高，中位存活期长，病死率低。非T-ALL伴有6q-核型者预后较好，伴有亚二倍体者预 后较差，AML伴有亚二倍体或t(8;21)并Y缺失者预后较差。
2.3 SCE频率分析
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76例病儿接受SCE检测，总共检测169例次。根据不同的临床转归将其分为3组：初发组、部 分缓解(PR)组、CR组。同时检测21例正常人作为对照组。各组SCE频率结果见表1.
表1 AL各组SCE频率检测结果(±s) 组 别
ALL-SCE频率
AML- SCE频率
n
每个中期象)/(
每条染色体
n
每个中期象
每条染色体
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1对照组
21
4.27±0.98
0.09±0.03
21
4.27±0.98
0.09±0.03
2初发组
50
9.06±3.27
0.19±0.07
26
, 百拇医药 10.00±7.14
0.22±0.18
3 PR组
10
8.93±1.74
0.19±0.04
6
8.13±2.25
0.18±0.05
4 CR组
66
5.29±2.23
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0.11±0.05
11
5.13±2.07
0.11±0.04
ALL:4组间比较,H=46.44, P<0.001; 组间两两比较：d1,2 =69.71, P<0 .001; d1,3=75.32, P<0.001; d2,4=50.35, P<0.01; d3,4=55.96, P<0.01.AML：4组间比较，H=29.58, P<0.001;组间两两比较：d1,2=2 8.59,P<0.0 1;d2,4=20.73,P<0.052.4 Nest-PCR检测
2.4.1 Nest-PCR检测结果 采用Nest-PCR对58例ALL进行了169例次TCRV δ2D δ3基因重排检测，经电泳分析阳性产物为80bp的DNA片断。58例ALL中有46例(79%)，41 例B-ALL中有34例(83%)，4例T-ALL中有1例(25%)检出克隆特异性TCRVδ2Dδ3基因重 排，B-ALL和T-ALL之间有极显著性差异(χ2=8.16，P<0.01)。58例ALL的Nest-PCR检测、MIC分型、SCE频率检测及临床转归结果见表2.
, 百拇医药
2.4.2 MRD动态检测结果 58例ALL中44例ALL进行了155例次的MRD 动态监测，实验灵敏度达10-5～10-6，监测结果见表2.结果显示：①9例ALL( 例2，5，19，29，36，43，45，48，49)于CR后PCR检测由阳性转为阴性，转阴时间为0.5～9 .2年，中位转阴时间4.1年。9例ALL中除3例病儿仍治疗外，其余6例均已停药观察，至今已 无病存活6.6～18.0年，中位存活期达10.5年。②6例ALL于CR后PCR由阳性转为弱阳性(例8， 1 0，16，44，46，51)，现均处于CR状态，存活期3.1～7.7年，中位存活期5.9年。③12例ALL (例4，6，7，12，14，17，28，31，40，42，47，50)PCR由阳性转为阴性或弱阳性，此后 又转为弱阳性或阳性，存活期1.5～9.0年，中位存活期4.7年，其中1例骨髓复发死亡。 ④14例ALL的PCR持续阳性(例1，3，9，11，13，15，18，25，26，27，32，34，39，5 2)，其中存活5年以下的11例ALL病儿，存活期0.8～4.5年，中位存活期2.3年，有4例骨髓复 发死亡;存活5年以上的3例ALL病儿，存活期分别为6.3，7.6，8.3年,PCR检测虽呈持续 阳性反应，但仍处于CR状态。⑤3例ALL(例22,37,53)初次TCR Vδ2Dδ3基因重排检测及PC R动态监测始终呈阴性反应，表明此3例ALL无TCR Vδ2Dδ3基因重排。
, 百拇医药
3 讨 论
3.1 SCE频率动态观察的临床意义
SCE是体细胞有丝分裂中姐妹染色单体相同位置之间的物质交换，其形成与DNA损伤修 复有密切关系。本组对76例AL进行了骨髓细胞SCE频率的动态观察分析，结果显示，初发组 、PR组SCE频率增高，与CR组比较差异有显著性，表明AL病儿治疗前骨髓细胞SCE水平的损伤 严重，反映了ALL可能存在着DNA损伤和修复机制的缺陷。CR组SCE频率仍高于对照组，但两 组间无显著性差异,表明DNA损伤需有一个逐步恢复的过程。
本组136例初发AL病儿中,染色体正常核型占44.1%,异常核型占55.9%.本组病儿无论 是否有染色体畸变，其SCE频率均明显增高，表明正常核型的AL病儿骨髓细胞虽无染色体异 常，但SCE水平的损伤已经显示出来。因此，SCE频率的动态观察分析比染色体核 型分析更为灵敏、简单、迅速，可作为AL病儿病情变化、指导治疗及判断预后的重要监测指标〔6〕。
, 百拇医药
表2 58例ALL病儿的MIC分型、SCE频率、PCR检测及临床转归 序号
性别
年龄(岁)
FAB
免疫
分型
染色体核型
SCE
(次/中期象)
PCR
检测
转归(t/a)
, 百拇医药
1
男
2
L1
BⅠ
46,XY/亚二倍体
+
存活(7.3 )
2
男
13
L1
BⅠ
, 百拇医药
46,XY
+
存活(9.8)
3
男
12
L1
BⅡ
46,XY/45,X,-Y
16.75
+
存活(6.0 )
, 百拇医药 4
女
12
L2
BⅢ
46,XX/超二倍体
6.84
+
存活(6.0 )
5
男
13
L2
, 百拇医药
BⅢ
46,XY
+
存活(8.9)
6
男
7
L2
BⅢ
46,XY
8.00
+
存活(6.1)
, 百拇医药
7
男
8
L2
BⅢ
46,XY/多倍体
12.73
+
存活(4.7 )
8
男
7
L2
, http://www.100md.com
BⅢ
46,XY
9.05
+
存活(2.8)
9
男
6
L2
BⅢ
46,XY
10.20
, 百拇医药 +
存活(2.3)
10
男
10
L2
BⅢ
46,XY/多倍体
12.40
+
存活(4.4)
11
男
, 百拇医药
6
L2
BⅢ
46,XY
+
死亡(4.5)
12
男
12
L2
BⅢ
46,XY/46,xy,del(12p-)
, 百拇医药
8.80
+
死亡(4.4 )
13
男
10
L1
BⅢ
46,XY
7.90
+
死亡(3.3)
14
, 百拇医药
女
10
L2
BⅢ
46,XX/多倍体
10.75
+
存活( 1.4)
15
男
4
L2
, 百拇医药 BⅢ
46,XY
8.60
+
存活(1.1)
16
女
9
L2
BⅢ
46,XX
8.40
+
, 百拇医药
存活(3.5)
17
男
13
L2
BⅢ
无分裂象
+
存活(0.7)
18
男
5
L2
, http://www.100md.com
BⅢ
46XY
8.50
+
存活(0.4)
19
男
8
L2
BⅢ
46,XY
10.50
, http://www.100md.com +
存活(0.5)
20
女
7
L2
BⅢ
46,XX
7.47
-
存活(3.3)
21
男
, 百拇医药
6
L2
BⅢ
46,XY
8.90
-
死亡(2.3)
22
男
7
L1
BⅢ
, 百拇医药
46,XY/超二倍体
9.50
-
死亡(2.3)
23
男
8
L2
BⅢ
无分裂象
-
存活(0.7)
24
, http://www.100md.com
男
13
L2
BⅣ
46,XY
5.50
+
存活(0.6)
25
男
3
L2
BⅣ
, 百拇医药
46,XX/亚二倍体
7.40
+
死亡(2.4)
26
女
5
L2
BⅣ
46,XX/亚二倍体
12.53
+
, 百拇医药 死亡(2.3)
27
女
8
L2
BⅣ
46,XX/亚二倍体
8.25
+
存活(3.8)
28
女
11
, 百拇医药
L2
BⅣ
46,XX/超二倍体
8.90
+
存活(2.8)
29
男
9
L2
BⅣ
46,XY
, 百拇医药
7.00
+
存活(3.1)
30
女
4
L2
BⅣ
46,XX/46,XX,-4+16
14.00
+
存活(1.6)
, http://www.100md.com 31
女
8
L2
BⅣ
46,XX
7.30
+
存活(1.4)
32
女
5
L2
, 百拇医药
BⅣ
46,XX/多倍体
19.00
+
存活(1.0)
33
女
8
L2
BⅣ
46,XX
9.47
, 百拇医药
+
存活(1.3)
34
男
6
L2
BⅣ
46,XY/多倍体
7.00
+
存活(0.9)
35
男
, 百拇医药
3
L2
BⅣ
46,XY
9.00
+
存活(0.7)
36
女
6
L2
BⅣ
, 百拇医药
46,XX
12.00
+
存活(0.5)
37
女
6
L2
BⅣ
46,XX
15.70
-
存活(3.7)
, 百拇医药
38
男
10
L2
BⅣ
46,XY
10.75
-
存活(2.6)
39
男
3
L2
, http://www.100md.com
BⅣ
46,XY/46,XY,6q-
7.20
+
存活(7.9)
40
男
8
L2
BⅤ
+
存活(1.2)
, http://www.100md.com
41
男
3
L1
BⅤ
10.50
+
存活(1.2)
42
女
8
L2
BⅤ
, 百拇医药
46,XX
+
存活(8.3)
43
男
6
L1
+
存活(10.4)
44
男
7
L1
, http://www.100md.com
46,XY
10.30
+
存活(7.3)
45
女
8
L2
46,XX
10.70
+
存活(6.3)
46
, 百拇医药
女
5
L1
46,XX
9.65
+
存活(6.7)
47
女
3
L1
46,XX/亚二倍体
+
, 百拇医药
存活(9.0)
48
男
6
L2
+
存活(17.7)
49
女
7
L2
46,XX
+
, 百拇医药
存活(16.9)
50
男
4
L2
46,XY3q
12.42
+
存活(4.6)
51
男
3
L1
, 百拇医药
+
存活(7.3)
52
男
7
L2
+
存活(0.8)
53
男
7
L1
-
, 百拇医药
存活(15.4)
54
男
7
L2
46,XY
-
存活(9.7)
55
男
4
L2
TⅡ
, 百拇医药
46,XY/46,XY,+21,-22/多倍体
7.50
+
死亡(0.6)
56
男
8
L2
TⅡ
46,XY
9.20
-
, http://www.100md.com
死亡(0.4)
57
男
10
L2
TⅡ
46,XY/多倍体
12.33
+
死亡( 3.8)
58
男
8
, 百拇医药
L2
TⅢ
46,XY
-
死亡(1.1)
3.2 MRD-PCR检测的临床意义
MRD是导致白血病复发的根源，PCR检测克隆特异性基因重排标志是最灵敏而特异的方法，并 认为绝大多数B系ALL有TCRδ基因重排。本文采用TCR Vδ2Dδ3基因重排特异性标志对58例A LL进行MRD的PCR检测，结果显示，83%的B-ALL和25%的T-ALL中有TCR Vδ2Dδ3重排，TCR Vδ2Dδ3重排在B-ALL中发生率高，T-ALL发生率低，与文献报道相一致〔7〕。
, http://www.100md.com
经本组PCR动态监测结果分析认为：①CR 3年以上的ALL病儿，MRD-PCR检测持续转阴可 作为停药治疗的可靠指标，如6例PCR检测转阴病儿，停止化疗后观察至今，已无病存活6.6 ～18.0年，中位存活期10.5年;②MRD-PCR转阴时间有明显个体差异性，9例病儿PCR转阴时 间为0.5～9.2年，中位转阴时间4.1年，这可能与病儿自身清除白血病细胞的能力及化疗强度 有关，提示应采用个体化的治疗方案;③维持及强化治疗期间MRD-PCR由阴性转为阳性或持 续阳性者，易引起骨髓复发死亡，本组5例病儿均在此期间死亡，提示预后较差；我们认为 此类病儿体内残留的恶性细胞克隆，具有较强的耐药性和增殖活性，应加强化疗强度或改用 更有效的化疗方案，使PCR尽快转阴，以防止骨髓复发;④本组MRD-PCR阳性长期无病存活 病儿，转归有两种可能性，一是有复发可能性;另一转归可能因残留白血病细胞本身或 增殖微环境因化疗而改变，失去增殖活性，多年后自然转为阴性〔8〕。
3.3 MRD-PCR，SCE，染色体分析的综合评价[ HT〗
, 百拇医药
Nest-PCR检测是一种高度灵敏和特异的分析方法,MRD检测可达10-5～10-6水平 。SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系，对预测骨髓复发有一定的临床价值。若Nest -PCR，SCE及染色体核型分析三者结合检测、综合分析评价，对指导临床治疗、制订个体化 治疗方案、预测复发、决定化疗终止时间和判断预后可能有更重要的临床实用价值。
本文为青岛市科委科研基金资助课题(批准号：青科计字 16号)
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(1999-04-13收稿 1999-07-19修回), 百拇医药
单位：青岛医学院儿科研究所(青岛 2660 03)
关键词：白血病；微量残留病；聚合酶链反应；姐妹染色单体交换；儿童
青岛医学院990401 【摘 要】 ①目的 探讨采用筑巢式聚合酶链反应 (Nest-PCR)等多项指标监测小儿急性白血病(AL)微量残留病(MRD)的临床意义。②方法 对152例AL在形态学、免疫学和细胞遗传学(MIC)分型诊断的 基础上，结合Nest-PCR，姐妹染色单体交换(SCE)、染色体核型分析方法进行MRD监测。 ③结果 对58例急性淋巴细胞白血病(ALL)进行了T细胞受体(TC R)Vδ2Dδ3基因重排监测，其中83%的B-ALL和25%的T-ALL具有此基因重排，检测灵敏度 为10-5～10-6.对44例ALL进行了MRD动态监测，结果显示化疗期间PCR由阴性转 为阳性或持续阳性者，易引起骨髓复发、死亡。PCR转阴时间有明显个体差异性。持续完全 缓解3年以上的ALL病儿PCR持续阴性可作为停药治疗的可靠指标。对76例AL进行了SCE动态监 测，结果表明SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系。对61例AL进行了染色体核型动态 监测，结果表明初发AL染色体核型正常者亦有DNA严重损伤。④结论 在MIC分 型诊断的基础上，采用Nest-PCR，SCE，染色体核型分析等多项指标进行AL的MRD动态监 测、综合分析评价，对指导治疗、预测复发及判断预后更有临床意义。
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中国图书馆分类法分类号 R725.5
DYNAMIC DETECTION OF MINIMAL R ESIDUAL DISEASE IN
CHILDREN WITH ACUTE LEUKEMIA BY NEST-PCR
AND OTHER DET ECTING INDICES
Gu Renkai, Lu Jie, Sun Lirong, et al
Institute of Pediatrics, Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【ABSTRACT】 Objective To explore the clinical significan ce of detecting minimal residual disease (MRD) in children with acute leu kemia (AL) by using the methods of nest-polymerize chain reaction (Nest-PC R) and other detecting indexes. MethodsBased on the morphological， immunological and cytogen etic (MIC) classification, Nest-Polymerize chain reaction (Nest-PCR), the frequency of the sister chromatic exchange (SCE) and the chromosome kar yotype analysis were used to detect MRD in 152 children with AL. Results Among the 58 cases with ALL, the positive rates of T cell receptor (TCR) Vδ2 Dδ3 gene rearrangement were 83% in B- ALL and 25% in T-ALL. The detecting sensitivities of MRD was 10-5 -10-6. The MRD in 44 of 58 patients with ALL was dynamically detected and the result showed that when PCR was converted into positive from negative or per sistent positive, death was possible because of the bone marrow relapse. The tim e of PCR from negative to positive had obviously individual difference. It shou ld be as an index of terminating chemotherapy that the MRD-PCR was pe rsistent negative in ALL children over 3 years of the continuous and complete r emission. The frequency of SCE of bone marrow cell was dynamically detect ed in 76 cases with AL and the result showed that there was a parallel rel ation between the frequency of SCE and the serious degree of the disease. Th e chromosome karyotype was dynamically analyzed in 61 cases with AL and the re sult showed that DNA in the initial AL cases with normal chromosome karyotype was also severely damaged. Conclusion Based on the typing and diagnosis of MIC, by using PCR ,SCE and chromosome karyotype analysis, dynamically detecting, analysing and evaluating generally MRD in AL children is of clinical significance in guiding treatment, predicting bone marrow relapse and evaluating prognosis.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 leukemia; minimal residual disease; polymer ase chain reaction; sister chromatic exchange; child
我们应用筑巢式聚合酶链反应(Nest-PCR)、姐妹染色单体交换(SCE)、染色体核型 分析、免疫分型及形态学分型相结合的方法，对152例小儿急性白血病(AL)进行了分型诊 断和微量残留病(MRD)动态监测的研究。从而探讨其对指导临床治疗、制订个体化治疗方 案，预测骨髓复发，决定终止化疗时间和判断预后的临床意义。现报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
1980年1月～1997年12月在我院就诊的AL病儿152例,男104例，女48例；年龄1～13岁，中位年 龄6岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)98例(L1型21例，L2型75例，L3型2例);急 性髓细胞白血病(AML)49例(AUL 2例，M1 7例，M2a 21例，M2b 6例，M 3a 7例，M4 3例，M5 2例，M6 1例);混合细胞性白血病(HAL)5例，按其形态 学分型为M1 2例、M2a 2例、M4 1例。
, 百拇医药
1.2 免疫学分型
标本取自骨髓，采用间接免疫荧光方法，以阳性细胞数>30%为阳性标准。
1.3 染色体制备与分析
染色体标本取自于骨髓，ALL经24h，AML经48～72h培养后按常规法收集细胞制片，经G显带 ，根据国际人类细胞遗传学命名法进行染色体中期分裂象核型分析。
1.4 SCE频率分析
经培养、制片、SCE分色和计数。镜检时每例分析20～50个分散良好的中期分裂象，计数 SCE频率(每个中期象和每条染色体)。
1.5 Nest-PCR检测
所用标本为ALL病儿的骨髓液或骨髓涂片，分别参照文献〔1,2〕方法提取骨髓液或骨髓涂片 中 的DNA，采用Nest-PCR技术扩增T细胞受体(TCR)Vδ2Dδ3基因重排片断〔3〕。所 用寡核苷酸引物序列如下。
, 百拇医药
外侧引物：
5′-TCA TCC ATC TCT CTC TCT TC-3′
5′-AAA TGC TAG CTA TTT CAC CCA-3′
内侧引物：
5′-GCA CCA TCA GAG AGA GAT GA-3′
5′-TTG TAG CAC TGT GCG TAT CC-3′
每次实验均设阳性、阴性对照，阳性对照来自诊断明确、具有TCRVδ2Dδ3基因重排ALL 病儿的骨髓DNA.阳性条带清晰、光亮;如条带弥漫或无特异性条带形成则为阴性。
1.6 统计学处理
, 百拇医药
实验数据以±s表示，各组统计学处理采用秩和检验。
2 结 果
2.1 免疫学分型
139例AL进行了免疫学分型检查，其中81例为非T-ALL，按六型分类法〔4〕，BⅠ 型4例，BⅡ型6例，BⅢ型41例，BⅣ型26例，BⅤ型3例，BⅥ型1例；4例T-ALL 按三型分类法〔5〕，TⅡ型3例，TⅢ型1例;49例AML由于缺乏亚型的特异性McAb ，不能作出亚型分类;5例HAL分别为AML/BⅢ，AML/BⅣ，AML/BⅥ，AML/TⅡ，AML/T Ⅲ混合表型。
, 百拇医药
2.2 染色体分析
152例AL中,有149例进行了272例次的染色体检查。136例在确诊时进行了染色体检查，结果 为正常核型60例，异常核型76例(55.9%)，其中数目异常41例，结构异常20例，数目及结 构均异常15例。61例AL在发病过程中进行了染色体动态观察，共查染色体184例次。61例AL 中,ALL 41例，AML 18例及HAL 2例。41例ALL分为3组进行动态观察：①非T-ALL初发时染色 体核型正常组；②非T-ALL初发时染色体核型异常组；③T-ALL组。20例AML及HAL也分为3 组：①AML初发时染色体核型正常组；②AML初发时染色体核型异常组；③HAL组。结果显示 ，确诊时染色体核型正常的非T-ALL或AML分别比核型异常的非T-ALL或AML的完全缓解(CR )率高，中位存活期长，病死率低。非T-ALL伴有6q-核型者预后较好，伴有亚二倍体者预 后较差，AML伴有亚二倍体或t(8;21)并Y缺失者预后较差。
2.3 SCE频率分析
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76例病儿接受SCE检测，总共检测169例次。根据不同的临床转归将其分为3组：初发组、部 分缓解(PR)组、CR组。同时检测21例正常人作为对照组。各组SCE频率结果见表1.
表1 AL各组SCE频率检测结果(±s) 组 别
ALL-SCE频率
AML- SCE频率
n
每个中期象)/(
每条染色体
n
每个中期象
每条染色体
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1对照组
21
4.27±0.98
0.09±0.03
21
4.27±0.98
0.09±0.03
2初发组
50
9.06±3.27
0.19±0.07
26
, 百拇医药 10.00±7.14
0.22±0.18
3 PR组
10
8.93±1.74
0.19±0.04
6
8.13±2.25
0.18±0.05
4 CR组
66
5.29±2.23
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0.11±0.05
11
5.13±2.07
0.11±0.04
ALL:4组间比较,H=46.44, P<0.001; 组间两两比较：d1,2 =69.71, P<0 .001; d1,3=75.32, P<0.001; d2,4=50.35, P<0.01; d3,4=55.96, P<0.01.AML：4组间比较，H=29.58, P<0.001;组间两两比较：d1,2=2 8.59,P<0.0 1;d2,4=20.73,P<0.052.4 Nest-PCR检测
2.4.1 Nest-PCR检测结果 采用Nest-PCR对58例ALL进行了169例次TCRV δ2D δ3基因重排检测，经电泳分析阳性产物为80bp的DNA片断。58例ALL中有46例(79%)，41 例B-ALL中有34例(83%)，4例T-ALL中有1例(25%)检出克隆特异性TCRVδ2Dδ3基因重 排，B-ALL和T-ALL之间有极显著性差异(χ2=8.16，P<0.01)。58例ALL的Nest-PCR检测、MIC分型、SCE频率检测及临床转归结果见表2.
, 百拇医药
2.4.2 MRD动态检测结果 58例ALL中44例ALL进行了155例次的MRD 动态监测，实验灵敏度达10-5～10-6，监测结果见表2.结果显示：①9例ALL( 例2，5，19，29，36，43，45，48，49)于CR后PCR检测由阳性转为阴性，转阴时间为0.5～9 .2年，中位转阴时间4.1年。9例ALL中除3例病儿仍治疗外，其余6例均已停药观察，至今已 无病存活6.6～18.0年，中位存活期达10.5年。②6例ALL于CR后PCR由阳性转为弱阳性(例8， 1 0，16，44，46，51)，现均处于CR状态，存活期3.1～7.7年，中位存活期5.9年。③12例ALL (例4，6，7，12，14，17，28，31，40，42，47，50)PCR由阳性转为阴性或弱阳性，此后 又转为弱阳性或阳性，存活期1.5～9.0年，中位存活期4.7年，其中1例骨髓复发死亡。 ④14例ALL的PCR持续阳性(例1，3，9，11，13，15，18，25，26，27，32，34，39，5 2)，其中存活5年以下的11例ALL病儿，存活期0.8～4.5年，中位存活期2.3年，有4例骨髓复 发死亡;存活5年以上的3例ALL病儿，存活期分别为6.3，7.6，8.3年,PCR检测虽呈持续 阳性反应，但仍处于CR状态。⑤3例ALL(例22,37,53)初次TCR Vδ2Dδ3基因重排检测及PC R动态监测始终呈阴性反应，表明此3例ALL无TCR Vδ2Dδ3基因重排。
, 百拇医药
3 讨 论
3.1 SCE频率动态观察的临床意义
SCE是体细胞有丝分裂中姐妹染色单体相同位置之间的物质交换，其形成与DNA损伤修 复有密切关系。本组对76例AL进行了骨髓细胞SCE频率的动态观察分析，结果显示，初发组 、PR组SCE频率增高，与CR组比较差异有显著性，表明AL病儿治疗前骨髓细胞SCE水平的损伤 严重，反映了ALL可能存在着DNA损伤和修复机制的缺陷。CR组SCE频率仍高于对照组，但两 组间无显著性差异,表明DNA损伤需有一个逐步恢复的过程。
本组136例初发AL病儿中,染色体正常核型占44.1%,异常核型占55.9%.本组病儿无论 是否有染色体畸变，其SCE频率均明显增高，表明正常核型的AL病儿骨髓细胞虽无染色体异 常，但SCE水平的损伤已经显示出来。因此，SCE频率的动态观察分析比染色体核 型分析更为灵敏、简单、迅速，可作为AL病儿病情变化、指导治疗及判断预后的重要监测指标〔6〕。
, 百拇医药
表2 58例ALL病儿的MIC分型、SCE频率、PCR检测及临床转归 序号
性别
年龄(岁)
FAB
免疫
分型
染色体核型
SCE
(次/中期象)
PCR
检测
转归(t/a)
, 百拇医药
1
男
2
L1
BⅠ
46,XY/亚二倍体
+
存活(7.3 )
2
男
13
L1
BⅠ
, 百拇医药
46,XY
+
存活(9.8)
3
男
12
L1
BⅡ
46,XY/45,X,-Y
16.75
+
存活(6.0 )
, 百拇医药 4
女
12
L2
BⅢ
46,XX/超二倍体
6.84
+
存活(6.0 )
5
男
13
L2
, 百拇医药
BⅢ
46,XY
+
存活(8.9)
6
男
7
L2
BⅢ
46,XY
8.00
+
存活(6.1)
, 百拇医药
7
男
8
L2
BⅢ
46,XY/多倍体
12.73
+
存活(4.7 )
8
男
7
L2
, http://www.100md.com
BⅢ
46,XY
9.05
+
存活(2.8)
9
男
6
L2
BⅢ
46,XY
10.20
, 百拇医药 +
存活(2.3)
10
男
10
L2
BⅢ
46,XY/多倍体
12.40
+
存活(4.4)
11
男
, 百拇医药
6
L2
BⅢ
46,XY
+
死亡(4.5)
12
男
12
L2
BⅢ
46,XY/46,xy,del(12p-)
, 百拇医药
8.80
+
死亡(4.4 )
13
男
10
L1
BⅢ
46,XY
7.90
+
死亡(3.3)
14
, 百拇医药
女
10
L2
BⅢ
46,XX/多倍体
10.75
+
存活( 1.4)
15
男
4
L2
, 百拇医药 BⅢ
46,XY
8.60
+
存活(1.1)
16
女
9
L2
BⅢ
46,XX
8.40
+
, 百拇医药
存活(3.5)
17
男
13
L2
BⅢ
无分裂象
+
存活(0.7)
18
男
5
L2
, http://www.100md.com
BⅢ
46XY
8.50
+
存活(0.4)
19
男
8
L2
BⅢ
46,XY
10.50
, http://www.100md.com +
存活(0.5)
20
女
7
L2
BⅢ
46,XX
7.47
-
存活(3.3)
21
男
, 百拇医药
6
L2
BⅢ
46,XY
8.90
-
死亡(2.3)
22
男
7
L1
BⅢ
, 百拇医药
46,XY/超二倍体
9.50
-
死亡(2.3)
23
男
8
L2
BⅢ
无分裂象
-
存活(0.7)
24
, http://www.100md.com
男
13
L2
BⅣ
46,XY
5.50
+
存活(0.6)
25
男
3
L2
BⅣ
, 百拇医药
46,XX/亚二倍体
7.40
+
死亡(2.4)
26
女
5
L2
BⅣ
46,XX/亚二倍体
12.53
+
, 百拇医药 死亡(2.3)
27
女
8
L2
BⅣ
46,XX/亚二倍体
8.25
+
存活(3.8)
28
女
11
, 百拇医药
L2
BⅣ
46,XX/超二倍体
8.90
+
存活(2.8)
29
男
9
L2
BⅣ
46,XY
, 百拇医药
7.00
+
存活(3.1)
30
女
4
L2
BⅣ
46,XX/46,XX,-4+16
14.00
+
存活(1.6)
, http://www.100md.com 31
女
8
L2
BⅣ
46,XX
7.30
+
存活(1.4)
32
女
5
L2
, 百拇医药
BⅣ
46,XX/多倍体
19.00
+
存活(1.0)
33
女
8
L2
BⅣ
46,XX
9.47
, 百拇医药
+
存活(1.3)
34
男
6
L2
BⅣ
46,XY/多倍体
7.00
+
存活(0.9)
35
男
, 百拇医药
3
L2
BⅣ
46,XY
9.00
+
存活(0.7)
36
女
6
L2
BⅣ
, 百拇医药
46,XX
12.00
+
存活(0.5)
37
女
6
L2
BⅣ
46,XX
15.70
-
存活(3.7)
, 百拇医药
38
男
10
L2
BⅣ
46,XY
10.75
-
存活(2.6)
39
男
3
L2
, http://www.100md.com
BⅣ
46,XY/46,XY,6q-
7.20
+
存活(7.9)
40
男
8
L2
BⅤ
+
存活(1.2)
, http://www.100md.com
41
男
3
L1
BⅤ
10.50
+
存活(1.2)
42
女
8
L2
BⅤ
, 百拇医药
46,XX
+
存活(8.3)
43
男
6
L1
+
存活(10.4)
44
男
7
L1
, http://www.100md.com
46,XY
10.30
+
存活(7.3)
45
女
8
L2
46,XX
10.70
+
存活(6.3)
46
, 百拇医药
女
5
L1
46,XX
9.65
+
存活(6.7)
47
女
3
L1
46,XX/亚二倍体
+
, 百拇医药
存活(9.0)
48
男
6
L2
+
存活(17.7)
49
女
7
L2
46,XX
+
, 百拇医药
存活(16.9)
50
男
4
L2
46,XY3q
12.42
+
存活(4.6)
51
男
3
L1
, 百拇医药
+
存活(7.3)
52
男
7
L2
+
存活(0.8)
53
男
7
L1
-
, 百拇医药
存活(15.4)
54
男
7
L2
46,XY
-
存活(9.7)
55
男
4
L2
TⅡ
, 百拇医药
46,XY/46,XY,+21,-22/多倍体
7.50
+
死亡(0.6)
56
男
8
L2
TⅡ
46,XY
9.20
-
, http://www.100md.com
死亡(0.4)
57
男
10
L2
TⅡ
46,XY/多倍体
12.33
+
死亡( 3.8)
58
男
8
, 百拇医药
L2
TⅢ
46,XY
-
死亡(1.1)
3.2 MRD-PCR检测的临床意义
MRD是导致白血病复发的根源，PCR检测克隆特异性基因重排标志是最灵敏而特异的方法，并 认为绝大多数B系ALL有TCRδ基因重排。本文采用TCR Vδ2Dδ3基因重排特异性标志对58例A LL进行MRD的PCR检测，结果显示，83%的B-ALL和25%的T-ALL中有TCR Vδ2Dδ3重排，TCR Vδ2Dδ3重排在B-ALL中发生率高，T-ALL发生率低，与文献报道相一致〔7〕。
, http://www.100md.com
经本组PCR动态监测结果分析认为：①CR 3年以上的ALL病儿，MRD-PCR检测持续转阴可 作为停药治疗的可靠指标，如6例PCR检测转阴病儿，停止化疗后观察至今，已无病存活6.6 ～18.0年，中位存活期10.5年;②MRD-PCR转阴时间有明显个体差异性，9例病儿PCR转阴时 间为0.5～9.2年，中位转阴时间4.1年，这可能与病儿自身清除白血病细胞的能力及化疗强度 有关，提示应采用个体化的治疗方案;③维持及强化治疗期间MRD-PCR由阴性转为阳性或持 续阳性者，易引起骨髓复发死亡，本组5例病儿均在此期间死亡，提示预后较差；我们认为 此类病儿体内残留的恶性细胞克隆，具有较强的耐药性和增殖活性，应加强化疗强度或改用 更有效的化疗方案，使PCR尽快转阴，以防止骨髓复发;④本组MRD-PCR阳性长期无病存活 病儿，转归有两种可能性，一是有复发可能性;另一转归可能因残留白血病细胞本身或 增殖微环境因化疗而改变，失去增殖活性，多年后自然转为阴性〔8〕。
3.3 MRD-PCR，SCE，染色体分析的综合评价[ HT〗
, 百拇医药
Nest-PCR检测是一种高度灵敏和特异的分析方法,MRD检测可达10-5～10-6水平 。SCE频率变化与疾病的严重程度呈平行关系，对预测骨髓复发有一定的临床价值。若Nest -PCR，SCE及染色体核型分析三者结合检测、综合分析评价，对指导临床治疗、制订个体化 治疗方案、预测复发、决定化疗终止时间和判断预后可能有更重要的临床实用价值。
本文为青岛市科委科研基金资助课题(批准号：青科计字 16号)
参考文献
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(1999-04-13收稿 1999-07-19修回), 百拇医药