咖啡酸和阿魏酸及其类似物对内皮素-1生物效应的拮抗作用*
作者：王峰 季小慎 刘敏 王京媛 李菲 杨连春 吕敏
单位：中国人民解放军空军总医院 北京100036
关键词：桂皮酸；内皮素；拮抗
中国医院药学杂志990502 摘要 目的:对咖啡酸和阿魏酸以及两者化学衍生物肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)拮抗内皮素-1(ET-1)的缩血管及致血管平滑肌细胞增殖效应进行了初步研究。方法:用这四种化合物对ET-1缩血管及致血管平滑肌细胞增殖作用的拮抗效应拮抗进行了研究。结果：咖啡酸和阿魏酸及其衍生物对ET-1缩血管及致血管平滑肌细胞增殖效应有明显的拮抗作用，该作用具剂量依赖性，经药效动力学分析，阿魏酸及其衍生物的拮抗活性显著大于咖啡酸及其衍生物；这四种化合物能剂量依赖性地抑制ET-1致血管平滑肌细胞增殖作用。结论:咖啡酸和阿魏酸及其衍生物为一类新的ET拮抗剂。
, 百拇医药
Study on the antagonist effects of caffeic acid,ferulic acid and their analogs on ET-1 biological responses
Wang Feng,Ji Xiaoshen,Liu Min,et al (Department of Pharmacy,General Hospital of Air Force,Beijing 100036)
ABSTRACT OBJECTIVE:The antagonist effects on vasoconstriction aortic smooth muscle cells proliferation induced by endothelin-1 were investigated on caffeic acid、ferulic acid and their analogs N3-5-methylisoxazolyl-3,4-dihydroxy cinnamoylamide from caffeic acid and N4-antipyryl-4-hydroxy-3-methoxycinnamoylamide.METHODS:The antagonist effects of these compounds on vasoconstriction and aortic smooth muscle cells proliferation induced by ET-1 were studied.RESULTS:The results showed that these four compounds could inhibit vasoconstriction and aortic smooth muscle cells proliferation induced ET-1 with dose-dependent manner,having analyzed the pharmacodynamic parameters,the effects of ferulic acid and its analog were more potent than that of caffeic acid and its analog.CONCLUSIONS:Both caffeic acid、ferulic acid and their analogs can be a new kind of ET-1 antagonists.
, 百拇医药
KEY WORDS cinnamic acid,endothelins,antagonist
内皮素(Endothelin,ET)是由21个氨基酸组成的体内活性多肽，具有强大的缩血管和致平滑肌细胞有丝分裂效应，参与多种心脑血管疾病的病理生理过程，为此寻找ET拮抗剂对治疗ET相关性疾病有很大的意义。内皮素与某些蛇毒如sarafotoxin的一级结构极为近似，经基因分析，认为二者源于同一祖基因。我国传统的抗蛇毒中草药对ET-1所致的生物活性作用有一定的拮抗效应，本实验室对抗蛇毒中草药拮抗ET-1作用进行了初步研究，并从植物红背丝绸[Cissus assamica (Laws.) Craib.]的乙酸乙酯成分中分离得到了反式3，4′，5-三羟基芪(CA-1201)并发现其具有拮抗ET-1生物活性的作用[1～3]，根据CA-1201的结构，我们推测并经实验证实了与CA-1201有着近似结构的咖啡酸和阿魏酸同样具有相似的作用。因此，分别合成了咖啡酸和阿魏酸的酰胺衍生物，并对其药理活性进行了初步研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 咖啡酸(Caffeic acid,CFA)；阿魏酸(Ferulic acid,FLA)；ET-1(购自美国sigma公司)；反式-3，4′，5-三羟基芪(CA-1201)由本实验室自中药红背丝绸[Cissus assamica (Laws.) Craib.]的乙酸乙酯成分中分离、鉴定，化学纯度在98%以上；肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)由本实验室合成；SD大鼠购自北京医科大学实验动物部；MB-Ⅲ型酶标检测仪为北京市新技术应用研究所产品。
1.2 方法
1.2.1 N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)的化学合成以咖啡酸和阿魏酸为原料，采用N，N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)为缩合剂，分别和3-氨基-5-甲基异噁唑及4-氨基安替比林进行酰胺化反应，所得产物经1HNMR和MS证实为目标化合物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(2)，纯度大于98%。
, 百拇医药
1.2.2 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1缩血管效应的拮抗作用 ♂性SD大鼠，体重230±10 g，将大鼠击昏后快速摘取胸主动脉，经分离结缔组织后，剪成2～3 mm宽的血管环，分别置于Krebs-Henseleit生理溶液(K-H液，pH7.40±0.05，95%O2+5%CO2，37.0℃±0.5℃)中，加2 g基础张力、用10-7 mol.L-1去甲肾上腺素预激二次、平衡、稳定后，加入ET-1 10-9 mol.L-1，待达到最大收缩效应后，分别加入不同浓度的咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2后(用2%DMSO为溶媒，实验用2%DMSO作对照)，经张力换能器连台式平衡记录仪(上海大华仪表厂)，记录血管等张收缩与舒张情况。
1.2.3 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用 取第5代已长成致密单层的兔主动脉血管平滑肌细胞(rabbit aortic vessel smooth muscle cells,RAVSMC)以传代培养法调整细胞数为1×105个.ml-1，接种于96孔培养板100 μl.孔-1，37℃，5%CO2孵育24 h，吸去培养液，换以1%小牛血清的DMEM培养液，加入ET-1(10 nmol.L-1)后继续孵育不同时间后，得到ET-1作用与RAVSMC的时间-效应曲线；加入咖啡酸、阿魏酸、CA-1201后考察其对ET-1致平滑肌细胞的增殖作用。以结晶紫染色后用酶标检测仪在570 nm处测定各孔光密度(OD)值。
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2 结果
2.1 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1缩血管效应的拮抗作用 四种化合物均能明显地拮抗ET-1的缩血管效应，且该拮抗作用具剂量依赖性；药物剂量-效应曲线经sigmiodal方法拟合后，从所得出的效应动力学参数可见，阿魏酸拮抗ET-1缩血管的效能较咖啡酸和CA-1201强(P<0.05)，而咖啡酸和CA-1201之间其拮抗效能无显著性差异(P>0.05)，见表1，图1。
表1 CFA、FLA和化合物1、2拮抗ET-1缩血管效应的药效动力学参数 药 物
Emax/%
±s
IC50/10-6mol.L-1
, 百拇医药
CFA
71.0±6.3
1.8±0.8
FLA
92.1±0.8
0.063±0.005
化合物1
102.3±14.3
1.4±1.0
化合物2
101.2±7.1
0.013±0.005
, 百拇医药
图 1 CFA、FLA和化合物1、2拮抗ET-1缩血管效应的量-效曲线
■FLA ●CFA ▲化合物 化合物
由图1可见，化合物1的母体为CFA，经化学结构改造后，其对ET-1引起的缩血管效应的最大拮抗效能较CFA有了明显提高(P<0.05)，但半数抑制浓度没有明显的变化；而化合物2的母体为FLA，经结构改造后拮抗ET-1缩血管效能未有明显的提高(P>0.05)，从拮抗ET-1缩血管效应的动力学参数分析，FLA及其衍生物的IC50值较CFA及其衍生物小(P<0.01)，表明在等同浓度下，FLA及其衍生物拮抗ET-1缩血管作用的能力较强。
2.2 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用
2.2.1 细胞形态观察 经结晶紫固定染色的培养板晾干后，直接在倒置显微镜下观察，未见明显的细胞形态改变。
, 百拇医药
2.2.2 ET-1刺激RAVSMC增殖的时间-效应关系。
由表2可见，ET-1可刺激RAVSMC增殖，于第2天达峰值，第1、2和第7天的数值与对照相比，细胞增殖率的增加有显著性意义；该作用呈时间依赖性。
表2 ET-1引起RAVSMC增殖的时间效应 时间/d
增殖率/%
ET-1
对照组
1
33.3±25.0**
5.2±3.4
2
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50.0±13.6***
10.8±4.5
7
40.0±9.28**
12.5±6.0
*P>0.05；**P<0.05；***P<0.01
2.2.3 咖啡酸、阿魏酸和CA-1201拮抗ET-1引起RAVSMC增殖 由ET-1引起RAVSMC增殖的时间-效应关系，10 nmol.L-1ET-1与咖啡酸、阿魏酸和CA-1201共孵第2天测定OD(570 nm)值，结果见表3。由表3可见，咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2可显著性地拮抗ET-1引起的RAVSMC增殖(P<0.05)，且该作用具剂量依赖性。
, 百拇医药
表3 咖啡酸、阿魏酸和CA-1201对ET-1引起RAVSMC增殖的抑制作用 组别
OD值/102 (±s)
10-11
10-10
10-9
10-8
咖啡酸
1.2±0.1*2
1.2±0.4*2
1.2±0.8*2
, 百拇医药
0.9±0.1*2
阿魏酸
1.4±0.3*2
1.5±0.7*2
1.2±0.2*2
1.2±0.4*2
化合物1
1.8±0.6*2
1.9±0.2*2
1.6±0.7*2
, 百拇医药
1.40±.3*2
化合物2
2.0±0.8*2
1.8±0.7*1
1.7±0.3*2
1.2±0.2*2
注：空白组为1.6±0.5；ET-1为2.4±0.2与空白组相比，P<0.05；与ET-1组相比，*P>0.05；*1 P<0.05；*2 P<0.013 讨论
CFA和FLA均为苯乙烯型化合物，在传统医学中其具有活血化瘀的功效。在国外有实验室从苯丙烯类化合物中得到ET受体拮抗剂，经实验证明对ET相关性疾病模型的治疗有着良好的前景[4]，但对苯丙烯类化合物的作用则未见报道。CFA和FLA虽然具有一定拮抗ET-1生物效应的作用，但我们希望通过定向合成的方法，得到拮抗活性更高的化合物。肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)是分别以CFA和FLA为母体得到的两个类似物，经实验证明，对ET-1所致缩血管平滑肌细胞增殖效应有明显的抑制作用，为一类新的ET拮抗剂，其对ET作用机制本实验室正在进行深入的研究。
, 百拇医药
* 国家自然科学基金资助项目No.39670886
参考文献
1 王 峰，杨连春，刘 敏等.抗蛇毒中草药拮抗ET-1和S6b作用的初步研究.中国中药杂志，1997，22(10)：620
2 王 峰，杨连春，程言亮等.红背丝绸拮抗内皮素-1生物效应的研究.中国药房，1997，8(4)：160
3 Yang LC,Wang F， Liu M.Study of an endothelin antagonist from a Chinese antisnake venom medicinal herb.J Cardiovasc Pharmacol 1998,31(suppl.1):249
4 Patt WC,Edmunds JJ,Repine JT,et al.Structure-activity relationships in a series of orally active gamma-hydroxy butenolide endothelin antagonists.J Med Chem 1997,40(7):1063
(1998年5月16日收稿), 百拇医药
单位：中国人民解放军空军总医院 北京100036
关键词：桂皮酸；内皮素；拮抗
中国医院药学杂志990502 摘要 目的:对咖啡酸和阿魏酸以及两者化学衍生物肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)拮抗内皮素-1(ET-1)的缩血管及致血管平滑肌细胞增殖效应进行了初步研究。方法:用这四种化合物对ET-1缩血管及致血管平滑肌细胞增殖作用的拮抗效应拮抗进行了研究。结果：咖啡酸和阿魏酸及其衍生物对ET-1缩血管及致血管平滑肌细胞增殖效应有明显的拮抗作用，该作用具剂量依赖性，经药效动力学分析，阿魏酸及其衍生物的拮抗活性显著大于咖啡酸及其衍生物；这四种化合物能剂量依赖性地抑制ET-1致血管平滑肌细胞增殖作用。结论:咖啡酸和阿魏酸及其衍生物为一类新的ET拮抗剂。
, 百拇医药
Study on the antagonist effects of caffeic acid,ferulic acid and their analogs on ET-1 biological responses
Wang Feng,Ji Xiaoshen,Liu Min,et al (Department of Pharmacy,General Hospital of Air Force,Beijing 100036)
ABSTRACT OBJECTIVE:The antagonist effects on vasoconstriction aortic smooth muscle cells proliferation induced by endothelin-1 were investigated on caffeic acid、ferulic acid and their analogs N3-5-methylisoxazolyl-3,4-dihydroxy cinnamoylamide from caffeic acid and N4-antipyryl-4-hydroxy-3-methoxycinnamoylamide.METHODS:The antagonist effects of these compounds on vasoconstriction and aortic smooth muscle cells proliferation induced by ET-1 were studied.RESULTS:The results showed that these four compounds could inhibit vasoconstriction and aortic smooth muscle cells proliferation induced ET-1 with dose-dependent manner,having analyzed the pharmacodynamic parameters,the effects of ferulic acid and its analog were more potent than that of caffeic acid and its analog.CONCLUSIONS:Both caffeic acid、ferulic acid and their analogs can be a new kind of ET-1 antagonists.
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KEY WORDS cinnamic acid,endothelins,antagonist
内皮素(Endothelin,ET)是由21个氨基酸组成的体内活性多肽，具有强大的缩血管和致平滑肌细胞有丝分裂效应，参与多种心脑血管疾病的病理生理过程，为此寻找ET拮抗剂对治疗ET相关性疾病有很大的意义。内皮素与某些蛇毒如sarafotoxin的一级结构极为近似，经基因分析，认为二者源于同一祖基因。我国传统的抗蛇毒中草药对ET-1所致的生物活性作用有一定的拮抗效应，本实验室对抗蛇毒中草药拮抗ET-1作用进行了初步研究，并从植物红背丝绸[Cissus assamica (Laws.) Craib.]的乙酸乙酯成分中分离得到了反式3，4′，5-三羟基芪(CA-1201)并发现其具有拮抗ET-1生物活性的作用[1～3]，根据CA-1201的结构，我们推测并经实验证实了与CA-1201有着近似结构的咖啡酸和阿魏酸同样具有相似的作用。因此，分别合成了咖啡酸和阿魏酸的酰胺衍生物，并对其药理活性进行了初步研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 咖啡酸(Caffeic acid,CFA)；阿魏酸(Ferulic acid,FLA)；ET-1(购自美国sigma公司)；反式-3，4′，5-三羟基芪(CA-1201)由本实验室自中药红背丝绸[Cissus assamica (Laws.) Craib.]的乙酸乙酯成分中分离、鉴定，化学纯度在98%以上；肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)由本实验室合成；SD大鼠购自北京医科大学实验动物部；MB-Ⅲ型酶标检测仪为北京市新技术应用研究所产品。
1.2 方法
1.2.1 N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)的化学合成以咖啡酸和阿魏酸为原料，采用N，N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)为缩合剂，分别和3-氨基-5-甲基异噁唑及4-氨基安替比林进行酰胺化反应，所得产物经1HNMR和MS证实为目标化合物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(2)，纯度大于98%。
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1.2.2 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1缩血管效应的拮抗作用 ♂性SD大鼠，体重230±10 g，将大鼠击昏后快速摘取胸主动脉，经分离结缔组织后，剪成2～3 mm宽的血管环，分别置于Krebs-Henseleit生理溶液(K-H液，pH7.40±0.05，95%O2+5%CO2，37.0℃±0.5℃)中，加2 g基础张力、用10-7 mol.L-1去甲肾上腺素预激二次、平衡、稳定后，加入ET-1 10-9 mol.L-1，待达到最大收缩效应后，分别加入不同浓度的咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2后(用2%DMSO为溶媒，实验用2%DMSO作对照)，经张力换能器连台式平衡记录仪(上海大华仪表厂)，记录血管等张收缩与舒张情况。
1.2.3 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用 取第5代已长成致密单层的兔主动脉血管平滑肌细胞(rabbit aortic vessel smooth muscle cells,RAVSMC)以传代培养法调整细胞数为1×105个.ml-1，接种于96孔培养板100 μl.孔-1，37℃，5%CO2孵育24 h，吸去培养液，换以1%小牛血清的DMEM培养液，加入ET-1(10 nmol.L-1)后继续孵育不同时间后，得到ET-1作用与RAVSMC的时间-效应曲线；加入咖啡酸、阿魏酸、CA-1201后考察其对ET-1致平滑肌细胞的增殖作用。以结晶紫染色后用酶标检测仪在570 nm处测定各孔光密度(OD)值。
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2 结果
2.1 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1缩血管效应的拮抗作用 四种化合物均能明显地拮抗ET-1的缩血管效应，且该拮抗作用具剂量依赖性；药物剂量-效应曲线经sigmiodal方法拟合后，从所得出的效应动力学参数可见，阿魏酸拮抗ET-1缩血管的效能较咖啡酸和CA-1201强(P<0.05)，而咖啡酸和CA-1201之间其拮抗效能无显著性差异(P>0.05)，见表1，图1。
表1 CFA、FLA和化合物1、2拮抗ET-1缩血管效应的药效动力学参数 药 物
Emax/%
±s
IC50/10-6mol.L-1
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CFA
71.0±6.3
1.8±0.8
FLA
92.1±0.8
0.063±0.005
化合物1
102.3±14.3
1.4±1.0
化合物2
101.2±7.1
0.013±0.005
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图 1 CFA、FLA和化合物1、2拮抗ET-1缩血管效应的量-效曲线
■FLA ●CFA ▲化合物 化合物
由图1可见，化合物1的母体为CFA，经化学结构改造后，其对ET-1引起的缩血管效应的最大拮抗效能较CFA有了明显提高(P<0.05)，但半数抑制浓度没有明显的变化；而化合物2的母体为FLA，经结构改造后拮抗ET-1缩血管效能未有明显的提高(P>0.05)，从拮抗ET-1缩血管效应的动力学参数分析，FLA及其衍生物的IC50值较CFA及其衍生物小(P<0.01)，表明在等同浓度下，FLA及其衍生物拮抗ET-1缩血管作用的能力较强。
2.2 咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2对ET-1致血管平滑肌细胞增殖效应的拮抗作用
2.2.1 细胞形态观察 经结晶紫固定染色的培养板晾干后，直接在倒置显微镜下观察，未见明显的细胞形态改变。
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2.2.2 ET-1刺激RAVSMC增殖的时间-效应关系。
由表2可见，ET-1可刺激RAVSMC增殖，于第2天达峰值，第1、2和第7天的数值与对照相比，细胞增殖率的增加有显著性意义；该作用呈时间依赖性。
表2 ET-1引起RAVSMC增殖的时间效应 时间/d
增殖率/%
ET-1
对照组
1
33.3±25.0**
5.2±3.4
2
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50.0±13.6***
10.8±4.5
7
40.0±9.28**
12.5±6.0
*P>0.05；**P<0.05；***P<0.01
2.2.3 咖啡酸、阿魏酸和CA-1201拮抗ET-1引起RAVSMC增殖 由ET-1引起RAVSMC增殖的时间-效应关系，10 nmol.L-1ET-1与咖啡酸、阿魏酸和CA-1201共孵第2天测定OD(570 nm)值，结果见表3。由表3可见，咖啡酸、阿魏酸和化合物1、2可显著性地拮抗ET-1引起的RAVSMC增殖(P<0.05)，且该作用具剂量依赖性。
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表3 咖啡酸、阿魏酸和CA-1201对ET-1引起RAVSMC增殖的抑制作用 组别
OD值/102 (±s)
10-11
10-10
10-9
10-8
咖啡酸
1.2±0.1*2
1.2±0.4*2
1.2±0.8*2
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0.9±0.1*2
阿魏酸
1.4±0.3*2
1.5±0.7*2
1.2±0.2*2
1.2±0.4*2
化合物1
1.8±0.6*2
1.9±0.2*2
1.6±0.7*2
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1.40±.3*2
化合物2
2.0±0.8*2
1.8±0.7*1
1.7±0.3*2
1.2±0.2*2
注：空白组为1.6±0.5；ET-1为2.4±0.2与空白组相比，P<0.05；与ET-1组相比，*P>0.05；*1 P<0.05；*2 P<0.013 讨论
CFA和FLA均为苯乙烯型化合物，在传统医学中其具有活血化瘀的功效。在国外有实验室从苯丙烯类化合物中得到ET受体拮抗剂，经实验证明对ET相关性疾病模型的治疗有着良好的前景[4]，但对苯丙烯类化合物的作用则未见报道。CFA和FLA虽然具有一定拮抗ET-1生物效应的作用，但我们希望通过定向合成的方法，得到拮抗活性更高的化合物。肉桂酰胺类似物N3-(5-甲基异噁唑)基-3，4-二羟基肉桂酰胺(化合物1)和N4-安替比林基-4-羟基-3-甲氧基肉桂酰胺(化合物2)是分别以CFA和FLA为母体得到的两个类似物，经实验证明，对ET-1所致缩血管平滑肌细胞增殖效应有明显的抑制作用，为一类新的ET拮抗剂，其对ET作用机制本实验室正在进行深入的研究。
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参考文献
1 王 峰，杨连春，刘 敏等.抗蛇毒中草药拮抗ET-1和S6b作用的初步研究.中国中药杂志，1997，22(10)：620
2 王 峰，杨连春，程言亮等.红背丝绸拮抗内皮素-1生物效应的研究.中国药房，1997，8(4)：160
3 Yang LC,Wang F， Liu M.Study of an endothelin antagonist from a Chinese antisnake venom medicinal herb.J Cardiovasc Pharmacol 1998,31(suppl.1):249
4 Patt WC,Edmunds JJ,Repine JT,et al.Structure-activity relationships in a series of orally active gamma-hydroxy butenolide endothelin antagonists.J Med Chem 1997,40(7):1063
(1998年5月16日收稿), 百拇医药