丙烯腈染毒对大鼠肝脏钙稳态某些指标的影响
作者：张正东 金复生 王心如 周建伟 高素琴 金锡鹏
单位：张正东(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));王心如(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));周建伟(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));高素琴(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));金复生(上海医科大学附属金山医院职防科);金锡鹏(上海医科大学公共卫生学院)
关键词：丙烯腈 ATPase 磷酸化酶a 钙稳态 大鼠肝脏
卫生毒理学杂志000405 摘要 本研究观察了丙烯腈对大鼠肝脏Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Na+/K+-ATPase和磷酸化酶a(P-a)活性的影响，探讨其对大鼠肝脏钙稳态的影响。结果表明，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，各ATPase活性均逐渐降低，而P-a的活性却逐渐升高(P<0.01)，其中高剂量(50 mg/kg)组的各观察时段和染毒42天时各染毒组酶活性的变化均具有显著性意义(P<0.05)，并具有较好的剂量-反应关系(P<0.01)。结果提示，丙烯腈可影响大鼠肝脏钙稳态某些指标变化，并可能导致肝脏钙稳态的失调。
, http://www.100md.com
Effect of acrylonitrile on certain indexes associated
with calcium homeostasis in rat liver
ZHANG Zheng-Dong JIN Fu-Sheng WANG Xin-Ru et al.
(Laboratory of Molecular Toxicology, School of Pubilc Health,Nanjing Medical University,210029)
ABSTRACT The activities of Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase,Na+/K+-ATPase and phosphorylase a(P-a) of liver in rats exposed acrylonitrile (ACN) were measured in order to investigate the effect of ACN on calcium homeostasis of liver in rats. The results showed that ACN could significantly inhibit the activities of all ATPase and increase the acivity of P-a in all exposed groups and at all exposed periods(P<0.01).There was significant difference in the changes of activities of all ATPase and P-a at all exposed periods of liver in rats exposed acrylonitrile at dose of 50 mg/kg and all exposed groups at period of 42 days (P<0.05). Meanwhile, the changes of activities of all ATPase and P-a appeared dose-response relation ship at periods of all exposed at all exposed groups(P<0.01). These results indicated that ACN couled alter the levels of certain indexes associated with calaium homostasis of liver in rats-exposed ACN,and might induce disorder of the calcium homeostasis.
, 百拇医药
KEY WORDS Acrylonitrile; ATPase; Phosphorylase a;Calcium homeostasis;
Rat liver
丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是石油化工行业中重要的有机合成单位，同时也是重要的环境污染物之一[1]。研究表明[2，3]，ACN对动物具有肯定的致癌作用，并很可能是人类致癌物。但迄今为止其确切的致癌机制仍不很清楚。通过观察ACN染毒对大鼠肝脏钙稳态指标的影响，探讨其对肝脏钙稳态的影响，为进一步阐明ACN的毒作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 重要试剂和药品
ACN(A.R，北京福星化工厂，含量>98%，批号940706)。ATPase试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
, http://www.100md.com
1.2 动物和处理方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重120±10g，由江苏省实验动物中心提供。随机分为4组，每组30只。(1)未染毒组，蒸馏水。(2)ACN染毒组，设10、30和50mg/kg3个染毒剂量。每天经口染毒1次，于染毒第14、28和42天(染毒结束)分别处死部分动物，迅速取出肝脏，以预冷的1.15%KCL和介质液(含100 mmol/L NaF、20 mmol/L EDTA、0.5%糖原和50 mmol/L甘氨酰甘氨酸)制备10%肝匀浆分别用于ATPase和磷酸化酶a(P-a)的测定。
1.3 酶活性测定
ATPase测定按试剂盒要求操作，酶活性单位以每分钟每克蛋白质催化生成的无机磷微摩尔数表示(Piμmol.g-1.min-1)。P-a测定参照崔京伟介绍的方法进行[4]，酶活性单位以每克蛋白质催化生成的无机磷毫克数表示(Pi mg.g-1)。
, 百拇医药
1.4 统计方法
采用SAS统计软件对多组均数进行方差分析(ANON)。
2 结果与分析
2.2 ACN染毒对大鼠肝脏ATPase活性的影响
表1 不同染毒剂量ACN(mg/kg)对大鼠肝脏ATPase活性(±s，μmol Pi.g-1.min-1)的影响Δ
检测
指标
染毒时间
(天)
, http://www.100md.com 染毒剂量
F检验
0(1)
10(2)
30(3)
50(4)
F
P
Na+/K+-ATPase
14
28
42
4.37±0.65
, http://www.100md.com
4.40±0.35
4.02±0.32
4.41±0.41
4.30±0.31
2.80±0.40
3.96±0.30
3.83±0.48
1.46±0.36
2.54±0.45
2.22±0.44
0.55±0.15
27.66
, http://www.100md.com
50.80
267.59
<0.01
<0.01
<0.01
Ca2+-ATPase
14
28
42
4.65±0.96
4.53±0.88
4.20±0.43
, http://www.100md.com
4.87±0.52
4.51±0.52
2.75±0.35
4.48±0.52
4.13±0.97
1.39±0.31
2.85±0.24
2.42±0.53
0.64±0.17
18.00
14.16
280.47
, 百拇医药
<0.01
<0.01
<0.01
Mg2+-ATPase
14
28
42
4.50±0.51
4.41±0.68
4.66±0.45
4.46±0.38
4.30±0.44
, 百拇医药
2.96±0.41
4.36±0.40
4.20±0.62
1.95±0.36
2.80±0.49
2.47±0.51
0.74±0.23
26.99
20.89
241.41
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
Δ：各组实验动物数：染毒42，0mg/kg:11只，10mg/kg：13只，30mg/kg：14只，50mg/kg：13只，余各组均为8只。
Q检验：Na+/K+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
Ca2+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
, 百拇医药
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
Mg2+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
表1可见，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的活性均呈下降趋势。经F检验证实具有极显著性(P<0.01)。Q检验证实，高剂量组随着染毒时间延长三种酶活性均显著下降，并且具有明显的剂量反应关系(P<0.05)。
, 百拇医药
2.1.2 ACN染毒对大鼠肝脏P-a活性的影响
表2可见，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，P-a活性呈逐渐增高的趋势，经F检验证实具有极显著性(P<0.01)。Q检验证实具有明显的剂量-反应关系，随着染毒剂量增加而P-a活性而显著升高(P<0.05)。 表2 不同染毒剂量ACN(mg/kg)对大鼠肝脏磷酸化酶a活性(mgPi.g-1)的影响
染毒时间
(天)
磷酸化酶a活性(±s)
F检验
0(1)
10(2)
, 百拇医药
30(3)
50(4)
F
P
14
28
42
34.02±9.84
35.50±3.62
40.94±7.68
37.00±9.99
39.36±5.26
, http://www.100md.com 52.19±7.36
42.50±9.33
48.40±5.01
63.68±8.94
45.32±7.56
79.14±15.43
121.06±12.50
2.47
41.19
180.48
>0.05
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
Δ：各组实验动物数同表1。
Q检验：28天染毒，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2)比P<0.05
42天染毒，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
3 讨论
已知细胞内钙稳态是一个极复杂的生理过程，Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Na+/K+-ATPase以及P-a等酶作为细胞质膜上一类重要的酶，对于调节细胞内游离Ca2+水平，维持细胞内钙稳态具有重要的作用。
, 百拇医药
本研究发现，随着染毒剂量和染毒时间的延长，ACN可显著地抑制大鼠肝脏Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase和Na+/K+-ATPase的活性，并激活P-a活性，且均存在较好的剂量-反应关系。有研究表明[5]，Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的抑制，可直接抑制胞浆内游离Ca2+移出胞外和移入细胞器，使胞浆内Ca2+浓度升高，而Na+/K+-ATPase活性的抑制，可使细胞内外Na+、K+不均匀分布状况被打乱，导致Na+/Ca2+交换发生障碍。因此，肝脏ATPase活性的抑制有可能打破肝细胞内游离Ca2+水平的动态平衡，破坏了细胞质膜对钙的隔离和调节作用。而ATPase被抑制所致胞浆内游离Ca2+浓度升高可作为激活剂激活了P-a，使其活性升高，从而进一步扰乱细胞内外的钙平衡，最终将可能导致肝细胞钙稳态的失调。这可能是ACN产生一系列毒作用，包括致癌作用的重要机制。
, 百拇医药
江苏省教委自然科学基金资助项目(№ 96036)
参考文献
1，Environmental Protection Agency(EPA).National emission standards for hazardous air pollutants for source categories:Organic hazardous air pollutants from the syntheic organic chemical manu-facturing industrial and seven other processes. Fed Regist, 1992,57:62602-62608.
2，张正东，王心如.丙烯腈的遗传毒理学研究.工业卫生与职业病，1998，3：179-181.
3，Woutersen RA,Toxicologic profile of acrylonitrile. Scand J Work Environ Health,1998,24(suppl2):5-9.
4，崔京伟，江泉观.大鼠肝脏磷酸化酶a活性测定法介绍.卫生毒理学杂志，1989，2：93-95.
5，李云波，李 颉，刘世杰.化学毒物致细胞内钙稳态失调研究的某些进展.卫生毒理学杂志，1990，1：40-45., 百拇医药
单位：张正东(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));王心如(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));周建伟(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));高素琴(南京医科大学公共卫生学院分子毒理学实验室(210029));金复生(上海医科大学附属金山医院职防科);金锡鹏(上海医科大学公共卫生学院)
关键词：丙烯腈 ATPase 磷酸化酶a 钙稳态 大鼠肝脏
卫生毒理学杂志000405 摘要 本研究观察了丙烯腈对大鼠肝脏Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Na+/K+-ATPase和磷酸化酶a(P-a)活性的影响，探讨其对大鼠肝脏钙稳态的影响。结果表明，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，各ATPase活性均逐渐降低，而P-a的活性却逐渐升高(P<0.01)，其中高剂量(50 mg/kg)组的各观察时段和染毒42天时各染毒组酶活性的变化均具有显著性意义(P<0.05)，并具有较好的剂量-反应关系(P<0.01)。结果提示，丙烯腈可影响大鼠肝脏钙稳态某些指标变化，并可能导致肝脏钙稳态的失调。
, http://www.100md.com
Effect of acrylonitrile on certain indexes associated
with calcium homeostasis in rat liver
ZHANG Zheng-Dong JIN Fu-Sheng WANG Xin-Ru et al.
(Laboratory of Molecular Toxicology, School of Pubilc Health,Nanjing Medical University,210029)
ABSTRACT The activities of Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase,Na+/K+-ATPase and phosphorylase a(P-a) of liver in rats exposed acrylonitrile (ACN) were measured in order to investigate the effect of ACN on calcium homeostasis of liver in rats. The results showed that ACN could significantly inhibit the activities of all ATPase and increase the acivity of P-a in all exposed groups and at all exposed periods(P<0.01).There was significant difference in the changes of activities of all ATPase and P-a at all exposed periods of liver in rats exposed acrylonitrile at dose of 50 mg/kg and all exposed groups at period of 42 days (P<0.05). Meanwhile, the changes of activities of all ATPase and P-a appeared dose-response relation ship at periods of all exposed at all exposed groups(P<0.01). These results indicated that ACN couled alter the levels of certain indexes associated with calaium homostasis of liver in rats-exposed ACN,and might induce disorder of the calcium homeostasis.
, 百拇医药
KEY WORDS Acrylonitrile; ATPase; Phosphorylase a;Calcium homeostasis;
Rat liver
丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是石油化工行业中重要的有机合成单位，同时也是重要的环境污染物之一[1]。研究表明[2，3]，ACN对动物具有肯定的致癌作用，并很可能是人类致癌物。但迄今为止其确切的致癌机制仍不很清楚。通过观察ACN染毒对大鼠肝脏钙稳态指标的影响，探讨其对肝脏钙稳态的影响，为进一步阐明ACN的毒作用机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 重要试剂和药品
ACN(A.R，北京福星化工厂，含量>98%，批号940706)。ATPase试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
, http://www.100md.com
1.2 动物和处理方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重120±10g，由江苏省实验动物中心提供。随机分为4组，每组30只。(1)未染毒组，蒸馏水。(2)ACN染毒组，设10、30和50mg/kg3个染毒剂量。每天经口染毒1次，于染毒第14、28和42天(染毒结束)分别处死部分动物，迅速取出肝脏，以预冷的1.15%KCL和介质液(含100 mmol/L NaF、20 mmol/L EDTA、0.5%糖原和50 mmol/L甘氨酰甘氨酸)制备10%肝匀浆分别用于ATPase和磷酸化酶a(P-a)的测定。
1.3 酶活性测定
ATPase测定按试剂盒要求操作，酶活性单位以每分钟每克蛋白质催化生成的无机磷微摩尔数表示(Piμmol.g-1.min-1)。P-a测定参照崔京伟介绍的方法进行[4]，酶活性单位以每克蛋白质催化生成的无机磷毫克数表示(Pi mg.g-1)。
, 百拇医药
1.4 统计方法
采用SAS统计软件对多组均数进行方差分析(ANON)。
2 结果与分析
2.2 ACN染毒对大鼠肝脏ATPase活性的影响
表1 不同染毒剂量ACN(mg/kg)对大鼠肝脏ATPase活性(±s，μmol Pi.g-1.min-1)的影响Δ
检测
指标
染毒时间
(天)
, http://www.100md.com 染毒剂量
F检验
0(1)
10(2)
30(3)
50(4)
F
P
Na+/K+-ATPase
14
28
42
4.37±0.65
, http://www.100md.com
4.40±0.35
4.02±0.32
4.41±0.41
4.30±0.31
2.80±0.40
3.96±0.30
3.83±0.48
1.46±0.36
2.54±0.45
2.22±0.44
0.55±0.15
27.66
, http://www.100md.com
50.80
267.59
<0.01
<0.01
<0.01
Ca2+-ATPase
14
28
42
4.65±0.96
4.53±0.88
4.20±0.43
, http://www.100md.com
4.87±0.52
4.51±0.52
2.75±0.35
4.48±0.52
4.13±0.97
1.39±0.31
2.85±0.24
2.42±0.53
0.64±0.17
18.00
14.16
280.47
, 百拇医药
<0.01
<0.01
<0.01
Mg2+-ATPase
14
28
42
4.50±0.51
4.41±0.68
4.66±0.45
4.46±0.38
4.30±0.44
, 百拇医药
2.96±0.41
4.36±0.40
4.20±0.62
1.95±0.36
2.80±0.49
2.47±0.51
0.74±0.23
26.99
20.89
241.41
<0.01
<0.01
, 百拇医药
<0.01
Δ：各组实验动物数：染毒42，0mg/kg:11只，10mg/kg：13只，30mg/kg：14只，50mg/kg：13只，余各组均为8只。
Q检验：Na+/K+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
Ca2+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
, 百拇医药
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
Mg2+-ATPase：染毒14天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒28天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3)比P<0.05
染毒42天，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
表1可见，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase的活性均呈下降趋势。经F检验证实具有极显著性(P<0.01)。Q检验证实，高剂量组随着染毒时间延长三种酶活性均显著下降，并且具有明显的剂量反应关系(P<0.05)。
, 百拇医药
2.1.2 ACN染毒对大鼠肝脏P-a活性的影响
表2可见，随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长，P-a活性呈逐渐增高的趋势，经F检验证实具有极显著性(P<0.01)。Q检验证实具有明显的剂量-反应关系，随着染毒剂量增加而P-a活性而显著升高(P<0.05)。 表2 不同染毒剂量ACN(mg/kg)对大鼠肝脏磷酸化酶a活性(mgPi.g-1)的影响
染毒时间
(天)
磷酸化酶a活性(±s)
F检验
0(1)
10(2)
, 百拇医药
30(3)
50(4)
F
P
14
28
42
34.02±9.84
35.50±3.62
40.94±7.68
37.00±9.99
39.36±5.26
, http://www.100md.com 52.19±7.36
42.50±9.33
48.40±5.01
63.68±8.94
45.32±7.56
79.14±15.43
121.06±12.50
2.47
41.19
180.48
>0.05
<0.01
, http://www.100md.com
<0.01
Δ：各组实验动物数同表1。
Q检验：28天染毒，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2)比P<0.05
42天染毒，(4)与(1) (4)与(2) (4)与(3) (3)与(1) (3)与(2) (2)与(1)比P<0.05
3 讨论
已知细胞内钙稳态是一个极复杂的生理过程，Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、Na+/K+-ATPase以及P-a等酶作为细胞质膜上一类重要的酶，对于调节细胞内游离Ca2+水平，维持细胞内钙稳态具有重要的作用。
, 百拇医药
本研究发现，随着染毒剂量和染毒时间的延长，ACN可显著地抑制大鼠肝脏Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase和Na+/K+-ATPase的活性，并激活P-a活性，且均存在较好的剂量-反应关系。有研究表明[5]，Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase的抑制，可直接抑制胞浆内游离Ca2+移出胞外和移入细胞器，使胞浆内Ca2+浓度升高，而Na+/K+-ATPase活性的抑制，可使细胞内外Na+、K+不均匀分布状况被打乱，导致Na+/Ca2+交换发生障碍。因此，肝脏ATPase活性的抑制有可能打破肝细胞内游离Ca2+水平的动态平衡，破坏了细胞质膜对钙的隔离和调节作用。而ATPase被抑制所致胞浆内游离Ca2+浓度升高可作为激活剂激活了P-a，使其活性升高，从而进一步扰乱细胞内外的钙平衡，最终将可能导致肝细胞钙稳态的失调。这可能是ACN产生一系列毒作用，包括致癌作用的重要机制。
, 百拇医药
江苏省教委自然科学基金资助项目(№ 96036)
参考文献
1，Environmental Protection Agency(EPA).National emission standards for hazardous air pollutants for source categories:Organic hazardous air pollutants from the syntheic organic chemical manu-facturing industrial and seven other processes. Fed Regist, 1992,57:62602-62608.
2，张正东，王心如.丙烯腈的遗传毒理学研究.工业卫生与职业病，1998，3：179-181.
3，Woutersen RA,Toxicologic profile of acrylonitrile. Scand J Work Environ Health,1998,24(suppl2):5-9.
4，崔京伟，江泉观.大鼠肝脏磷酸化酶a活性测定法介绍.卫生毒理学杂志，1989，2：93-95.
5，李云波，李 颉，刘世杰.化学毒物致细胞内钙稳态失调研究的某些进展.卫生毒理学杂志，1990，1：40-45., 百拇医药