固相萃取-反相高效液相色谱法测定全血环孢素A
作者：田辉凯 徐凯建 樊宏伟 吴琳华 徐颖
单位：哈尔滨医科大学附属第二医学院临床药学药物研究所 哈尔滨150086
关键词：环孢素A；高效液相色谱法；药物分析
中国医院药学杂志990509 摘要 目的:采用快速固相萃取-反相高效液相色谱法测定全血环孢素A。方法:全血用水溶血，用乙腈和水混合液沉淀蛋白后，用SPE固相萃取柱萃取，50%甲醇冲洗杂质，95%甲醇洗脱，挥干，乙腈重组，正己烷进一步除去杂质，重组液上机。本法采用柱温为70℃的C18反相色谱柱，以乙腈∶甲醇∶水(3∶1∶1，V∶V)为流动相，检测波长210 nm。结果:本法最低检出浓度为20 ng.ml-1。至少在40～1 500 ng.ml-1范围内呈线性。平均方法回收率102.9%，RSD均在10%以内。结论:本法灵敏，特异，既适合临床常规检测又适合CsA的药动学研究。
, 百拇医药
Quick determination of cyclosporine A in human whole blood by reversed-phase Liquid Chromatography with solid-phase extration
Tian Huikai,Xu Kaijian,Fan Hongwei,et al. (The Second Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086)
ABSTRACT OBJECTIVE:To develop a reversed-phase liquid chromatographic method utilizing,a solid-phase extraction procedure for the determination of cyclosporine A (CsA) in human whole blood.METHODS:The drug was extracted from whole blood by solid-phase extraction,then separated isocratically using a C18 column and a mobile phase of acetonitrile-methanol-water (3∶1∶1).The column temperature was maintained at 70℃.The wavelength used for detection was 210nm. The cyclosporine D was used as interal standard.RESULTS:The lowest limit of detection of CsA was 20ng.ml-1.A linear relationship was good at least from 40ng.ml-1 to 1500ng.ml-1.The average recoveries of CsA were 102.9% for whole blood.RSD values of within-day and between-day were all lower than 10%.CONCLUSIONS:The method is simple and accurate.It is suitable not only for routine determination of CsA but also for the study of pharmacokinetics of CsA.
, 百拇医药
KEY WORDS cyclosporine A,HPLC,Pharmaceutical analysis
环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种强效、 高选择性的免疫抑制剂，临床上广泛用于器官移植和其它疾病的治疗[1.2]。由于CsA体内过程个体差异大，治疗窗窄，因此应在治疗过程中常规监测其血药浓度，以减少毒副反应的发生，优化给药方案。目前测定CsA的各种免疫分析方法不同程度地受其代谢物的干扰，特异性和准确性差。实际中采用高效液相色谱(HPLC)法较多，由于全血样品成份复杂，国内外报道均需液-液萃取等多重步骤提取，操作复杂，检测时间长，难以适应临床常规监测的要求[3.4]。本文推荐一种全血样品的快速固相萃取方法，操作简便，回收率高，适于临床常规药物监测，对于CsA的药动学和生物利用度研究，以及药物剂型的改进也具有重要意义。
1 仪器与试药
, http://www.100md.com
1.1 仪器 美国Waters公司2010高效液相色谱系统(616泵，717自动进样器，996紫外二级管矩阵检测器，柱温箱，Millennium2010色谱管理系统和在线脱气机)；纯水制备仪(美国Millipore公司)；DL-1固相萃取(SPE)样品净化富集预处理器(大连化学物理研究所)；SPE固相萃取预处理小柱(C18，100，200，400 mg/支，大连化学物理研究所)。
1.2 试剂 甲醇和乙腈为色谱纯；正己烷和磷酸为分析纯；水为超纯水。
1.3 药品 CsA标准品和作内标的环孢素D标准品(福建省微生物研究所)。
2 方法
2.1 样品预处理 取1ml肝素化抗凝全血，加入1.5 ml水，旋涡振荡20 s，除空白管外均加入2ml内标应用液(乙腈∶水，3∶10，600 ng.ml-1)，空白加入不含内标的乙腈∶水(3∶10)溶液2 ml，振荡20 s，以3 000 r.min-1离心2 min。安装样品净化富集预处理器，活化SPE小柱(方法：先用10 ml甲醇冲柱，再用10 ml水冲柱)，上清液倾入柱中，以15%乙腈1 ml 冲洗，50%甲醇4 ml 冲洗，抽干，95%甲醇1 ml洗脱，收集洗脱液，40℃水浴，氮气挥干。残渣用200 μl乙腈溶解，用正已烷1 ml萃取两次，上层弃去，下层上机，进样量20 μl。
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2.2 色谱条件 柱：C18不锈钢柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，柱温：70℃，流动相：乙腈∶甲醇∶水(3∶1∶1)，流速：1.5 ml.min-1，检测波长：210 nm。
3 结果
3.1 色谱行为 无内源物质和其它药物干扰，CsA内标达基线分离，分离度大于1.5。CsA和环孢素D(内标)的保留时间分别为7.5 min和9.0 min，色谱分析在12 min内完成。见图1，2。
图 1 空白全血色谱图
图 2 样品色谱图 a:CsA b:CsD
3.2 标准曲线的制备 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为40，100，200，500，1 000，1 500 ng.ml-1的全血标准液。按样品预处理过程操作，记录峰高，求出峰高比，以浓度X对峰高比Y作线性回归，得回归方程：Y=0.012 0+0.001 5X,r=0.999 3。全血CsA浓度与峰高比的线性关系良好，至少在40～1 500 ng.ml-1范围内呈线性。
, 百拇医药
3.3 最低检测限 以信噪比(S/N)等于3计，本法的最低检测限2 ng，最低检测浓度为20 ng.ml-1。
3.4 回收率实验 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为40，100，500，1 000 ng.ml-1的全血标准液。按样品预处理过程操作，记录峰高，计算回收率，结果见表1。
表1 全血中CsA的回收率(±s，n=5) 浓度/ng.ml-1
提取回收率/%
RSD/%
方法回收率/%
RSD/%
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40
90.0±5.3
6.8
107.8±5.8
5.4
100
88.0±4.6
5.3
106.5±6.7
6.3
500
89.4±4.6
5.1
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96.2±4.3
4.6
1000
83.8±4.7
4.1
101.9±5.3
5.2
3.5 方法的精密度实验 取肝素化健康献血者全血配制成3个浓度的全血CsA样品，取1 ml按全血样品预处理过程操作，测得日内和日间相对标准偏差，结果见表2。表2 方法的日内和日间精密度(±s，n=5) 浓度
ng.ml-1
日内精密度
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日间精密度
测得量/mg.ml-1
RSD/%
测得量/mg.ml-1
RSD/%
100
106.5±6.7
6.3
111.4±8.7
7.2
500
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481.1±21.3
4.6
479.5±21.3
4.5
1 000
1 019.4±53.0
5.2
1 022.7±62.3
6.1
3.6 固相萃取柱间提取回收率比较 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为100，1 000 ng.ml-1的全血标准液，分别用大连化物所产的每支100， 200和400 mg的固相萃取柱，按样品处理过程操作，测得柱间回收率，结果见表3。表3 柱间提取回收率比较(n=5) 浓度
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ng.ml-1
100mg
200mg
400mg
±s
%
RSD
%
±s
%
RSD
%
±s
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%
RSD
%
100
70.3±3.4
4.9
88.0±4.6
5.3
96.1±4.1
4.2
1 000
63.1±8.3
13.2
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83.8±4.7
4.1
91.0±5.5
6.0
4 讨论
4.1 样品的选择 一般认为样品的选择是很重要的，Britton等[5.6]的研究表明，CsA广泛分布于所有血液组分中，由于温度直接影响CsA与血浆蛋白(主要是脂蛋白)的结合率和红细胞对CsA的摄取能力，即CsA在血中的分布依赖于温度。因此测定不同温度下分离的血清(或浆)其测定结果差别很大，又由于全血与血清或血浆相比有较高的CsA浓度，并且可以排除温度效应，故本实验选用全血作为检测的样品。
4.2 样品的预处理
4.2.1 SPE固相萃取柱的选择 我们比较了每支100，200，400 mg固相萃取柱的提取回收率，发现在低浓度时各柱间无明显差别，但在较高浓度时100 mg柱的提取回收率明显下降，已不能满足分析要求。提示其保留CsA的能力与容量有限，而200 mg柱与400 mg柱无明显差别，均能满足分析要求，考虑到经济原因，故选用每支200 mg的固相萃取柱。
, 百拇医药
4.2.2 活化方法的选择 最初我们采用国外报道的方法活化柱，即先用95%甲醇3 ml冲柱，后用15%的乙腈3 ml冲柱[7.8]，但在CsA出峰时总是一个很大的干扰峰干扰，经反复摸索发现，此干扰峰来自于固相萃取柱本身。为此我们更改了柱的活化方法，确定甲醇10 ml和水10 ml冲柱已完全能除去柱中杂质，消除来自在于固相萃取柱本身的干扰，且能充分活化小柱。
4.2.3 冲洗液的选择 根据国外报道的方法用50%甲醇10 ml冲洗柱中杂质[7.8]，但回收率总是很低，不能满足要求。经反复摸索发现冲洗液(50%甲醇)的用量与杂质峰和回收率相关，我们对比了应用0，1，2，3，4，5，6，8 ml的冲洗液冲洗的效果，发现4 ml的50%甲醇已能除去大部分杂质，后用1 ml的正已烷萃取两次，已能完全除去干扰物质，获得好的回收率和色谱峰。
4.3 色谱条件
, http://www.100md.com 4.3.1 流动相的选择 最初我们应用二元流动相体系(乙腈∶水)，但在CsA出峰时总有一小的干扰峰，改变流动相比例也不能分开，最后改用三元流动相(乙腈∶甲醇∶水)，增加甲醇对CsA保留时间的影响不大，但使干扰峰前移，获得了很好的色谱峰。
4.3.2 柱温的选择 测定CsA通常要求较高的柱温，大多数C18-烷基键合相柱需70℃～75℃的温度，C8-或氰基键合柱需要50℃～60℃的温度。我们观察了温度对CsA和CsD(内标)的色谱行为的影响，结果表明，升高柱温保留时间虽稍有缩短，然而峰形和分辨率确得到了有意义的改善，且在70℃～75℃时最佳。提示CsA的结构显著受分子内氢键的影响，正是这种温度依赖性结构变化影响CsA的色谱行为。
参考文献
1 Cohen DJ,Loertscher R,Rubin MF，et al.Cyclosporine A:a new immunosuppressive agent for organ transplantation.Ann Intern Med,1984,101:667
, http://www.100md.com
2 Borel JF.The cyclosporines.Transplant Proc,1989,21:810
3 梁 玉，吴莱文.高效液相色谱法测定全血环孢霉素A.中华医学检验杂志，1992，15(4)：206
4 Ajit K,Shah,Ronald J,et al.Improved Liquid-Chromatographic determination of cyclosporine and its metabolites in blood.Clin Chem,1988,34(7):1467
5 Britton K,Atkinson K,Biggs J,et al.Distribution and binding of cyclosporine in blood.Transplant Proc,1984,16(4):961
, 百拇医药
6 Annesley T,Giacherio D,Feldkamp C.The concentration related distribution of cyclosporine in blood.J Clin Immunoassay,1986,9:53
7 Pokar M,Kabra,Jeffery H,et al.Solid-Phase extration and liquid chromatography for improved assay of cyclosporine in wholde blood or plasma.Clin Chem,1985,31(10):1717
8 Gary L,Lensmeyer,Barry L,et al.Improved Liquid-Chromatographic determination of cyclosporine,with concomitant detection of a cell-bond metabolite.Clin Chem,1985,31(2):196
(1998年7月13日收稿), http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学附属第二医学院临床药学药物研究所 哈尔滨150086
关键词：环孢素A；高效液相色谱法；药物分析
中国医院药学杂志990509 摘要 目的:采用快速固相萃取-反相高效液相色谱法测定全血环孢素A。方法:全血用水溶血，用乙腈和水混合液沉淀蛋白后，用SPE固相萃取柱萃取，50%甲醇冲洗杂质，95%甲醇洗脱，挥干，乙腈重组，正己烷进一步除去杂质，重组液上机。本法采用柱温为70℃的C18反相色谱柱，以乙腈∶甲醇∶水(3∶1∶1，V∶V)为流动相，检测波长210 nm。结果:本法最低检出浓度为20 ng.ml-1。至少在40～1 500 ng.ml-1范围内呈线性。平均方法回收率102.9%，RSD均在10%以内。结论:本法灵敏，特异，既适合临床常规检测又适合CsA的药动学研究。
, 百拇医药
Quick determination of cyclosporine A in human whole blood by reversed-phase Liquid Chromatography with solid-phase extration
Tian Huikai,Xu Kaijian,Fan Hongwei,et al. (The Second Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086)
ABSTRACT OBJECTIVE:To develop a reversed-phase liquid chromatographic method utilizing,a solid-phase extraction procedure for the determination of cyclosporine A (CsA) in human whole blood.METHODS:The drug was extracted from whole blood by solid-phase extraction,then separated isocratically using a C18 column and a mobile phase of acetonitrile-methanol-water (3∶1∶1).The column temperature was maintained at 70℃.The wavelength used for detection was 210nm. The cyclosporine D was used as interal standard.RESULTS:The lowest limit of detection of CsA was 20ng.ml-1.A linear relationship was good at least from 40ng.ml-1 to 1500ng.ml-1.The average recoveries of CsA were 102.9% for whole blood.RSD values of within-day and between-day were all lower than 10%.CONCLUSIONS:The method is simple and accurate.It is suitable not only for routine determination of CsA but also for the study of pharmacokinetics of CsA.
, 百拇医药
KEY WORDS cyclosporine A,HPLC,Pharmaceutical analysis
环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种强效、 高选择性的免疫抑制剂，临床上广泛用于器官移植和其它疾病的治疗[1.2]。由于CsA体内过程个体差异大，治疗窗窄，因此应在治疗过程中常规监测其血药浓度，以减少毒副反应的发生，优化给药方案。目前测定CsA的各种免疫分析方法不同程度地受其代谢物的干扰，特异性和准确性差。实际中采用高效液相色谱(HPLC)法较多，由于全血样品成份复杂，国内外报道均需液-液萃取等多重步骤提取，操作复杂，检测时间长，难以适应临床常规监测的要求[3.4]。本文推荐一种全血样品的快速固相萃取方法，操作简便，回收率高，适于临床常规药物监测，对于CsA的药动学和生物利用度研究，以及药物剂型的改进也具有重要意义。
1 仪器与试药
, http://www.100md.com
1.1 仪器 美国Waters公司2010高效液相色谱系统(616泵，717自动进样器，996紫外二级管矩阵检测器，柱温箱，Millennium2010色谱管理系统和在线脱气机)；纯水制备仪(美国Millipore公司)；DL-1固相萃取(SPE)样品净化富集预处理器(大连化学物理研究所)；SPE固相萃取预处理小柱(C18，100，200，400 mg/支，大连化学物理研究所)。
1.2 试剂 甲醇和乙腈为色谱纯；正己烷和磷酸为分析纯；水为超纯水。
1.3 药品 CsA标准品和作内标的环孢素D标准品(福建省微生物研究所)。
2 方法
2.1 样品预处理 取1ml肝素化抗凝全血，加入1.5 ml水，旋涡振荡20 s，除空白管外均加入2ml内标应用液(乙腈∶水，3∶10，600 ng.ml-1)，空白加入不含内标的乙腈∶水(3∶10)溶液2 ml，振荡20 s，以3 000 r.min-1离心2 min。安装样品净化富集预处理器，活化SPE小柱(方法：先用10 ml甲醇冲柱，再用10 ml水冲柱)，上清液倾入柱中，以15%乙腈1 ml 冲洗，50%甲醇4 ml 冲洗，抽干，95%甲醇1 ml洗脱，收集洗脱液，40℃水浴，氮气挥干。残渣用200 μl乙腈溶解，用正已烷1 ml萃取两次，上层弃去，下层上机，进样量20 μl。
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2.2 色谱条件 柱：C18不锈钢柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，柱温：70℃，流动相：乙腈∶甲醇∶水(3∶1∶1)，流速：1.5 ml.min-1，检测波长：210 nm。
3 结果
3.1 色谱行为 无内源物质和其它药物干扰，CsA内标达基线分离，分离度大于1.5。CsA和环孢素D(内标)的保留时间分别为7.5 min和9.0 min，色谱分析在12 min内完成。见图1，2。
图 1 空白全血色谱图
图 2 样品色谱图 a:CsA b:CsD
3.2 标准曲线的制备 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为40，100，200，500，1 000，1 500 ng.ml-1的全血标准液。按样品预处理过程操作，记录峰高，求出峰高比，以浓度X对峰高比Y作线性回归，得回归方程：Y=0.012 0+0.001 5X,r=0.999 3。全血CsA浓度与峰高比的线性关系良好，至少在40～1 500 ng.ml-1范围内呈线性。
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3.3 最低检测限 以信噪比(S/N)等于3计，本法的最低检测限2 ng，最低检测浓度为20 ng.ml-1。
3.4 回收率实验 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为40，100，500，1 000 ng.ml-1的全血标准液。按样品预处理过程操作，记录峰高，计算回收率，结果见表1。
表1 全血中CsA的回收率(±s，n=5) 浓度/ng.ml-1
提取回收率/%
RSD/%
方法回收率/%
RSD/%
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40
90.0±5.3
6.8
107.8±5.8
5.4
100
88.0±4.6
5.3
106.5±6.7
6.3
500
89.4±4.6
5.1
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96.2±4.3
4.6
1000
83.8±4.7
4.1
101.9±5.3
5.2
3.5 方法的精密度实验 取肝素化健康献血者全血配制成3个浓度的全血CsA样品，取1 ml按全血样品预处理过程操作，测得日内和日间相对标准偏差，结果见表2。表2 方法的日内和日间精密度(±s，n=5) 浓度
ng.ml-1
日内精密度
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日间精密度
测得量/mg.ml-1
RSD/%
测得量/mg.ml-1
RSD/%
100
106.5±6.7
6.3
111.4±8.7
7.2
500
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481.1±21.3
4.6
479.5±21.3
4.5
1 000
1 019.4±53.0
5.2
1 022.7±62.3
6.1
3.6 固相萃取柱间提取回收率比较 取肝素化全血1 ml，精密加入不同量的CsA标准品，配制成浓度分别为100，1 000 ng.ml-1的全血标准液，分别用大连化物所产的每支100， 200和400 mg的固相萃取柱，按样品处理过程操作，测得柱间回收率，结果见表3。表3 柱间提取回收率比较(n=5) 浓度
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ng.ml-1
100mg
200mg
400mg
±s
%
RSD
%
±s
%
RSD
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±s
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%
RSD
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100
70.3±3.4
4.9
88.0±4.6
5.3
96.1±4.1
4.2
1 000
63.1±8.3
13.2
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83.8±4.7
4.1
91.0±5.5
6.0
4 讨论
4.1 样品的选择 一般认为样品的选择是很重要的，Britton等[5.6]的研究表明，CsA广泛分布于所有血液组分中，由于温度直接影响CsA与血浆蛋白(主要是脂蛋白)的结合率和红细胞对CsA的摄取能力，即CsA在血中的分布依赖于温度。因此测定不同温度下分离的血清(或浆)其测定结果差别很大，又由于全血与血清或血浆相比有较高的CsA浓度，并且可以排除温度效应，故本实验选用全血作为检测的样品。
4.2 样品的预处理
4.2.1 SPE固相萃取柱的选择 我们比较了每支100，200，400 mg固相萃取柱的提取回收率，发现在低浓度时各柱间无明显差别，但在较高浓度时100 mg柱的提取回收率明显下降，已不能满足分析要求。提示其保留CsA的能力与容量有限，而200 mg柱与400 mg柱无明显差别，均能满足分析要求，考虑到经济原因，故选用每支200 mg的固相萃取柱。
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4.2.2 活化方法的选择 最初我们采用国外报道的方法活化柱，即先用95%甲醇3 ml冲柱，后用15%的乙腈3 ml冲柱[7.8]，但在CsA出峰时总是一个很大的干扰峰干扰，经反复摸索发现，此干扰峰来自于固相萃取柱本身。为此我们更改了柱的活化方法，确定甲醇10 ml和水10 ml冲柱已完全能除去柱中杂质，消除来自在于固相萃取柱本身的干扰，且能充分活化小柱。
4.2.3 冲洗液的选择 根据国外报道的方法用50%甲醇10 ml冲洗柱中杂质[7.8]，但回收率总是很低，不能满足要求。经反复摸索发现冲洗液(50%甲醇)的用量与杂质峰和回收率相关，我们对比了应用0，1，2，3，4，5，6，8 ml的冲洗液冲洗的效果，发现4 ml的50%甲醇已能除去大部分杂质，后用1 ml的正已烷萃取两次，已能完全除去干扰物质，获得好的回收率和色谱峰。
4.3 色谱条件
, http://www.100md.com 4.3.1 流动相的选择 最初我们应用二元流动相体系(乙腈∶水)，但在CsA出峰时总有一小的干扰峰，改变流动相比例也不能分开，最后改用三元流动相(乙腈∶甲醇∶水)，增加甲醇对CsA保留时间的影响不大，但使干扰峰前移，获得了很好的色谱峰。
4.3.2 柱温的选择 测定CsA通常要求较高的柱温，大多数C18-烷基键合相柱需70℃～75℃的温度，C8-或氰基键合柱需要50℃～60℃的温度。我们观察了温度对CsA和CsD(内标)的色谱行为的影响，结果表明，升高柱温保留时间虽稍有缩短，然而峰形和分辨率确得到了有意义的改善，且在70℃～75℃时最佳。提示CsA的结构显著受分子内氢键的影响，正是这种温度依赖性结构变化影响CsA的色谱行为。
参考文献
1 Cohen DJ,Loertscher R,Rubin MF，et al.Cyclosporine A:a new immunosuppressive agent for organ transplantation.Ann Intern Med,1984,101:667
, http://www.100md.com
2 Borel JF.The cyclosporines.Transplant Proc,1989,21:810
3 梁 玉，吴莱文.高效液相色谱法测定全血环孢霉素A.中华医学检验杂志，1992，15(4)：206
4 Ajit K,Shah,Ronald J,et al.Improved Liquid-Chromatographic determination of cyclosporine and its metabolites in blood.Clin Chem,1988,34(7):1467
5 Britton K,Atkinson K,Biggs J,et al.Distribution and binding of cyclosporine in blood.Transplant Proc,1984,16(4):961
, 百拇医药
6 Annesley T,Giacherio D,Feldkamp C.The concentration related distribution of cyclosporine in blood.J Clin Immunoassay,1986,9:53
7 Pokar M,Kabra,Jeffery H,et al.Solid-Phase extration and liquid chromatography for improved assay of cyclosporine in wholde blood or plasma.Clin Chem,1985,31(10):1717
8 Gary L,Lensmeyer,Barry L,et al.Improved Liquid-Chromatographic determination of cyclosporine,with concomitant detection of a cell-bond metabolite.Clin Chem,1985,31(2):196
(1998年7月13日收稿), http://www.100md.com