不敏感肿瘤细胞GLC与其凋亡的关系
作者：吕长兴 杨伟志 董秀癑 殷蔚伯
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990423 以往对肿瘤细胞群体辐射效应的评估，主要着眼于克隆源性细胞存活的观察，即通过测定细胞存活份数来评估放射反应。放射诱导凋亡对细胞存活份数降低所起的作用至今尚不清楚。作者采用人肺腺癌GLC细胞系为材料研究放射诱导GLC细胞凋亡与存活份数降低的关系并探讨其对放射敏感性的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养：人肺腺癌GLC细胞呈单层贴壁生长，培养液为含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，其中含青霉素和链霉素各0.1g/L，置5%CO2的37℃培养箱内培养。
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1.2 照射条件：将指数生长期细胞置于室温下，采用Philips SL-10 8MVX射线照射，射野10cm×10cm，源皮距100cm，剂量率400cGy/min。照射剂量：存活曲线为0，1，2，3，4，6，8，10Gy；凋亡实验为0，4，6，8，10，16Gy。
1.3 电子显微镜观察：各实验组随机选择经流式仪测定有明显凋亡率的剂量点细胞进行电镜观察，用质量浓度为2.5g/L胰酶和0.2 g/L EDTA1∶1混合液消化细胞，PBS洗2遍后，用体积分数为0.025戊二醛预固定，然后用体积分数为0.01锇酸固定1小时，环氧树脂Epon 812包埋，MT-6000型超薄切片机切片，醋酸铀和枸椽酸铅双染色，用Philips EM-410透射电子显微镜观察。
1.4 细胞凋亡流式分析：将受照射细胞分别于照射后0，2，6，8，12，24小时消化成单细胞，用体积分数为0.75冷乙醇固定，-20℃保存。测试前用PBS洗2遍，滤膜过滤，加1mL PBS，避光再加入碘化丙啶(PI)染液200μL(PI 0.05 g/L，RNA酶0.01 g/L，体积分数为0.005 Triton X-100，枸椽酸钠1 g/L，按4∶4∶1∶4配制)，染色30分钟后检测(美国coulter流式细胞仪)，用Multicycle凋亡分析软件进行凋亡率测定。
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1.5 细胞存活曲线：将照射后细胞立即消化成单细胞悬液计数，逐级稀释，按照射剂量接种不同数目细胞，培养14天后，无水乙醇固定，结晶紫染色，计数≥50个细胞的集落，计算贴壁率(PE)及存活率，实验数据按多击单靶模型，即S＝1-[1-exp(-D/D0)]N拟合曲线。
2 结果
2.1 不同照射剂量的GLC细胞凋亡率：流式细胞仪测定的不同剂量照射后6小时的凋亡率结果显示：照射剂量0，4，6，8，10，16Gy的凋亡率分别为0.0%，0.4%，1.1%，1.2%，1.5%，1.5%。随照射剂量的加大GLC细胞凋亡率增加，10Gy时达到稳定。流式细胞仪定量检测细胞凋亡是较好方法之一，当细胞出现凋亡时其细胞内核酸内切酶活化，使DNA降解为180bp倍数的片段，流式细胞周期分布图上G1期峰前出现一亚二倍体Ap峰，即凋亡峰，如图1所示。电镜是定性直观细胞凋亡的有用方法，图2示8Gy照射后6小时GLC细胞凋亡的电镜形态，显示细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧，核碎裂，细胞浆和细胞器密度增高，细胞体积变小。
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图1 8Gy照射后6小时GLC细胞凋亡(FCM)
图2 照射后GLC细胞凋亡电镜下的形态学表现(×7100)
2.2 照射后不同时间GLC细胞凋亡率：单次照射8Gy后0，2，6，8，12，24小时的凋亡率分别为0.6%，1.0%，1.2%，2.1%，2.0%。GLC细胞的凋亡率随照射后时间的延长而增加，12小时达到饱和，但照射诱发GLC细胞凋亡率较低，最高时(照射后12小时)仅为2.1%。
2.3 GLC细胞凋亡与细胞存活份数的关系：由单靶多击模型计算的D0值为1.88Gy，N值为2.46，Dq值为1.69Gy。照射后细胞存活曲线及照射后6小时GLC细胞凋亡后的存活情况，见图3。
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图3 不同死亡形式贡献的GLC
细胞剂量效应曲线
图中可见，照射后GLC克隆源性细胞存活能力的下降要比其放射诱导细胞凋亡敏感得多，如10Gy照射后克隆源性细胞存活份数降低到0.018，而此剂量时的放射诱导细胞凋亡贡献的存活水平几乎与对照组水平相同，表明GLC细胞凋亡率与克隆源性细胞存活份数间无直接对应关系。
3 讨论
细胞凋亡是近年来肿瘤学研究中的新热点。肿瘤自发的和(或)诱发的细胞凋亡水平与肿瘤发生、发展和自然消退及治疗密切相关。最近研究提示辐射诱导凋亡的水平与克隆源性细胞存活份数降低及肿瘤生长延缓相关。
非小细胞肺癌占肺癌的80%左右，它是肺癌治疗的重点对象，确诊时多数患者已失去手术机会，只能采用放射治疗或化疗，因此，作者以肺腺癌细胞系研究照射与凋亡关系有一定意义。
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实验结果显示GLC细胞系对辐射较为抗拒，照射后所诱发凋亡率亦很低，8Gy照射后12小时凋亡率仅为2.1%，且照射后凋亡的增加幅度与照射剂量和照射后时间有关。10Gy以下的范围内，随照射剂量增加凋亡增加，但幅度较小，可能与细胞群中凋亡易感细胞所占比例有关。凋亡易感细胞在低剂量时即可死亡，凋亡性杀灭达饱和后，增加照射剂量引起凋亡增加的作用降低。在离体细胞培养体系中，凋亡细胞不能被及时清除，因而，随照射后时间延长凋亡增加。另外，GLC细胞系受8Gy照射后其凋亡比例在6～24小时内达峰值并稳定，如再延长培养时间，因细胞贴壁密度增加、营养缺乏等原因造成的坏死可能会影响实验结果。
照射后细胞的死亡有两种形式：增殖性死亡和凋亡。前者以细胞存活曲线为代表，曲线斜率的倒数(D0)值代表了细胞的放射敏感性。但D0值相近的肿瘤受照射后消退时间可以相差很大，因而寻找其它一些补充放射敏感性的指标很有必要。近年研究表明，在整个细胞群中，照射后以凋亡形式死亡的细胞所占比例对放射敏感性有较大影响，这一比例越高，放射敏感性越高。淋巴造血系统来源的瘤株，自发凋亡明显，照射后凋亡细胞比例大，其放射敏感性高，一些实体瘤受照射后凋亡比例小，放射敏感性低。本实验结果也证实了这一点，结果显示GLC细胞在8Gy照射后的总凋亡率仅为8.1%，这或许也是人体肺腺癌对放射较为抗拒的原因之一。
克隆源性细胞存活份数是放射生物学的一个重要参数，比较放射诱导GLC细胞凋亡与克隆源性细胞存活的关系有助于阐明细胞凋亡在放射治疗中的作用。本研究结果表明GLC细胞就放射诱导凋亡而言是相对不敏感的。从图3可见，在低剂量照射时GLC克隆源性细胞存活份数已有明显的下降，而凋亡水平变化较小，提示细胞凋亡和克隆源性存活分别代表了各自的死亡途径，这与国内外作者的观点一致。测定辐射诱导GLC细胞的凋亡率对预测其放射敏感性具有一定的参考价值，放射与增加细胞凋亡的措施相结合，或许是提高肺腺癌疗效的途径之一。
收稿：1998-12-28 修回：1999-06-17, 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院放射治疗科
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990423 以往对肿瘤细胞群体辐射效应的评估，主要着眼于克隆源性细胞存活的观察，即通过测定细胞存活份数来评估放射反应。放射诱导凋亡对细胞存活份数降低所起的作用至今尚不清楚。作者采用人肺腺癌GLC细胞系为材料研究放射诱导GLC细胞凋亡与存活份数降低的关系并探讨其对放射敏感性的影响。
1 材料和方法
1.1 细胞培养：人肺腺癌GLC细胞呈单层贴壁生长，培养液为含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，其中含青霉素和链霉素各0.1g/L，置5%CO2的37℃培养箱内培养。
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1.2 照射条件：将指数生长期细胞置于室温下，采用Philips SL-10 8MVX射线照射，射野10cm×10cm，源皮距100cm，剂量率400cGy/min。照射剂量：存活曲线为0，1，2，3，4，6，8，10Gy；凋亡实验为0，4，6，8，10，16Gy。
1.3 电子显微镜观察：各实验组随机选择经流式仪测定有明显凋亡率的剂量点细胞进行电镜观察，用质量浓度为2.5g/L胰酶和0.2 g/L EDTA1∶1混合液消化细胞，PBS洗2遍后，用体积分数为0.025戊二醛预固定，然后用体积分数为0.01锇酸固定1小时，环氧树脂Epon 812包埋，MT-6000型超薄切片机切片，醋酸铀和枸椽酸铅双染色，用Philips EM-410透射电子显微镜观察。
1.4 细胞凋亡流式分析：将受照射细胞分别于照射后0，2，6，8，12，24小时消化成单细胞，用体积分数为0.75冷乙醇固定，-20℃保存。测试前用PBS洗2遍，滤膜过滤，加1mL PBS，避光再加入碘化丙啶(PI)染液200μL(PI 0.05 g/L，RNA酶0.01 g/L，体积分数为0.005 Triton X-100，枸椽酸钠1 g/L，按4∶4∶1∶4配制)，染色30分钟后检测(美国coulter流式细胞仪)，用Multicycle凋亡分析软件进行凋亡率测定。
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1.5 细胞存活曲线：将照射后细胞立即消化成单细胞悬液计数，逐级稀释，按照射剂量接种不同数目细胞，培养14天后，无水乙醇固定，结晶紫染色，计数≥50个细胞的集落，计算贴壁率(PE)及存活率，实验数据按多击单靶模型，即S＝1-[1-exp(-D/D0)]N拟合曲线。
2 结果
2.1 不同照射剂量的GLC细胞凋亡率：流式细胞仪测定的不同剂量照射后6小时的凋亡率结果显示：照射剂量0，4，6，8，10，16Gy的凋亡率分别为0.0%，0.4%，1.1%，1.2%，1.5%，1.5%。随照射剂量的加大GLC细胞凋亡率增加，10Gy时达到稳定。流式细胞仪定量检测细胞凋亡是较好方法之一，当细胞出现凋亡时其细胞内核酸内切酶活化，使DNA降解为180bp倍数的片段，流式细胞周期分布图上G1期峰前出现一亚二倍体Ap峰，即凋亡峰，如图1所示。电镜是定性直观细胞凋亡的有用方法，图2示8Gy照射后6小时GLC细胞凋亡的电镜形态，显示细胞核固缩，染色体边集在核膜内侧，核碎裂，细胞浆和细胞器密度增高，细胞体积变小。
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图1 8Gy照射后6小时GLC细胞凋亡(FCM)
图2 照射后GLC细胞凋亡电镜下的形态学表现(×7100)
2.2 照射后不同时间GLC细胞凋亡率：单次照射8Gy后0，2，6，8，12，24小时的凋亡率分别为0.6%，1.0%，1.2%，2.1%，2.0%。GLC细胞的凋亡率随照射后时间的延长而增加，12小时达到饱和，但照射诱发GLC细胞凋亡率较低，最高时(照射后12小时)仅为2.1%。
2.3 GLC细胞凋亡与细胞存活份数的关系：由单靶多击模型计算的D0值为1.88Gy，N值为2.46，Dq值为1.69Gy。照射后细胞存活曲线及照射后6小时GLC细胞凋亡后的存活情况，见图3。
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图3 不同死亡形式贡献的GLC
细胞剂量效应曲线
图中可见，照射后GLC克隆源性细胞存活能力的下降要比其放射诱导细胞凋亡敏感得多，如10Gy照射后克隆源性细胞存活份数降低到0.018，而此剂量时的放射诱导细胞凋亡贡献的存活水平几乎与对照组水平相同，表明GLC细胞凋亡率与克隆源性细胞存活份数间无直接对应关系。
3 讨论
细胞凋亡是近年来肿瘤学研究中的新热点。肿瘤自发的和(或)诱发的细胞凋亡水平与肿瘤发生、发展和自然消退及治疗密切相关。最近研究提示辐射诱导凋亡的水平与克隆源性细胞存活份数降低及肿瘤生长延缓相关。
非小细胞肺癌占肺癌的80%左右，它是肺癌治疗的重点对象，确诊时多数患者已失去手术机会，只能采用放射治疗或化疗，因此，作者以肺腺癌细胞系研究照射与凋亡关系有一定意义。
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实验结果显示GLC细胞系对辐射较为抗拒，照射后所诱发凋亡率亦很低，8Gy照射后12小时凋亡率仅为2.1%，且照射后凋亡的增加幅度与照射剂量和照射后时间有关。10Gy以下的范围内，随照射剂量增加凋亡增加，但幅度较小，可能与细胞群中凋亡易感细胞所占比例有关。凋亡易感细胞在低剂量时即可死亡，凋亡性杀灭达饱和后，增加照射剂量引起凋亡增加的作用降低。在离体细胞培养体系中，凋亡细胞不能被及时清除，因而，随照射后时间延长凋亡增加。另外，GLC细胞系受8Gy照射后其凋亡比例在6～24小时内达峰值并稳定，如再延长培养时间，因细胞贴壁密度增加、营养缺乏等原因造成的坏死可能会影响实验结果。
照射后细胞的死亡有两种形式：增殖性死亡和凋亡。前者以细胞存活曲线为代表，曲线斜率的倒数(D0)值代表了细胞的放射敏感性。但D0值相近的肿瘤受照射后消退时间可以相差很大，因而寻找其它一些补充放射敏感性的指标很有必要。近年研究表明，在整个细胞群中，照射后以凋亡形式死亡的细胞所占比例对放射敏感性有较大影响，这一比例越高，放射敏感性越高。淋巴造血系统来源的瘤株，自发凋亡明显，照射后凋亡细胞比例大，其放射敏感性高，一些实体瘤受照射后凋亡比例小，放射敏感性低。本实验结果也证实了这一点，结果显示GLC细胞在8Gy照射后的总凋亡率仅为8.1%，这或许也是人体肺腺癌对放射较为抗拒的原因之一。
克隆源性细胞存活份数是放射生物学的一个重要参数，比较放射诱导GLC细胞凋亡与克隆源性细胞存活的关系有助于阐明细胞凋亡在放射治疗中的作用。本研究结果表明GLC细胞就放射诱导凋亡而言是相对不敏感的。从图3可见，在低剂量照射时GLC克隆源性细胞存活份数已有明显的下降，而凋亡水平变化较小，提示细胞凋亡和克隆源性存活分别代表了各自的死亡途径，这与国内外作者的观点一致。测定辐射诱导GLC细胞的凋亡率对预测其放射敏感性具有一定的参考价值，放射与增加细胞凋亡的措施相结合，或许是提高肺腺癌疗效的途径之一。
收稿：1998-12-28 修回：1999-06-17, 百拇医药