虎杖乙酸乙酯萃取部分抗人疱疹病毒研究*
作者：王志洁 方学韫 程仲敏
单位：王志洁，武汉 430071 湖北医科大学病毒研究所；方学韫，武汉 430071 湖北医科大学附属二院中医科
关键词：虎杖；人疱疹病毒
中国现代应用药学990513摘要 目的：HSV可引起多种疾病，阿昔洛韦(ACV)治疗HSV感染效果虽好，但易出现耐药毒株；新药Cidofovir对ACV耐药毒株效果好，毒性也大。HSV疫苗临床实验效果也不好。为了解决这些问题，必须继续开发新药。虎杖是一种抗病毒范围广的中药，为了了解虎杖的抗病毒性能并开发利用，我们对虎杖乙酸乙酯萃取部分的抗HSV药效进行了研究。方法：我们以ACV为阳性对照，利用病毒细胞病变抑制及空斑减数实验观察了药效，并且用中效作用原理对药效进行了分析。结果：在HEp-2细胞系统中，ACV对HSV-1F株直接杀灭、增殖的抑制及感染阻断的ED50分别为13.22，9.09和8.71μg/ml;晶Ⅳ的相应数值分别为0.09，0.07和0.03μg/ml；晶Ⅳ的三个治疗指数(TI)分别为ACVTI的307，272和609倍。ACV对HSV-2 333株直接杀灭、增殖抑制及感染阻断的ED50分别为16.45，10.85和18.62μg/ml；晶Ⅳ的相应数值分别为0.07，0.09和2.29μg/ml；晶Ⅳ的三个TI分别为ACVTI的498，251和17倍。结论：晶Ⅳ抗HSV药效比ACV强，毒性比ACV小，值得开发利用。
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Research about antiviral effect of ethyl acetate component of Rhizoma polygoni cuspidati on herpes virus hominis
Wang Zhijie(Wang ZJ),Fang Xieyun(Fang XY),Chen Zhongmian(Chen ZM)
Department of Oncogenic Virus,Virus Research Institute,Hubei Medical University, Wuhan 430071
ABSTRACT OBJECTIVE：Herpes simplex virus can induce many diseases,although therapeutical effect of ACV on HSV infection is good,but resistant strains against ACV appear easily,and new drug cidofovir can cure the infection of ACV resistant strains,but it has obvious toxicity,the results of clinical trials of HSV vaccines are not good.In order to resoluve these problems,it is necessary to exploit new antiherpes drugs contineously.Polygonum cuspidati is a Chinese medicinal herb with wide antiviral range,understanding and exploiting it′s antiviral property,we observed antiherpes effects of ethylacetate extract component of it.METHODS:With ACV as positive control,we investigated antiherpes effects of ethyl acetate extract component,i.e. crystalline Ⅲ and crystalline Ⅳ,by way of CPE inhibition and plaque reduction assays,and analyzed effects with median effect principle.RESULTS:In HEp-2 cell system:the ED50s of direct virucidal activity,the inhibition effects on the multiplication and infection of HSV-1 F strain of ACV are 13.22μg/ml,9.09μg/ml and 8.71μg/ml respectively,the corresponding figures of crystalline Ⅳ are 0.09,0.07 and 0.03μg/ml respectively.The treatment indices of crystalline Ⅳ are 307,272,609 times of ACV TIs.The ED50s of diredct virucidal activity,the inhibition effects on the multiplication and infection of HSV-2 333 strain are 16.45μg/ml,10.85μg/ml and 18.62μg/ml respectively,the corresponding figures of crystalline Ⅳ are 0.07μg/ml,0.09μg/ml and 2.29μg/ml respectively.The treatment indices of crystalline Ⅳ are 498,251,17 times of ACV TIs.CONCLUSION:The antiherpes effects of crystalline Ⅳ is stronger than ACV,and the toxicity of crystalline Ⅳ is less than ACV,it should be worth exploitation.
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KEY WORDS rhizoma polygoni cuspidati,pharmacology,herpes virus hominis
Ⅰ型人类单纯疱疹病毒可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病，Ⅱ型人类单纯疱疹病毒可引起外阴疱疹，是宫颈癌的协同诱因，也是性传播性病原体之一。阿昔洛韦(aciclovir,ACV)对小鼠脉络膜视网膜炎[1]及疱疹性角膜结膜炎[2]有显著疗效，也可以抑制无毛小鼠皮下HSV-1 KOS株的感染[3],然而在治疗人类感染时易产生ACV耐药株[4,5]。流式细胞仪分析表明,HSV-1 ACV敏感株ED50为0.45～1.47μM,ACV耐药株ED50为140～3134μM[6],为ACV的应用造成了一定的困难。目前用新药Cidofovir治疗患HSV感染而对ACV无反应的AIDS病人效果较好[4],可是Cidofovir静注有很大肾的毒性:12%表现为蛋白尿，5%尿肌酐增加，而且15%的病人有中性粒细胞减少[5]。另外，HSV-2糖蛋白D和B重组疫苗对人类反复发作的生殖道疱疹没有作用[7],HSV-1亚单位疫苗(Skinner疫苗)虽可使女病人生殖道疱疹复发频率降低，但是结果不具统计学显著性[8]。筛选研制新的抗病毒药的确是重要而紧急的任务。
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虎杖是蓼科蓼属植物(Polygonum Cuspidatum Siebet Zucc)的根茎。国内报道对多种病毒，如HSV-1、HSV-2、流感病毒、11型及9型埃可病毒、A9及B5型柯萨基病毒有抑制作用。国外报道[9,10]虎杖大黄素(Emodin)对HSV-1、HSV-2、VZV、假狂犬病毒、流感及副流感病毒、痘苗病毒等有抑制作用。为了了解虎杖的抗病毒性能并开发利用，又由于虎杖蒽醌类化合物含量较高，我们对此类化合物进行了分级分离，分离出晶Ⅰ、晶Ⅲ、晶Ⅳ，并对乙酸乙酯萃取部份晶Ⅲ、晶Ⅳ的抗HSV药效进行了研究，现在将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药 虎杖由湖北医科大学附属二院中药房提供。将虎杖用水提醇沉法处理，水液经苯萃取后，用乙酸乙酯萃取，这时有深棕色沉淀析出，用无水乙醇重结晶得晶Ⅲ。回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解、放置、过滤，有红棕色沉淀析出，重结晶得晶Ⅳ。用含1% Tween-80(分析纯)的PBS配制晶Ⅲ、晶Ⅳ母液,G6漏斗抽滤、分装待用。晶Ⅲ、晶Ⅳ母液浓度分别为229.7和4190μg/ml。实验液培养液含Tween-80为0.001%。
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1.1.2 阿昔洛韦(ACV) 批号为980751-3(丽珠集团湖北科益药业有限公司)。
1.1.3 细胞与病毒 HEp-2细胞(湖北省医学科学院病毒研究所)。HSV-1F株及HSV-2 333株(本室保存)。按本室常规培养细胞，繁殖病毒。HSV-1F株TCID50为108/0.1ml,HSV-2 333株TCID50为109/0.1ml。
1.2 方法
1.2.1 空斑减数实验 本研究所有抗病毒实验均设置了ACV阳性对照组。本实验以3种方式进行。①药物对HSV的直接杀灭，病毒悬液与含药培养液37℃孵1h后，感染细胞。②药物对HSV感染细胞的阻断作用，以含药培养液预先与细胞孵2h,再以HSV感染细胞。③药物对HSV增殖的抑制作用，先感染细胞，再以含药培养液孵育。每组均设置正常细胞对照组以及用病毒感染的加入等体积含Tween-80 PBS的阴性对照组。所用感染复数为1pFu/细胞。经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羧甲基纤维素)，培养48h,弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数。
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1.2.2 药物对细胞病变的抑制作用 也以3种方式进行。经过直接杀灭处理的病毒悬液按对数比例稀释10-1～10-10,每一稀释度接种4小瓶细胞，培养48h后判定病毒滴度。而②及③种方式则是在细胞接受抗病毒处理后，孵育24h,弃维持液，加入1.0ml PBS冻融3次后，再检测病毒滴度。
1.2.3 细胞毒性试验 长成单层的细胞加入含药培养液孵育达72h后，以苔盼蓝拒染法计数死活细胞数。
1.3 结果的统计学处理
1.3.1 ED50及IC50的计算采用“加权直线回归法”。
1.3.2 药物抗病毒药效的评价 根据Chou和Talalay[11]导出的中效方程式，评价药物浓度与药效间的剂量反应关系。
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2 结 果
2.1 晶Ⅲ与晶Ⅳ的基本化学性质
晶Ⅲ难溶于水、乙酸乙酯，能溶于乙醇，不溶于苯。可使KMnO4液褪色，但遇氨水不显红色。晶Ⅳ难溶于冷水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮，遇氨水显红色，这是蒽醌类化合物特有的Borntrger反应，与醋酸镁的甲醇溶液反应显粉红色。晶Ⅲ不是蒽酯类化合物，晶Ⅳ可能是蒽醌类化合物。
2.2 晶Ⅳ对HSV的直接杀灭作用
15,20,25,30和35μg/ml的ACV使HSV-1F株滴度依次降低了4log10，5log10，6log10，7log10和8log10;而0.57,3.30和5.70μg/ml晶Ⅳ使HSV-1F株滴度相应降低了2log10，3log10和5log10(图1)。8,20,30,40和50μg/ml ACV使HSV-2 333株病毒滴度依次降低了2log10，4log10，5log10，7log10和9log10;而2.30,4.60和5.70μg/ml晶Ⅳ使HSV-2 333株病毒滴度相应降低了3log10，7.5log10和9log10(图1)。说明晶Ⅳ对HSV-1F株、HSV-2 333株均具有直接杀灭作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ的直接杀灭作用比ACV强。
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图1 晶Ⅳ对HSV的直接杀灭
1-HSV-1F株；2-HSV-2 333株
2.3 晶Ⅳ对HSV增殖的抑制作用
15,20,25和30μg/ml ACV使HSV-1F株滴度依次降低了2log10，4log10，5log10和8log10;而1.14,2.30和6.90μg/ml晶Ⅳ就使HSV-1F株滴度降低了2log10，4log10和8log10(图2)。20,40,50和60μg/ml ACV使HSV-2 333株滴度相应降低了2log10，6log10，8lgo10和9log10;而1.10,2.30和3.40μg/ml晶Ⅳ就使HSV-2 333株滴度降低了2log10，7log10和8log10(图2)。证实晶Ⅳ对以上两株HSV的增殖均具有抑制作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ对两株HSV增殖的抑制作用比ACV强。
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图2 晶Ⅳ对HSV增殖的抑制
1-HSV-1F株；2-HSV-2 333株
2.4 晶Ⅳ对HSV感染的阻断作用
10,12,20和25μg/ml ACV与细胞预孵2h后,HSV-1F株滴度相应降低了2log10，3log10，4log10和8log10;而1.10,2.30和6.90μg/ml晶Ⅳ与细胞预孵2h后,HSV-1F株滴度依次降低了2log10，4log10和8log10(图3)。10,15,20和25μg/ml ACV与细胞预孵2h后,HSV-2 333株滴度相应降低了4log10，6log10，7log10和9log10;而1.70,4.60和8.60μg/ml晶Ⅳ与细胞预孵2h后，HSV-2 333株滴度依次降低了2log10，6log10和9log10(图3)。指出晶Ⅳ对HSV-1F株及HSV-2 333株感染具有阻断作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ对两株HSV感染的阻断作用比ACV强。
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图3 晶Ⅳ对HSV感染的阻断
1-HSV-1株；2-HSV-2 333株
2.5 晶Ⅲ抗病毒试验的结果
晶Ⅲ用到8.30μg/ml剂量，在三组对HSV-1F株及HSV-2 333株的抗病毒试验中，空斑减数率为0。表明晶Ⅲ对两株HSV无抗病毒活性。
2.6 晶Ⅳ的抗HSV药效具有剂量反应关系 ACV对HSV-1F株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为13.22,9.09和8.71μg/ml;ED90分别为36.46,48.68和50.16μg/ml;相关系数依次为0.99(自由度为6)、0.99(7)、1.00(5),P均<0.0005。晶Ⅳ对HSV-1F株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为0.09,0.07和0.03μg/ml;ED90分别为3.50,3.40和1.81μg/ml;相关系数依次为0.96(自由度=9)、0.90(9)、0.94(9);P均<0.0005(表1，表2，图4)。ACV对HSV-2 333株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为16.45,10.85和18.62μg/ml;ED90分别为70.68,44.86和63.68μg/ml;相关系数依次为0.98(自由度=7)、0.99(8)、0.99(7);P均<0.0005。晶Ⅳ对HSV-2 333株的直接杀灭、对增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为0.07,0.09和2.29μg/ml;ED90分别为1.78,1.95和7.13μg/ml;相关系数分别为0.96(自由度=10)、0.96(9)、0.89(9);P均<0.0005(表1，表2，图4)。说明晶Ⅳ抗HSV-1F株及HSV-2 333株的作用具有剂量反应关系，这种关系具有统计学显著性，并且再次证实晶Ⅳ抗两株HSV的作用比ACV强，是值得开发利用的。表1 晶Ⅳ抗HSV-1F株的中效方程参数
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中效方程参数
斜率
/m
Dm
/ED50
Y轴截距
相关系数
/自由度
直接杀灭
ACV
0.99
13.22
-0.61
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0.99(6)
晶Ⅳ
0.61
0.09
-0.06
0.96(9)
对增殖抑制
ACV
0.60
9.09
-0.08
0.99(7)
晶Ⅳ
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0.56
0.07
0.01
0.90(9)
对感染阻断
ACV
0.56
8.71
-0.02
1.00(5)
晶Ⅳ
0.60
0.03
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-0.13
0.94(9)
注：P均<0.0005
2.7 晶Ⅳ的细胞毒作用
晶Ⅳ细胞毒IC50为2266μg/ml。治疗指数(Treatment Index,TI)。统一按直接杀灭、对增殖的抑制、对感染的阻断的顺序排列，晶Ⅳ对HSV-1F株的TI为25177,32371,75533;ACV的IC50为1085μg/ml,对HSV-1F株的TI为82;119;124;晶Ⅳ的TI为ACV TI的307,272,609倍。晶Ⅳ对HSV-2 333株的TI为32371;25177;989;ACV对HSV-2 333株的TI为65;100;58;晶Ⅳ的TI为ACV TI的498,251,17倍。进一步说明晶Ⅳ是值得开发利用的。表2 晶Ⅳ抗HSV-2 333株的中效方程参数
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中效方程参数
斜率
/m
Dm
/ED50
Y轴截距
相关系数
/自由度
直接杀灭
ACV
0.58
16.45
-0.21
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0.98(7)
晶Ⅳ
0.67
0.07
-0.11
0.96(10)
对增殖抑制
ACV
0.69
10.85
-0.20
0.99(8)
晶Ⅳ
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0.70
0.09
-0.03
0.96(9)
对感染阻断
ACV
0.76
18.62
-0.47
0.99(7)
晶Ⅳ
0.64
2.29
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0.53
0.89(9)
注：P均<0.0005
图4 晶Ⅳ抗HSV的中效作用图
中效线(a),(b),(c)分别代表晶Ⅳ对HSV-1F株增殖的抑制、感染的阻断以及直接杀灭。中效线(d),(e),(f)分别代表晶Ⅳ
对HSV-2 333株增殖的抑制、感染的阻断以及直接杀灭；
1-HSV-1F株；2-HSV-2333株
3 讨 论
从对细胞病变抑制的结果来看，晶Ⅳ对HSV-1F株及HSV-2 333株具有明显的直接杀灭、抑制增殖及阻断感染的作用，而且传染性病毒滴度的降低是取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比的。与阳性对照ACV比较，就抗HSV-1F株而言,20μg/ml ACV在直接杀灭试验中使其滴度降低了5log10,在对增殖抑制及感染阻断的试验中使其滴度降低了4log10;晶Ⅳ依次用5.70,2.30和2.30μg/ml就达到了同样的效果。就抗HSV-2 333株而言,50μg/ml ACV在直接杀灭试验中，使病毒滴度降低了9log10,在对增殖抑制的试验中，使病毒滴度降低了8log10;而5.70μg/ml及3.40μg/ml晶Ⅳ就分别达到了同样的效果;25μg/ml ACV在对感染的阻断中，使病毒滴度降低了9log10,8.60μg/ml晶Ⅳ就达到了同样的效果。说明晶Ⅳ的药效比ACV强。
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从空斑减数实验的结果来看，晶Ⅳ抗HSV-1F株及HSV-2 333株的作用具有剂量反应关系。与ACV比较，就抗HSV-1F株而言，ACV直接杀灭的ED50、ED90分别为13.22μg/ml,36.46μg/ml,晶Ⅳ则为0.09μg/ml,3.50μg/ml;ACV抑制其增殖的ED50、ED90分别为9.09μg/ml,48.68μg/ml,晶Ⅳ则为0.07μg/ml,3.40μg/ml;ACV阻断其感染的ED50、ED50分别为8.71μg/ml,50.16μg/ml;晶Ⅳ则为0.03μg/ml,1.81μg/ml。就抗HSV-2 333株而言,ACV直接杀灭的ED50、ED90分别为16.45μg/ml,70.68μg/ml,晶Ⅳ则为0.07μg/ml,1.78μg/ml;ACV对其增殖抑制的ED50、ED90分别为10.85μg/ml,44.86μg/ml,晶Ⅳ则为0.09μg/ml,1.95μg/ml;ACV对其感染阻断的ED50、ED90分别为18.62μg/ml,63.68μg/ml,晶Ⅳ则为2.29μg/ml,7.13μg/ml。晶Ⅳ的药效仍比ACV强。
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从细胞毒作用而言,ACV IC50为1085μg/ml,晶Ⅳ IC50为2266μg/ml。对HSV-1F株而言，晶Ⅳ直接杀灭、对增殖抑制、对感染阻断的TI为ACV TI的307、272、609倍；对HSV-2 333株而言，晶Ⅳ 3种抗病毒试验的TI为ACV TI的498、251、17倍。晶Ⅳ的药效比ACV强，毒性比ACV小，无疑值得进一步开发利用。
注:本课题由湖北省卫生厅科教处资助
参考文献
1 Merchant A,Fl-etcher J,Medina CA,et al.Pharmacomanipulation of HSV-1 induced chorioretinitis in mice.Eye,1997,11(pt4)∶504.
2 Hu S,Dutt J,Zhao T,et al.Tetrandrine polently inhibits herpes simplex virus type-1 induced keratitis in BALB/c mice.Ocul Immunol Inflamm,1997,5(3)∶173.
, 百拇医药
3 Bolger GT,Al-len T,Garnean M,et al.Cutaneously applied acyclovir acts systemically in the treatemnt of herpetic infection in the hairless mouse.Antiviral res,1997,35(3)∶157.
4 Lalezar J,Schacker T,Feinberg J,et al.A randomized doubleblinplacebo-controlled trial of cidofovir gel for the treatment of acyclovir-unresponsive mucocutaneous herpes simplex virus infection in patients with AIDS.J Infect Dis,1997,176(4)∶892.
5 Martinez CM,Luks-Galger DB.Cidofovir use in acyclovir-resistant herpes infection.Ann Pharmacother,1997,31(12)∶1519.
, 百拇医药
6 Pavic L,Hartmen A,Zimmerman A,et al.Flowcytometric analysis of herpes simplex virus type 1 susceptibility to acyclovir,ganciclovir and foscarmet.Antimicrob Agents Chemother,1997,41(12)∶686.
7 Strans SE,Kost RG,McKenZie R,et al.Immunotherapy of recurrent genital herpes with recombinant herpes simplex virus type-2 glycoprotein D and B;results of a placebo-controlled vccine trial.J Infect Dis,1997,176(5)∶1129.
8 Skinner GR,Turgk ME,Benson CA,et al.The efficacy and safety of skinner herp-es simplex vaccine towards modulation of herpesgenitalis,report of a prospective double-blind placebo-controlled trial.Med Microbiol Immunol Berl,1997,186(1)∶31.
, 百拇医药
9 Douglas OA,Norbert DW,Steven GW,et al.In vitro virucidal activity of selected anthraquinones and anthraquinone derivatives.Antiviral Res,1991,16∶185.
10 Sydiskis RJ,Owen DG,Lohr JL,et al.Inactivation of enveloped viruses by anthraquinones extracted from plants.Antimicrob Agents and Chemother,1991,35(12)∶2463.
11 Ting Chao Chou,Paul TaLaLay.General-ized equations for the analysis of inhibition of Michaelis-Menten and higher-order systems with two or more mutually exclusive and non-exclusive inhibition.Eur J Biochem,1981,115∶207.
收稿日期：1998-04-13, 百拇医药
单位：王志洁，武汉 430071 湖北医科大学病毒研究所；方学韫，武汉 430071 湖北医科大学附属二院中医科
关键词：虎杖；人疱疹病毒
中国现代应用药学990513摘要 目的：HSV可引起多种疾病，阿昔洛韦(ACV)治疗HSV感染效果虽好，但易出现耐药毒株；新药Cidofovir对ACV耐药毒株效果好，毒性也大。HSV疫苗临床实验效果也不好。为了解决这些问题，必须继续开发新药。虎杖是一种抗病毒范围广的中药，为了了解虎杖的抗病毒性能并开发利用，我们对虎杖乙酸乙酯萃取部分的抗HSV药效进行了研究。方法：我们以ACV为阳性对照，利用病毒细胞病变抑制及空斑减数实验观察了药效，并且用中效作用原理对药效进行了分析。结果：在HEp-2细胞系统中，ACV对HSV-1F株直接杀灭、增殖的抑制及感染阻断的ED50分别为13.22，9.09和8.71μg/ml;晶Ⅳ的相应数值分别为0.09，0.07和0.03μg/ml；晶Ⅳ的三个治疗指数(TI)分别为ACVTI的307，272和609倍。ACV对HSV-2 333株直接杀灭、增殖抑制及感染阻断的ED50分别为16.45，10.85和18.62μg/ml；晶Ⅳ的相应数值分别为0.07，0.09和2.29μg/ml；晶Ⅳ的三个TI分别为ACVTI的498，251和17倍。结论：晶Ⅳ抗HSV药效比ACV强，毒性比ACV小，值得开发利用。
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Wang Zhijie(Wang ZJ),Fang Xieyun(Fang XY),Chen Zhongmian(Chen ZM)
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ABSTRACT OBJECTIVE：Herpes simplex virus can induce many diseases,although therapeutical effect of ACV on HSV infection is good,but resistant strains against ACV appear easily,and new drug cidofovir can cure the infection of ACV resistant strains,but it has obvious toxicity,the results of clinical trials of HSV vaccines are not good.In order to resoluve these problems,it is necessary to exploit new antiherpes drugs contineously.Polygonum cuspidati is a Chinese medicinal herb with wide antiviral range,understanding and exploiting it′s antiviral property,we observed antiherpes effects of ethylacetate extract component of it.METHODS:With ACV as positive control,we investigated antiherpes effects of ethyl acetate extract component,i.e. crystalline Ⅲ and crystalline Ⅳ,by way of CPE inhibition and plaque reduction assays,and analyzed effects with median effect principle.RESULTS:In HEp-2 cell system:the ED50s of direct virucidal activity,the inhibition effects on the multiplication and infection of HSV-1 F strain of ACV are 13.22μg/ml,9.09μg/ml and 8.71μg/ml respectively,the corresponding figures of crystalline Ⅳ are 0.09,0.07 and 0.03μg/ml respectively.The treatment indices of crystalline Ⅳ are 307,272,609 times of ACV TIs.The ED50s of diredct virucidal activity,the inhibition effects on the multiplication and infection of HSV-2 333 strain are 16.45μg/ml,10.85μg/ml and 18.62μg/ml respectively,the corresponding figures of crystalline Ⅳ are 0.07μg/ml,0.09μg/ml and 2.29μg/ml respectively.The treatment indices of crystalline Ⅳ are 498,251,17 times of ACV TIs.CONCLUSION:The antiherpes effects of crystalline Ⅳ is stronger than ACV,and the toxicity of crystalline Ⅳ is less than ACV,it should be worth exploitation.
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KEY WORDS rhizoma polygoni cuspidati,pharmacology,herpes virus hominis
Ⅰ型人类单纯疱疹病毒可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎、新生儿脑炎等多种疾病，Ⅱ型人类单纯疱疹病毒可引起外阴疱疹，是宫颈癌的协同诱因，也是性传播性病原体之一。阿昔洛韦(aciclovir,ACV)对小鼠脉络膜视网膜炎[1]及疱疹性角膜结膜炎[2]有显著疗效，也可以抑制无毛小鼠皮下HSV-1 KOS株的感染[3],然而在治疗人类感染时易产生ACV耐药株[4,5]。流式细胞仪分析表明,HSV-1 ACV敏感株ED50为0.45～1.47μM,ACV耐药株ED50为140～3134μM[6],为ACV的应用造成了一定的困难。目前用新药Cidofovir治疗患HSV感染而对ACV无反应的AIDS病人效果较好[4],可是Cidofovir静注有很大肾的毒性:12%表现为蛋白尿，5%尿肌酐增加，而且15%的病人有中性粒细胞减少[5]。另外，HSV-2糖蛋白D和B重组疫苗对人类反复发作的生殖道疱疹没有作用[7],HSV-1亚单位疫苗(Skinner疫苗)虽可使女病人生殖道疱疹复发频率降低，但是结果不具统计学显著性[8]。筛选研制新的抗病毒药的确是重要而紧急的任务。
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虎杖是蓼科蓼属植物(Polygonum Cuspidatum Siebet Zucc)的根茎。国内报道对多种病毒，如HSV-1、HSV-2、流感病毒、11型及9型埃可病毒、A9及B5型柯萨基病毒有抑制作用。国外报道[9,10]虎杖大黄素(Emodin)对HSV-1、HSV-2、VZV、假狂犬病毒、流感及副流感病毒、痘苗病毒等有抑制作用。为了了解虎杖的抗病毒性能并开发利用，又由于虎杖蒽醌类化合物含量较高，我们对此类化合物进行了分级分离，分离出晶Ⅰ、晶Ⅲ、晶Ⅳ，并对乙酸乙酯萃取部份晶Ⅲ、晶Ⅳ的抗HSV药效进行了研究，现在将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中药 虎杖由湖北医科大学附属二院中药房提供。将虎杖用水提醇沉法处理，水液经苯萃取后，用乙酸乙酯萃取，这时有深棕色沉淀析出，用无水乙醇重结晶得晶Ⅲ。回收乙酸乙酯至浸膏，用稀乙醇溶解、放置、过滤，有红棕色沉淀析出，重结晶得晶Ⅳ。用含1% Tween-80(分析纯)的PBS配制晶Ⅲ、晶Ⅳ母液,G6漏斗抽滤、分装待用。晶Ⅲ、晶Ⅳ母液浓度分别为229.7和4190μg/ml。实验液培养液含Tween-80为0.001%。
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1.1.2 阿昔洛韦(ACV) 批号为980751-3(丽珠集团湖北科益药业有限公司)。
1.1.3 细胞与病毒 HEp-2细胞(湖北省医学科学院病毒研究所)。HSV-1F株及HSV-2 333株(本室保存)。按本室常规培养细胞，繁殖病毒。HSV-1F株TCID50为108/0.1ml,HSV-2 333株TCID50为109/0.1ml。
1.2 方法
1.2.1 空斑减数实验 本研究所有抗病毒实验均设置了ACV阳性对照组。本实验以3种方式进行。①药物对HSV的直接杀灭，病毒悬液与含药培养液37℃孵1h后，感染细胞。②药物对HSV感染细胞的阻断作用，以含药培养液预先与细胞孵2h,再以HSV感染细胞。③药物对HSV增殖的抑制作用，先感染细胞，再以含药培养液孵育。每组均设置正常细胞对照组以及用病毒感染的加入等体积含Tween-80 PBS的阴性对照组。所用感染复数为1pFu/细胞。经过上述处理的细胞加入细胞维持液(含0.5%羧甲基纤维素)，培养48h,弃维持液，用10%甲醛固定，以0.5%结晶紫染色，计算空斑。空斑减数率(%)=(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/病毒对照组空斑数。
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1.2.2 药物对细胞病变的抑制作用 也以3种方式进行。经过直接杀灭处理的病毒悬液按对数比例稀释10-1～10-10,每一稀释度接种4小瓶细胞，培养48h后判定病毒滴度。而②及③种方式则是在细胞接受抗病毒处理后，孵育24h,弃维持液，加入1.0ml PBS冻融3次后，再检测病毒滴度。
1.2.3 细胞毒性试验 长成单层的细胞加入含药培养液孵育达72h后，以苔盼蓝拒染法计数死活细胞数。
1.3 结果的统计学处理
1.3.1 ED50及IC50的计算采用“加权直线回归法”。
1.3.2 药物抗病毒药效的评价 根据Chou和Talalay[11]导出的中效方程式，评价药物浓度与药效间的剂量反应关系。
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2 结 果
2.1 晶Ⅲ与晶Ⅳ的基本化学性质
晶Ⅲ难溶于水、乙酸乙酯，能溶于乙醇，不溶于苯。可使KMnO4液褪色，但遇氨水不显红色。晶Ⅳ难溶于冷水，能溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮，遇氨水显红色，这是蒽醌类化合物特有的Borntrger反应，与醋酸镁的甲醇溶液反应显粉红色。晶Ⅲ不是蒽酯类化合物，晶Ⅳ可能是蒽醌类化合物。
2.2 晶Ⅳ对HSV的直接杀灭作用
15,20,25,30和35μg/ml的ACV使HSV-1F株滴度依次降低了4log10，5log10，6log10，7log10和8log10;而0.57,3.30和5.70μg/ml晶Ⅳ使HSV-1F株滴度相应降低了2log10，3log10和5log10(图1)。8,20,30,40和50μg/ml ACV使HSV-2 333株病毒滴度依次降低了2log10，4log10，5log10，7log10和9log10;而2.30,4.60和5.70μg/ml晶Ⅳ使HSV-2 333株病毒滴度相应降低了3log10，7.5log10和9log10(图1)。说明晶Ⅳ对HSV-1F株、HSV-2 333株均具有直接杀灭作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ的直接杀灭作用比ACV强。
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图1 晶Ⅳ对HSV的直接杀灭
1-HSV-1F株；2-HSV-2 333株
2.3 晶Ⅳ对HSV增殖的抑制作用
15,20,25和30μg/ml ACV使HSV-1F株滴度依次降低了2log10，4log10，5log10和8log10;而1.14,2.30和6.90μg/ml晶Ⅳ就使HSV-1F株滴度降低了2log10，4log10和8log10(图2)。20,40,50和60μg/ml ACV使HSV-2 333株滴度相应降低了2log10，6log10，8lgo10和9log10;而1.10,2.30和3.40μg/ml晶Ⅳ就使HSV-2 333株滴度降低了2log10，7log10和8log10(图2)。证实晶Ⅳ对以上两株HSV的增殖均具有抑制作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ对两株HSV增殖的抑制作用比ACV强。
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图2 晶Ⅳ对HSV增殖的抑制
1-HSV-1F株；2-HSV-2 333株
2.4 晶Ⅳ对HSV感染的阻断作用
10,12,20和25μg/ml ACV与细胞预孵2h后,HSV-1F株滴度相应降低了2log10，3log10，4log10和8log10;而1.10,2.30和6.90μg/ml晶Ⅳ与细胞预孵2h后,HSV-1F株滴度依次降低了2log10，4log10和8log10(图3)。10,15,20和25μg/ml ACV与细胞预孵2h后,HSV-2 333株滴度相应降低了4log10，6log10，7log10和9log10;而1.70,4.60和8.60μg/ml晶Ⅳ与细胞预孵2h后，HSV-2 333株滴度依次降低了2log10，6log10和9log10(图3)。指出晶Ⅳ对HSV-1F株及HSV-2 333株感染具有阻断作用，传染性病毒滴度的降低取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比，而且晶Ⅳ对两株HSV感染的阻断作用比ACV强。
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图3 晶Ⅳ对HSV感染的阻断
1-HSV-1株；2-HSV-2 333株
2.5 晶Ⅲ抗病毒试验的结果
晶Ⅲ用到8.30μg/ml剂量，在三组对HSV-1F株及HSV-2 333株的抗病毒试验中，空斑减数率为0。表明晶Ⅲ对两株HSV无抗病毒活性。
2.6 晶Ⅳ的抗HSV药效具有剂量反应关系 ACV对HSV-1F株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为13.22,9.09和8.71μg/ml;ED90分别为36.46,48.68和50.16μg/ml;相关系数依次为0.99(自由度为6)、0.99(7)、1.00(5),P均<0.0005。晶Ⅳ对HSV-1F株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为0.09,0.07和0.03μg/ml;ED90分别为3.50,3.40和1.81μg/ml;相关系数依次为0.96(自由度=9)、0.90(9)、0.94(9);P均<0.0005(表1，表2，图4)。ACV对HSV-2 333株的直接杀灭、对其增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为16.45,10.85和18.62μg/ml;ED90分别为70.68,44.86和63.68μg/ml;相关系数依次为0.98(自由度=7)、0.99(8)、0.99(7);P均<0.0005。晶Ⅳ对HSV-2 333株的直接杀灭、对增殖的抑制及感染的阻断ED50分别为0.07,0.09和2.29μg/ml;ED90分别为1.78,1.95和7.13μg/ml;相关系数分别为0.96(自由度=10)、0.96(9)、0.89(9);P均<0.0005(表1，表2，图4)。说明晶Ⅳ抗HSV-1F株及HSV-2 333株的作用具有剂量反应关系，这种关系具有统计学显著性，并且再次证实晶Ⅳ抗两株HSV的作用比ACV强，是值得开发利用的。表1 晶Ⅳ抗HSV-1F株的中效方程参数
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中效方程参数
斜率
/m
Dm
/ED50
Y轴截距
相关系数
/自由度
直接杀灭
ACV
0.99
13.22
-0.61
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0.99(6)
晶Ⅳ
0.61
0.09
-0.06
0.96(9)
对增殖抑制
ACV
0.60
9.09
-0.08
0.99(7)
晶Ⅳ
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0.56
0.07
0.01
0.90(9)
对感染阻断
ACV
0.56
8.71
-0.02
1.00(5)
晶Ⅳ
0.60
0.03
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-0.13
0.94(9)
注：P均<0.0005
2.7 晶Ⅳ的细胞毒作用
晶Ⅳ细胞毒IC50为2266μg/ml。治疗指数(Treatment Index,TI)。统一按直接杀灭、对增殖的抑制、对感染的阻断的顺序排列，晶Ⅳ对HSV-1F株的TI为25177,32371,75533;ACV的IC50为1085μg/ml,对HSV-1F株的TI为82;119;124;晶Ⅳ的TI为ACV TI的307,272,609倍。晶Ⅳ对HSV-2 333株的TI为32371;25177;989;ACV对HSV-2 333株的TI为65;100;58;晶Ⅳ的TI为ACV TI的498,251,17倍。进一步说明晶Ⅳ是值得开发利用的。表2 晶Ⅳ抗HSV-2 333株的中效方程参数
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中效方程参数
斜率
/m
Dm
/ED50
Y轴截距
相关系数
/自由度
直接杀灭
ACV
0.58
16.45
-0.21
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0.98(7)
晶Ⅳ
0.67
0.07
-0.11
0.96(10)
对增殖抑制
ACV
0.69
10.85
-0.20
0.99(8)
晶Ⅳ
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0.70
0.09
-0.03
0.96(9)
对感染阻断
ACV
0.76
18.62
-0.47
0.99(7)
晶Ⅳ
0.64
2.29
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0.53
0.89(9)
注：P均<0.0005
图4 晶Ⅳ抗HSV的中效作用图
中效线(a),(b),(c)分别代表晶Ⅳ对HSV-1F株增殖的抑制、感染的阻断以及直接杀灭。中效线(d),(e),(f)分别代表晶Ⅳ
对HSV-2 333株增殖的抑制、感染的阻断以及直接杀灭；
1-HSV-1F株；2-HSV-2333株
3 讨 论
从对细胞病变抑制的结果来看，晶Ⅳ对HSV-1F株及HSV-2 333株具有明显的直接杀灭、抑制增殖及阻断感染的作用，而且传染性病毒滴度的降低是取决于晶Ⅳ浓度的增加并与之成反比的。与阳性对照ACV比较，就抗HSV-1F株而言,20μg/ml ACV在直接杀灭试验中使其滴度降低了5log10,在对增殖抑制及感染阻断的试验中使其滴度降低了4log10;晶Ⅳ依次用5.70,2.30和2.30μg/ml就达到了同样的效果。就抗HSV-2 333株而言,50μg/ml ACV在直接杀灭试验中，使病毒滴度降低了9log10,在对增殖抑制的试验中，使病毒滴度降低了8log10;而5.70μg/ml及3.40μg/ml晶Ⅳ就分别达到了同样的效果;25μg/ml ACV在对感染的阻断中，使病毒滴度降低了9log10,8.60μg/ml晶Ⅳ就达到了同样的效果。说明晶Ⅳ的药效比ACV强。
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从空斑减数实验的结果来看，晶Ⅳ抗HSV-1F株及HSV-2 333株的作用具有剂量反应关系。与ACV比较，就抗HSV-1F株而言，ACV直接杀灭的ED50、ED90分别为13.22μg/ml,36.46μg/ml,晶Ⅳ则为0.09μg/ml,3.50μg/ml;ACV抑制其增殖的ED50、ED90分别为9.09μg/ml,48.68μg/ml,晶Ⅳ则为0.07μg/ml,3.40μg/ml;ACV阻断其感染的ED50、ED50分别为8.71μg/ml,50.16μg/ml;晶Ⅳ则为0.03μg/ml,1.81μg/ml。就抗HSV-2 333株而言,ACV直接杀灭的ED50、ED90分别为16.45μg/ml,70.68μg/ml,晶Ⅳ则为0.07μg/ml,1.78μg/ml;ACV对其增殖抑制的ED50、ED90分别为10.85μg/ml,44.86μg/ml,晶Ⅳ则为0.09μg/ml,1.95μg/ml;ACV对其感染阻断的ED50、ED90分别为18.62μg/ml,63.68μg/ml,晶Ⅳ则为2.29μg/ml,7.13μg/ml。晶Ⅳ的药效仍比ACV强。
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从细胞毒作用而言,ACV IC50为1085μg/ml,晶Ⅳ IC50为2266μg/ml。对HSV-1F株而言，晶Ⅳ直接杀灭、对增殖抑制、对感染阻断的TI为ACV TI的307、272、609倍；对HSV-2 333株而言，晶Ⅳ 3种抗病毒试验的TI为ACV TI的498、251、17倍。晶Ⅳ的药效比ACV强，毒性比ACV小，无疑值得进一步开发利用。
注:本课题由湖北省卫生厅科教处资助
参考文献
1 Merchant A,Fl-etcher J,Medina CA,et al.Pharmacomanipulation of HSV-1 induced chorioretinitis in mice.Eye,1997,11(pt4)∶504.
2 Hu S,Dutt J,Zhao T,et al.Tetrandrine polently inhibits herpes simplex virus type-1 induced keratitis in BALB/c mice.Ocul Immunol Inflamm,1997,5(3)∶173.
, 百拇医药
3 Bolger GT,Al-len T,Garnean M,et al.Cutaneously applied acyclovir acts systemically in the treatemnt of herpetic infection in the hairless mouse.Antiviral res,1997,35(3)∶157.
4 Lalezar J,Schacker T,Feinberg J,et al.A randomized doubleblinplacebo-controlled trial of cidofovir gel for the treatment of acyclovir-unresponsive mucocutaneous herpes simplex virus infection in patients with AIDS.J Infect Dis,1997,176(4)∶892.
5 Martinez CM,Luks-Galger DB.Cidofovir use in acyclovir-resistant herpes infection.Ann Pharmacother,1997,31(12)∶1519.
, 百拇医药
6 Pavic L,Hartmen A,Zimmerman A,et al.Flowcytometric analysis of herpes simplex virus type 1 susceptibility to acyclovir,ganciclovir and foscarmet.Antimicrob Agents Chemother,1997,41(12)∶686.
7 Strans SE,Kost RG,McKenZie R,et al.Immunotherapy of recurrent genital herpes with recombinant herpes simplex virus type-2 glycoprotein D and B;results of a placebo-controlled vccine trial.J Infect Dis,1997,176(5)∶1129.
8 Skinner GR,Turgk ME,Benson CA,et al.The efficacy and safety of skinner herp-es simplex vaccine towards modulation of herpesgenitalis,report of a prospective double-blind placebo-controlled trial.Med Microbiol Immunol Berl,1997,186(1)∶31.
, 百拇医药
9 Douglas OA,Norbert DW,Steven GW,et al.In vitro virucidal activity of selected anthraquinones and anthraquinone derivatives.Antiviral Res,1991,16∶185.
10 Sydiskis RJ,Owen DG,Lohr JL,et al.Inactivation of enveloped viruses by anthraquinones extracted from plants.Antimicrob Agents and Chemother,1991,35(12)∶2463.
11 Ting Chao Chou,Paul TaLaLay.General-ized equations for the analysis of inhibition of Michaelis-Menten and higher-order systems with two or more mutually exclusive and non-exclusive inhibition.Eur J Biochem,1981,115∶207.
收稿日期：1998-04-13, 百拇医药