蛇葡萄根的保肝降酶及抗自由基损伤作用*
作者：张秀明 陈科力 李翰明 张赤志 姚明全
单位：张秀明 (湖北中医学院97级研究生)；陈科力 李翰明 张赤志 (湖北中医学院药学系 武汉430061)；姚明全 (荆州市第一人民医院)
关键词：蛇葡萄；D-氨基半乳糖；急性肝损伤
中国药师990501 摘 要 用D-氨基半乳糖(D-GalN)制备大鼠急性肝损伤模型，检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，观察肝组织病理变化，以探讨中药蛇葡萄根对急性肝损害的保护作用。结果显示：蛇葡萄根能显著降低血清ALT、AST含量，提高SOD含量，降低MDA含量，高剂量组还能减轻肝细胞受损程度。提示蛇葡萄根具有保肝降酶及抗自由基损伤作用。
Effects of the Root of Ampelopsis Sinica on Protecting Liver,Reducing Enzymes, and Resisting Free Radicle Injury
, http://www.100md.com
Zhang Xiuming* Chen Keli, Li Hanmin, Zhang Chizhi
Hubei College of T.C.M,Wuhan, 430061, P.R. China
*Graduate student of grade 97, in Hubei College of T.C.M.
ABSTRACT Acute hepatic injury model of rats were induced by D-GalN. The ALT, AST in serum and SOD, MDA in liver homogenate were detected. Changes of histopathology were observed. The results showed that the extract of roots of Ampelopsis sinica could reduce serum levels of ALT, AST; raise SOD and reduce MDA in liver homogenate; promote revision of injuried liver cells to some extent. We concluded that the root the multiple roles of Ampelopsis sinica showed the multiple roles of protecting liver, reducing enzymes and resisting free radicle injury.
, 百拇医药
KEY WORDS Ampelopsis sinica, D-GalN, Acute hepatic injury
葡萄科蛇葡萄属植物蛇葡萄Ampelopsissinica(Miq.)W.T.Wang的根为我国民间中草药，具有清热解毒和活血化瘀的作用，主要用于治疗外伤科疾病。1987年我国台北医学院Ling-LingYang等[1]报道，以CCl4和半乳糖胺诱导初期培养的大鼠肝细胞产生毒性，从120种植物的醇提物中筛选抗肝细胞毒性活性的药物，发现葡萄属A.brevipedunculataTrautv.的根及其变种光叶蛇葡萄的根均可显著降低CCl4和半乳糖胺所致的ALT升高。兹后，他们与YoshiteruOshima等合作，确定了光叶蛇葡萄根中抗肝细胞毒性的成分AmpelopsisE[2]。据研究[3，4]，Ling-LingYan等报道所用植物A.BrevipedunculataTrauv.产于我国台湾，据其分布，其与A.Sinica(Miq)W.T.Wang应为同一种植物。据此，我们对其保肝作用进行了体内实验研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药物
蛇葡萄根采自湖北省麻城县黄土岗，原植物经作者鉴定为蛇葡萄A.sinica(Miq.)W.T.Wang。将该药材干燥后粉碎成粗末，用80%乙醇渗漉，回收溶剂，残渣用蒸馏水溶解，配成1ml含1g生药的药液，用前混匀。
联苯双酯滴丸(北京协和药厂)，批号970320；D-GalN(重庆医科大学化学教研室)，批号980828，临用前用消毒生理盐水溶解，以1M的NaOH溶液调pH值至7，最后配成浓度为10%的溶液，用前混匀。
谷丙转氨酶测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)；谷草转氨酶测定试剂盒(上海科华-华菱诊断用品有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)。
, 百拇医药 1.2 动物
Wistar大鼠，雌雄各半，体重140～160g，一级标准，由同济医科大学实验动物学部提供，合格证号为医动字第19-022号。实验室喂养3d后开始实验。
1.3 方法
大鼠随机分为6组，每组8只，雌雄各半，除正常组、D-GalN损伤组外，各组按表中所给剂量灌胃给药，qd，连续7d。末次给药后1h除正常组外其余各组均腹腔注射10%的D-GalN溶液(600mg.kg-1)，禁食不禁水，24h后断头取血(不抗凝)，按试剂盒说明书测定血清中ALT(金氏法)、AST(紫外-苹果酸脱氢酶法)。另从右叶肝脏相同部位切取一小块肝组织，在冰浴下用生理盐水制成10%肝匀浆，按试剂盒说明书测定SOD(黄嘌呤氧化酶法)、MDA(硫代巴比妥酸缩合法)。切取左叶肝脏且部位大致相同的一小块肝组织，置10%福尔马林液中固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，最后镜检。肝损伤严重程度分级如下：(-)无明显病变。(+)肝细胞发生变性，胞浆疏松及混浊肿胀。(++)有范围较小的点状坏死或灶状坏死。(+++)有范围较大的带状坏死或片状坏死。肝病理切片镜检结果经Ridit分析，损伤组与正常组有显著差异，表明造模成功。中、高剂量蛇葡萄根组与损伤组相比均有显著差异，肝损伤程度明显减轻。联苯双酯组与损伤组、低剂量组与损伤组无明显差异。ALT、AST、SOD、MDA用方差分析，肝损伤程度用Ridit分析。
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2 实验结果
蛇葡萄根提取物对D-GalN诱导大鼠肝损伤的保护作用见表1、2。
表1 蛇葡萄根提取物对D-GalN肝损伤大鼠血清ALT、AST活力及肝损伤程度的影响 组别
剂量g.kg-1
ALT(±s)IU.100ml-1
AST(±s)IU.L-1
肝损伤程度
-
+
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++
+++
正常组
2.56±52.16
211.56±35.48
8
D-GalN损伤组
643.63±82.42*
883.39±438.40*
2
6*
联苯双酯组
, 百拇医药
0.05
476.25±64.42△
500.70±186.08△
3
3
2
蛇葡萄根组
7
366.25±173.76△
326.00±127.86△
7
, http://www.100md.com
1
△△
4
462.63±143.55△
443.57±169.34△
1
2
4
1
与损伤组相比，△P<0.01，△△P<0.05 与正常组相比，*P<0.01
, http://www.100md.com 表2 蛇葡萄根提取物对D-GalN肝损伤大鼠肝SOD活性和MDA含量的影响 组别
剂量g.kg-1
SOD(±s)Nu.g-1肝
MDA(±s)mmol.g-1肝
正常组
820.16±76.57
268.61±63.96
D-GalN损伤组
64.94±50.05*
, 百拇医药
438.06±168.71*
取苯双酯组
0.05
57.88±42.01
355.83±72.28
蛇葡萄根组
7
321.85±225.01△
246.39±53.43△
4
523.72±106.44△
, 百拇医药
276.95±26.19△
*△同表1
2.1 血清ALT、AST
损伤组与正常组有显著差异(P<0.01)，ALT、AST明显升高，联苯双酯组、低高剂量的蛇葡萄根组均与损伤组有显著差异，ALT、AST明显降低。低高剂量蛇葡萄根组、联苯双酯组相互间无明显差异。
2.2 肝匀浆SOD、MDA
损伤组与正常组有显著性差异(P<0.01)，SOD明显降低，MDA明显升高。两种剂量的蛇葡萄根组与损伤组相比，均有非常显著性差异，SOD明显升高，MDA明显降低。两种剂量的蛇葡萄根组之间相比较，低剂量组SOD明显高于高剂量组(P<0.05)。两种剂量的蛇葡萄根组与联苯双酯组相比，SOD均非常明显高于联苯双酯组，有非常显著性差异(P<0.01)。肝匀浆MDA含量：低、高剂量蛇葡萄根组、联苯双酯组相互间无明显差异。
, 百拇医药
2.3 肝损伤程度
肝病理切片镜检结果经Ridit分析，损伤组与正常组有显著差异，表明造模成功。高剂量蛇葡萄根组与损伤组相比均有显著差异，肝损伤程度明显减轻。联苯双酯组与损伤组、低剂量组与损伤组无明显差异。
3 讨论和小结
D-GalN所致肝损伤模型的肝组织病理学特征与人类病毒性肝炎极为相似，且有极好的重现性和一定的可逆性[5]。D-GalN通过在细胞内与尿苷二磷酸(UDP)结合形成复合物，致使UDP耗竭，从而导致RNA和蛋白质的合成障碍，最终导致肝细胞坏死。另一方面，D-GalN引起肝细胞内Ca2+增多和Mg2+减少[6]。Ca2+增多会抑制线粒体的呼吸功能，激活磷脂酶，分解膜磷脂，破坏溶酶体膜，使蛋白水解酶释放，并使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，加速氧化自由基产生，从而使肝细胞损伤加剧[7]。SOD能抑制黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，减少氧化自由基产生，减轻肝细胞损伤。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物如醛基(MDA)及新的氧自由基等。初始的一个活性氧化导致很多脂类分解产物的形成，氧自由基不但通过生物膜中PUFA的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞受损的程度。
, 百拇医药
D-GalN致大鼠急性肝损伤后，两种剂量的蛇葡萄根均能降低血清ALT、AST，升高SOD活力，降低MDA含量，高剂量组能减轻肝组织受损程度，说明蛇葡萄根具有降酶、抗氧自由基损伤、在一定剂量下促进肝细胞修复的作用。与损伤组相比，联苯双酯组血清中ALT、AST明显降低，但肝匀浆SOD、MDA、肝组织受损程度与其无明显差异。由此可见，蛇葡萄根对D-GalN致大鼠急性肝损伤有明显的防治作用，其作用优于联苯双酯，其机理可能与促进肝细胞修复，抑制过氧化反应，清除氧化自由基有关。
*本课题为湖北省自然科学基金资助项目
参考文献
1 Ling-Ling Yang, Kun-Ying Yen, Yoshinobu Kiso,et al. Antihepatotoxic actions of Formosan plant Drugs. Journal of Ethnopharmacology, 1987,19：103～110
, http://www.100md.com
2 Yoshiteru Oshima, Yuji Ueno. Ampelopsins D, E, H and cis-Ampelopsin E, Oligostilbenes from Ampelopsis brevipedunculata var. Hancei roots. Phytochemistry, 1993, 33(1):179～182
3 王文采. 葡萄科的新发现. 植物分类学报， 1979，17(3)：75
4 陈科力，陈远兵，罗毅，等. 野葡萄根原植物的调查研究. 中药材， 1996，19(4)：176
5 陈奇. 中药药理研究方法学. 贵阳： 贵州人民出版社. 1993.854
6 杜荔菁，唐望先，但自力，等. 中药肝炎平对急性肝损害防治作用的实验研究. 同济医科大学学报，1997，26(2)：151
7 钱涯邻. 乙肝1号方对实验性急性肝损伤小鼠抗自由基损伤作用. 南京铁道医学院学报， 1998， 17(1)：8
(19990524收稿), http://www.100md.com
单位：张秀明 (湖北中医学院97级研究生)；陈科力 李翰明 张赤志 (湖北中医学院药学系 武汉430061)；姚明全 (荆州市第一人民医院)
关键词：蛇葡萄；D-氨基半乳糖；急性肝损伤
中国药师990501 摘 要 用D-氨基半乳糖(D-GalN)制备大鼠急性肝损伤模型，检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，观察肝组织病理变化，以探讨中药蛇葡萄根对急性肝损害的保护作用。结果显示：蛇葡萄根能显著降低血清ALT、AST含量，提高SOD含量，降低MDA含量，高剂量组还能减轻肝细胞受损程度。提示蛇葡萄根具有保肝降酶及抗自由基损伤作用。
Effects of the Root of Ampelopsis Sinica on Protecting Liver,Reducing Enzymes, and Resisting Free Radicle Injury
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Zhang Xiuming* Chen Keli, Li Hanmin, Zhang Chizhi
Hubei College of T.C.M,Wuhan, 430061, P.R. China
*Graduate student of grade 97, in Hubei College of T.C.M.
ABSTRACT Acute hepatic injury model of rats were induced by D-GalN. The ALT, AST in serum and SOD, MDA in liver homogenate were detected. Changes of histopathology were observed. The results showed that the extract of roots of Ampelopsis sinica could reduce serum levels of ALT, AST; raise SOD and reduce MDA in liver homogenate; promote revision of injuried liver cells to some extent. We concluded that the root the multiple roles of Ampelopsis sinica showed the multiple roles of protecting liver, reducing enzymes and resisting free radicle injury.
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KEY WORDS Ampelopsis sinica, D-GalN, Acute hepatic injury
葡萄科蛇葡萄属植物蛇葡萄Ampelopsissinica(Miq.)W.T.Wang的根为我国民间中草药，具有清热解毒和活血化瘀的作用，主要用于治疗外伤科疾病。1987年我国台北医学院Ling-LingYang等[1]报道，以CCl4和半乳糖胺诱导初期培养的大鼠肝细胞产生毒性，从120种植物的醇提物中筛选抗肝细胞毒性活性的药物，发现葡萄属A.brevipedunculataTrautv.的根及其变种光叶蛇葡萄的根均可显著降低CCl4和半乳糖胺所致的ALT升高。兹后，他们与YoshiteruOshima等合作，确定了光叶蛇葡萄根中抗肝细胞毒性的成分AmpelopsisE[2]。据研究[3，4]，Ling-LingYan等报道所用植物A.BrevipedunculataTrauv.产于我国台湾，据其分布，其与A.Sinica(Miq)W.T.Wang应为同一种植物。据此，我们对其保肝作用进行了体内实验研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 药物
蛇葡萄根采自湖北省麻城县黄土岗，原植物经作者鉴定为蛇葡萄A.sinica(Miq.)W.T.Wang。将该药材干燥后粉碎成粗末，用80%乙醇渗漉，回收溶剂，残渣用蒸馏水溶解，配成1ml含1g生药的药液，用前混匀。
联苯双酯滴丸(北京协和药厂)，批号970320；D-GalN(重庆医科大学化学教研室)，批号980828，临用前用消毒生理盐水溶解，以1M的NaOH溶液调pH值至7，最后配成浓度为10%的溶液，用前混匀。
谷丙转氨酶测定试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)；谷草转氨酶测定试剂盒(上海科华-华菱诊断用品有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)。
, 百拇医药 1.2 动物
Wistar大鼠，雌雄各半，体重140～160g，一级标准，由同济医科大学实验动物学部提供，合格证号为医动字第19-022号。实验室喂养3d后开始实验。
1.3 方法
大鼠随机分为6组，每组8只，雌雄各半，除正常组、D-GalN损伤组外，各组按表中所给剂量灌胃给药，qd，连续7d。末次给药后1h除正常组外其余各组均腹腔注射10%的D-GalN溶液(600mg.kg-1)，禁食不禁水，24h后断头取血(不抗凝)，按试剂盒说明书测定血清中ALT(金氏法)、AST(紫外-苹果酸脱氢酶法)。另从右叶肝脏相同部位切取一小块肝组织，在冰浴下用生理盐水制成10%肝匀浆，按试剂盒说明书测定SOD(黄嘌呤氧化酶法)、MDA(硫代巴比妥酸缩合法)。切取左叶肝脏且部位大致相同的一小块肝组织，置10%福尔马林液中固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色，最后镜检。肝损伤严重程度分级如下：(-)无明显病变。(+)肝细胞发生变性，胞浆疏松及混浊肿胀。(++)有范围较小的点状坏死或灶状坏死。(+++)有范围较大的带状坏死或片状坏死。肝病理切片镜检结果经Ridit分析，损伤组与正常组有显著差异，表明造模成功。中、高剂量蛇葡萄根组与损伤组相比均有显著差异，肝损伤程度明显减轻。联苯双酯组与损伤组、低剂量组与损伤组无明显差异。ALT、AST、SOD、MDA用方差分析，肝损伤程度用Ridit分析。
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2 实验结果
蛇葡萄根提取物对D-GalN诱导大鼠肝损伤的保护作用见表1、2。
表1 蛇葡萄根提取物对D-GalN肝损伤大鼠血清ALT、AST活力及肝损伤程度的影响 组别
剂量g.kg-1
ALT(±s)IU.100ml-1
AST(±s)IU.L-1
肝损伤程度
-
+
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++
+++
正常组
2.56±52.16
211.56±35.48
8
D-GalN损伤组
643.63±82.42*
883.39±438.40*
2
6*
联苯双酯组
, 百拇医药
0.05
476.25±64.42△
500.70±186.08△
3
3
2
蛇葡萄根组
7
366.25±173.76△
326.00±127.86△
7
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1
△△
4
462.63±143.55△
443.57±169.34△
1
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1
与损伤组相比，△P<0.01，△△P<0.05 与正常组相比，*P<0.01
, http://www.100md.com 表2 蛇葡萄根提取物对D-GalN肝损伤大鼠肝SOD活性和MDA含量的影响 组别
剂量g.kg-1
SOD(±s)Nu.g-1肝
MDA(±s)mmol.g-1肝
正常组
820.16±76.57
268.61±63.96
D-GalN损伤组
64.94±50.05*
, 百拇医药
438.06±168.71*
取苯双酯组
0.05
57.88±42.01
355.83±72.28
蛇葡萄根组
7
321.85±225.01△
246.39±53.43△
4
523.72±106.44△
, 百拇医药
276.95±26.19△
*△同表1
2.1 血清ALT、AST
损伤组与正常组有显著差异(P<0.01)，ALT、AST明显升高，联苯双酯组、低高剂量的蛇葡萄根组均与损伤组有显著差异，ALT、AST明显降低。低高剂量蛇葡萄根组、联苯双酯组相互间无明显差异。
2.2 肝匀浆SOD、MDA
损伤组与正常组有显著性差异(P<0.01)，SOD明显降低，MDA明显升高。两种剂量的蛇葡萄根组与损伤组相比，均有非常显著性差异，SOD明显升高，MDA明显降低。两种剂量的蛇葡萄根组之间相比较，低剂量组SOD明显高于高剂量组(P<0.05)。两种剂量的蛇葡萄根组与联苯双酯组相比，SOD均非常明显高于联苯双酯组，有非常显著性差异(P<0.01)。肝匀浆MDA含量：低、高剂量蛇葡萄根组、联苯双酯组相互间无明显差异。
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2.3 肝损伤程度
肝病理切片镜检结果经Ridit分析，损伤组与正常组有显著差异，表明造模成功。高剂量蛇葡萄根组与损伤组相比均有显著差异，肝损伤程度明显减轻。联苯双酯组与损伤组、低剂量组与损伤组无明显差异。
3 讨论和小结
D-GalN所致肝损伤模型的肝组织病理学特征与人类病毒性肝炎极为相似，且有极好的重现性和一定的可逆性[5]。D-GalN通过在细胞内与尿苷二磷酸(UDP)结合形成复合物，致使UDP耗竭，从而导致RNA和蛋白质的合成障碍，最终导致肝细胞坏死。另一方面，D-GalN引起肝细胞内Ca2+增多和Mg2+减少[6]。Ca2+增多会抑制线粒体的呼吸功能，激活磷脂酶，分解膜磷脂，破坏溶酶体膜，使蛋白水解酶释放，并使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，加速氧化自由基产生，从而使肝细胞损伤加剧[7]。SOD能抑制黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，减少氧化自由基产生，减轻肝细胞损伤。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUFA)引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物如醛基(MDA)及新的氧自由基等。初始的一个活性氧化导致很多脂类分解产物的形成，氧自由基不但通过生物膜中PUFA的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂质过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞受损的程度。
, 百拇医药
D-GalN致大鼠急性肝损伤后，两种剂量的蛇葡萄根均能降低血清ALT、AST，升高SOD活力，降低MDA含量，高剂量组能减轻肝组织受损程度，说明蛇葡萄根具有降酶、抗氧自由基损伤、在一定剂量下促进肝细胞修复的作用。与损伤组相比，联苯双酯组血清中ALT、AST明显降低，但肝匀浆SOD、MDA、肝组织受损程度与其无明显差异。由此可见，蛇葡萄根对D-GalN致大鼠急性肝损伤有明显的防治作用，其作用优于联苯双酯，其机理可能与促进肝细胞修复，抑制过氧化反应，清除氧化自由基有关。
*本课题为湖北省自然科学基金资助项目
参考文献
1 Ling-Ling Yang, Kun-Ying Yen, Yoshinobu Kiso,et al. Antihepatotoxic actions of Formosan plant Drugs. Journal of Ethnopharmacology, 1987,19：103～110
, http://www.100md.com
2 Yoshiteru Oshima, Yuji Ueno. Ampelopsins D, E, H and cis-Ampelopsin E, Oligostilbenes from Ampelopsis brevipedunculata var. Hancei roots. Phytochemistry, 1993, 33(1):179～182
3 王文采. 葡萄科的新发现. 植物分类学报， 1979，17(3)：75
4 陈科力，陈远兵，罗毅，等. 野葡萄根原植物的调查研究. 中药材， 1996，19(4)：176
5 陈奇. 中药药理研究方法学. 贵阳： 贵州人民出版社. 1993.854
6 杜荔菁，唐望先，但自力，等. 中药肝炎平对急性肝损害防治作用的实验研究. 同济医科大学学报，1997，26(2)：151
7 钱涯邻. 乙肝1号方对实验性急性肝损伤小鼠抗自由基损伤作用. 南京铁道医学院学报， 1998， 17(1)：8
(19990524收稿), http://www.100md.com