体内体外联合免疫法制备抗鼻咽癌单克隆抗体
作者：李官成 朱建高 周国华 孙去病
单位：湖南医科大学肿瘤研究所(长沙 410078)
关键词：鼻咽肿瘤；癌；抗体，克隆；抗体，肿瘤
湖南医学990503 摘要 目的 获得高特异性的抗鼻咽癌单克隆抗体。方法 以湖南鼻咽癌细胞株HNE2细胞作免疫原，经体内体外联合免疫方法获得免疫脾细胞，并与SP2/0骨髓瘤细胞融合获得抗鼻咽癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，用ELISA、免疫组化筛选阳性克隆。结果 获得10株稳定分泌抗鼻咽癌单克隆抗体的杂交瘤，其中HNL1和HNL5用免疫组化检测对鼻咽癌组织反应的阳性率分别为60.0%和65.0%。结论 抗鼻咽癌单克隆抗体HNL1，HNL5对鼻咽癌有较好的选择性。
Preparation of Monoclonal Antibodies Against Nasopharyngeal Cancer by in vivo and vitro Combining Immunization
, http://www.100md.com
LI Guancheng，ZHU Jiangao，ZHOU Guohua，SUN Qubing
Cancer Research Institute,Hunan Medical University，Changsha，410078
Abstract Objective To achieve highly specific monoclonal antibody against Nasopharyngeal Cancer (NPC).Methods Using Hunan NPC cell lines (HNE2) as immunogen, hybridoma cell lines were obtained through fusion of SP2/0 myeloma cells with immunized murine spleen cells by in vivo and vitro combining immunization. The positive clones were screened by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunohistochemical method.Results Ten hybridoma cell lines secreting stable anti-NPC monoclonal antibody were generated.As shown by indirect immunohistochemical detection, the percentages of positive reaction to NPC tissue samples were 60.0% for HNL1 and 65.0% for HNL5 respectively.Conclusion Anti-NPC monoclonal antibody HNL1 and HNL5 exhibit fairly good specificity for NPC.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasms;antibodies,monoclonal;antibodies,neoplasm
鼻咽癌是我国南方和东南亚国家常见的恶性肿瘤之一，目前对鼻咽癌单克隆抗体的研究，国外尚未见有报道。国内崔运昌等[1]用鼻咽癌细胞株CNE2为抗原，获得三株抗鼻咽癌单克隆抗体；孙去病等[2]用另一细胞株CNE1作免疫原， 也获得12株杂交瘤细胞系。笔者用湖南鼻咽癌细胞株HNE2为免疫原，经体内体外联合免疫的方法用B淋巴细胞杂交瘤技术，建立新的能分泌抗鼻咽癌抗体的杂交瘤细胞系， 以期获得有较好特异性的抗鼻咽癌单克隆抗体。
1 材料与方法
1.1 免疫原及免疫方案 以HNE2细胞株及HNE2细胞中提取的粗抗原为免疫原[3]。采用体内和体外联合免疫方法，即按常规给Balb/C小鼠腹腔注射107 HNE2细胞，共3次，每次间隔两周，第3次注射2周后拉颈处死小鼠，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液，并用20 ml含20%小牛血清的DMEM混悬细胞，加入rHu IL-2，rHu IL-6，PWM和无菌HNE2粗抗原，使其终浓度分别为200 u/ml，500 u/ml，1:200和10 μg/ml，置5% CO2 孵育箱中37 ℃培养5 d后，收获细胞，苔盼蓝着色计数。
, http://www.100md.com
1.2 细胞融合[4] 将上述免疫脾细胞与SP2/0细胞按2:1比例混合，在50%聚乙二醇(PEG，MW1500，BDH Chemical Co.)作用下融合。融合的杂交细胞配成30 ml的DMEM 细胞悬液，平均分配于三块96孔板，于次日半量换含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的HAT选择培基。以后每2～3 d给培养孔半量换液，二周后用HT培基。取杂交瘤生长的上清液用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选。阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100%时，扩大培养，液氮保存。
1.3 鼻咽癌单克隆抗体的特异性鉴定
1.3.1 ELISA法 采用8株细胞，其中3株鼻咽癌细胞(HNE2，HNE3，CNE2)，2株大肠癌细胞(HRT-18，LS174T)；肺癌细胞(A549)，宫颈癌细胞(Hela)，正常成纤维细胞(HEL)各1株。上述细胞接种于96孔培养板，每孔约5×104个细胞。当细胞贴壁形成单层细胞后用0.15%戊二醛溶液固定10 min，PBS洗三次，用1%牛血清白蛋白封闭后，加杂交瘤上清，37 ℃孵育2 h或4℃过夜，然后加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的IgG+IgA+IgM(Zymed Lab. Inc. USA)，37 ℃作用2 h，再加0.03% H2O2的ABTS 底物溶液显色20 min，EL309型酶标仪(Bio-Tek Instruments，Inc.)测OD405。
, 百拇医药
1.3.2 免疫组化 石蜡组织切片经二甲苯脱蜡，依次经100%，95%，75%乙醇水化后，用0.5%H2O2甲醇溶液阻断内源性过氧化酶活性，加20%正常兔血清作用20 min，再加杂交瘤培养上清37 ℃ 2 h或4 ℃过夜。PBS洗后，加辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG+IgA+IgM，37 ℃作用30 min。PBS洗三次，加底物DAB显色5 min，蒸馏水终止染色。切片经苏木素复染、盐酸分色、碳酸锂蓝化后，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片、镜检。以PBS作为阴性对照。
1.3.3 抗体类型鉴定 将杂交瘤培养上清5倍浓缩后，用双向免疫扩散方法鉴定抗体类型。
2 结果
2.1 鼻咽癌杂交瘤细胞株的建立 经过腹腔基础免疫后，抗HNE2的抗血清效价为1:1 000，取其脾细胞加细胞因子、丝裂原和特异性抗原在体外进行免疫诱导，虽然细胞总数无明显增多，但淋巴母细胞的比例显著增多。与SP2/0细胞融合，有88.5%的细胞培养孔产生了杂交瘤，每孔上清应用细胞抗原HNE2进行间接ELISA筛选，获得10 株稳定分泌抗靶细胞抗体的杂交瘤，命名为HNL1～HNL10。对这10株细胞进行二次有限稀释，克隆化。
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2.2 细胞株选择性检测 10株杂交瘤细胞系的单克隆抗体对7株癌细胞和正常成纤维细胞的ELISA检测，其结果见表1。ELISA结果显示:HNL1、HNL5 除对一株大肠癌细胞呈阳性反应外，对其他肿瘤细胞和正常细胞均为阴性，而对三株鼻咽癌细胞呈强阳性或阳性反应，说明HNL1和HNL5具有较好的选择性。
表1 10株鼻咽癌单抗的酶联免疫反应* 细胞株
HNL1
HNL2
HNL3
HNL4
HNL5
HNL6
HNL7
, http://www.100md.com
HNL8
HNL9
HNL10
HNE2
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
+++
++
, http://www.100md.com
++
HNE3
+++
++
++
++
++
+
++
++
+++
+++
CNE2
, http://www.100md.com ++
++
++
++
+++
+
+++
+++
++
+++
Hela
-
++
-
, 百拇医药
+
-
-
++
++
-
+
A549
-
+++
-
+
-
+
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++
+
-
+
HT29
-
+
-
-
-
-
+
+
-
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++
LS174T
+
++
++
+
+
+
++
++
+
+
HEL
-
, 百拇医药
+++
-
+
-
-
++
++
++
-
*+++：强阳性(OD405>1.0)；++：阳性(0.5
2.3 抗体类型鉴定 琼脂双向免疫扩散试验结果显示HNL1和HNL5均为IgG。
, 百拇医药
2.4 免疫组化 10株杂交瘤细胞株中，HNL1和HNL5分泌的单克隆抗体表现出较好的选择性，因此，对这两株抗体的特异性作了进一步鉴定，用鼻咽癌细胞株HNE2作间接免疫组化检测发现，两抗体的作用部位为癌细胞膜(见封三附图)。用间接免疫组化检测两抗体对鼻咽癌组织反应的阳性率，HNL1为60.0%，HNL5为65.0%(表2)。两抗体对其他组织的反应结果(表3)：HNL5对11例非鼻咽癌组织和3例鼻息肉均显示阴性结果；而HNL1除在4例肺癌组织，有2例可疑阳性，1例阳性外，对其他非鼻咽肿瘤及鼻息肉为阴性。两抗体对胚胎组织的反应结果亦显示：HNL5对胚胎心、肺、肾、肠、皮肤均为阴性反应。HNL1对胚胎肺为可疑阳性反应，3例胚胎肾有2例可疑阳性，1例阳性，余为阴性。
附图 单克隆抗体HNL1(A)和HNL5(B)对鼻咽癌细胞珠(HNE2)的免疫组化染色(×400)
, 百拇医药
表2 HNL1和HNL5对鼻咽癌组织的免疫组化结果* 抗体
总例数
阳性数(%)
-
+
++
HNL1
20
12(60.0)
8
7
5
, 百拇医药 HNL5
20
13(65.0)
7
10
3
*-：阴性；+：少于10%癌细胞弱染色；+++10%以上癌细胞染色表3 两抗体对非鼻咽癌和胚胎组织的免疫组化结果* 病理诊断
HNL1
HNL5
T
-
±
, 百拇医药
+
T
-
±
+
肺癌
4
1
2
1
4
4
0
0
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乳癌
3
3
0
0
3
3
0
0
口腔鳞癌
1
1
0
0
, http://www.100md.com
1
1
0
0
结直肠癌
1
1
0
0
1
1
0
0
皮肤转移癌
, 百拇医药
1
1
0
0
1
1
0
0
纤维瘤
1
1
0
0
1
, 百拇医药
1
0
0
鼻息肉
3
3
0
0
3
3
0
0
胚胎组织
心
, 百拇医药
4
4
0
0
4
4
0
0
肠
1
1
0
0
1
, http://www.100md.com
1
0
0
皮肤
2
2
0
0
2
2
0
0
肺
3
, 百拇医药
0
3
0
3
3
0
0
肾
3
0
2
1
3
3
, 百拇医药
0
0
*T：样本数；-：阴性；±：可疑阳性；+：阳性
3 讨论
在抗肿瘤杂交瘤的研制中，免疫方式选择对于获得高质量的单克隆抗体是重要的因素之一。不同的实验室常采用不同的方法。一般多采用体内免疫方式，也有用体外免疫方法[5，6]。本实验采用体内和体外联合免疫诱导方式，结果显示：体内免疫后经体外免疫诱导虽不能使细胞数明显增多，但淋巴母细胞的比例却显著增多，而且与SP2/0细胞融合后，有88.5%的细胞培养孔产生了杂交瘤。而用体内免疫方式获得的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，仅35.5%的细胞培养孔产生杂交瘤[2]。融合率增高，有利于提高筛选的阳性率。其机理可能为：IL-2有促进B细胞增殖和分化的作用；IL-6能诱导已活化的B细胞分化为抗体分泌细胞，而PWM作为丝裂原可促进B细胞的活化和增殖。
, 百拇医药
鼻咽癌细胞株HNE2，HNE3和CNE2虽为三株不同的细胞，但10株抗体的ELISA反应是相似的，有明显的交叉反应；而且10株杂交瘤对肺癌和肠癌有明显的反应，部分抗体对宫颈癌和正常成纤维细胞亦有反应，说明这些抗体作用的是肿瘤相关抗原。免疫组化结果表明，HNL1和HNL5两抗体对其他良恶性细胞除个别有阳性反应外，基本表现为阴性反应，提示HNL1和HNL5的针对抗原在这些组织分布甚微或不存在，也表明这两种抗体对鼻咽癌有较好的选择性。
参考文献
1 崔运昌，汪美先，王伯潭，等.人鼻咽癌上皮样细胞系的单克隆抗体(简报).第四军医大学学报，1984，5:209～211
2 孙去病，郭敏，李小玲，等.鼻咽癌的单克隆抗体研究：杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定.湖南医学院学报，1987，12(1):1～3
3 李官成，孙去病.肿瘤相关抗原CA-Hb3对大肠癌血清学诊断的价值. 中国肿瘤临床，1996，23(3)：173～177
, 百拇医药
4 Sun Qubing,Ho JJL,.Human colonic cancer associated antigens detected by three monoclonal antibodies.Chinese Medicine，1986，99(1):63～74
5 Reading CL.Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production.J Immunol Methods，1982，53(3):261～291
6 Holley MC.A simple in vitro method for raising monoclonal antibodies to cochlear proteins.Tissue and Cell，1992，24:613
(19990603 收稿), 百拇医药
单位：湖南医科大学肿瘤研究所(长沙 410078)
关键词：鼻咽肿瘤；癌；抗体，克隆；抗体，肿瘤
湖南医学990503 摘要 目的 获得高特异性的抗鼻咽癌单克隆抗体。方法 以湖南鼻咽癌细胞株HNE2细胞作免疫原，经体内体外联合免疫方法获得免疫脾细胞，并与SP2/0骨髓瘤细胞融合获得抗鼻咽癌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，用ELISA、免疫组化筛选阳性克隆。结果 获得10株稳定分泌抗鼻咽癌单克隆抗体的杂交瘤，其中HNL1和HNL5用免疫组化检测对鼻咽癌组织反应的阳性率分别为60.0%和65.0%。结论 抗鼻咽癌单克隆抗体HNL1，HNL5对鼻咽癌有较好的选择性。
Preparation of Monoclonal Antibodies Against Nasopharyngeal Cancer by in vivo and vitro Combining Immunization
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LI Guancheng，ZHU Jiangao，ZHOU Guohua，SUN Qubing
Cancer Research Institute,Hunan Medical University，Changsha，410078
Abstract Objective To achieve highly specific monoclonal antibody against Nasopharyngeal Cancer (NPC).Methods Using Hunan NPC cell lines (HNE2) as immunogen, hybridoma cell lines were obtained through fusion of SP2/0 myeloma cells with immunized murine spleen cells by in vivo and vitro combining immunization. The positive clones were screened by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunohistochemical method.Results Ten hybridoma cell lines secreting stable anti-NPC monoclonal antibody were generated.As shown by indirect immunohistochemical detection, the percentages of positive reaction to NPC tissue samples were 60.0% for HNL1 and 65.0% for HNL5 respectively.Conclusion Anti-NPC monoclonal antibody HNL1 and HNL5 exhibit fairly good specificity for NPC.
, 百拇医药
Key words nasopharyngeal neoplasms;antibodies,monoclonal;antibodies,neoplasm
鼻咽癌是我国南方和东南亚国家常见的恶性肿瘤之一，目前对鼻咽癌单克隆抗体的研究，国外尚未见有报道。国内崔运昌等[1]用鼻咽癌细胞株CNE2为抗原，获得三株抗鼻咽癌单克隆抗体；孙去病等[2]用另一细胞株CNE1作免疫原， 也获得12株杂交瘤细胞系。笔者用湖南鼻咽癌细胞株HNE2为免疫原，经体内体外联合免疫的方法用B淋巴细胞杂交瘤技术，建立新的能分泌抗鼻咽癌抗体的杂交瘤细胞系， 以期获得有较好特异性的抗鼻咽癌单克隆抗体。
1 材料与方法
1.1 免疫原及免疫方案 以HNE2细胞株及HNE2细胞中提取的粗抗原为免疫原[3]。采用体内和体外联合免疫方法，即按常规给Balb/C小鼠腹腔注射107 HNE2细胞，共3次，每次间隔两周，第3次注射2周后拉颈处死小鼠，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液，并用20 ml含20%小牛血清的DMEM混悬细胞，加入rHu IL-2，rHu IL-6，PWM和无菌HNE2粗抗原，使其终浓度分别为200 u/ml，500 u/ml，1:200和10 μg/ml，置5% CO2 孵育箱中37 ℃培养5 d后，收获细胞，苔盼蓝着色计数。
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1.2 细胞融合[4] 将上述免疫脾细胞与SP2/0细胞按2:1比例混合，在50%聚乙二醇(PEG，MW1500，BDH Chemical Co.)作用下融合。融合的杂交细胞配成30 ml的DMEM 细胞悬液，平均分配于三块96孔板，于次日半量换含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的HAT选择培基。以后每2～3 d给培养孔半量换液，二周后用HT培基。取杂交瘤生长的上清液用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选。阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100%时，扩大培养，液氮保存。
1.3 鼻咽癌单克隆抗体的特异性鉴定
1.3.1 ELISA法 采用8株细胞，其中3株鼻咽癌细胞(HNE2，HNE3，CNE2)，2株大肠癌细胞(HRT-18，LS174T)；肺癌细胞(A549)，宫颈癌细胞(Hela)，正常成纤维细胞(HEL)各1株。上述细胞接种于96孔培养板，每孔约5×104个细胞。当细胞贴壁形成单层细胞后用0.15%戊二醛溶液固定10 min，PBS洗三次，用1%牛血清白蛋白封闭后，加杂交瘤上清，37 ℃孵育2 h或4℃过夜，然后加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的IgG+IgA+IgM(Zymed Lab. Inc. USA)，37 ℃作用2 h，再加0.03% H2O2的ABTS 底物溶液显色20 min，EL309型酶标仪(Bio-Tek Instruments，Inc.)测OD405。
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1.3.2 免疫组化 石蜡组织切片经二甲苯脱蜡，依次经100%，95%，75%乙醇水化后，用0.5%H2O2甲醇溶液阻断内源性过氧化酶活性，加20%正常兔血清作用20 min，再加杂交瘤培养上清37 ℃ 2 h或4 ℃过夜。PBS洗后，加辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG+IgA+IgM，37 ℃作用30 min。PBS洗三次，加底物DAB显色5 min，蒸馏水终止染色。切片经苏木素复染、盐酸分色、碳酸锂蓝化后，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片、镜检。以PBS作为阴性对照。
1.3.3 抗体类型鉴定 将杂交瘤培养上清5倍浓缩后，用双向免疫扩散方法鉴定抗体类型。
2 结果
2.1 鼻咽癌杂交瘤细胞株的建立 经过腹腔基础免疫后，抗HNE2的抗血清效价为1:1 000，取其脾细胞加细胞因子、丝裂原和特异性抗原在体外进行免疫诱导，虽然细胞总数无明显增多，但淋巴母细胞的比例显著增多。与SP2/0细胞融合，有88.5%的细胞培养孔产生了杂交瘤，每孔上清应用细胞抗原HNE2进行间接ELISA筛选，获得10 株稳定分泌抗靶细胞抗体的杂交瘤，命名为HNL1～HNL10。对这10株细胞进行二次有限稀释，克隆化。
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2.2 细胞株选择性检测 10株杂交瘤细胞系的单克隆抗体对7株癌细胞和正常成纤维细胞的ELISA检测，其结果见表1。ELISA结果显示:HNL1、HNL5 除对一株大肠癌细胞呈阳性反应外，对其他肿瘤细胞和正常细胞均为阴性，而对三株鼻咽癌细胞呈强阳性或阳性反应，说明HNL1和HNL5具有较好的选择性。
表1 10株鼻咽癌单抗的酶联免疫反应* 细胞株
HNL1
HNL2
HNL3
HNL4
HNL5
HNL6
HNL7
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HNL8
HNL9
HNL10
HNE2
+++
+++
+++
++
+++
++
+++
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++
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++
HNE3
+++
++
++
++
++
+
++
++
+++
+++
CNE2
, http://www.100md.com ++
++
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Hela
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A549
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++
+
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HT29
-
+
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++
LS174T
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HEL
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+++
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-
*+++：强阳性(OD405>1.0)；++：阳性(0.5
2.3 抗体类型鉴定 琼脂双向免疫扩散试验结果显示HNL1和HNL5均为IgG。
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2.4 免疫组化 10株杂交瘤细胞株中，HNL1和HNL5分泌的单克隆抗体表现出较好的选择性，因此，对这两株抗体的特异性作了进一步鉴定，用鼻咽癌细胞株HNE2作间接免疫组化检测发现，两抗体的作用部位为癌细胞膜(见封三附图)。用间接免疫组化检测两抗体对鼻咽癌组织反应的阳性率，HNL1为60.0%，HNL5为65.0%(表2)。两抗体对其他组织的反应结果(表3)：HNL5对11例非鼻咽癌组织和3例鼻息肉均显示阴性结果；而HNL1除在4例肺癌组织，有2例可疑阳性，1例阳性外，对其他非鼻咽肿瘤及鼻息肉为阴性。两抗体对胚胎组织的反应结果亦显示：HNL5对胚胎心、肺、肾、肠、皮肤均为阴性反应。HNL1对胚胎肺为可疑阳性反应，3例胚胎肾有2例可疑阳性，1例阳性，余为阴性。
附图 单克隆抗体HNL1(A)和HNL5(B)对鼻咽癌细胞珠(HNE2)的免疫组化染色(×400)
, 百拇医药
表2 HNL1和HNL5对鼻咽癌组织的免疫组化结果* 抗体
总例数
阳性数(%)
-
+
++
HNL1
20
12(60.0)
8
7
5
, 百拇医药 HNL5
20
13(65.0)
7
10
3
*-：阴性；+：少于10%癌细胞弱染色；+++10%以上癌细胞染色表3 两抗体对非鼻咽癌和胚胎组织的免疫组化结果* 病理诊断
HNL1
HNL5
T
-
±
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+
T
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±
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肺癌
4
1
2
1
4
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乳癌
3
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口腔鳞癌
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结直肠癌
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皮肤转移癌
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纤维瘤
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1
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鼻息肉
3
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胚胎组织
心
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4
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肠
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皮肤
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肾
3
0
2
1
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3
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0
0
*T：样本数；-：阴性；±：可疑阳性；+：阳性
3 讨论
在抗肿瘤杂交瘤的研制中，免疫方式选择对于获得高质量的单克隆抗体是重要的因素之一。不同的实验室常采用不同的方法。一般多采用体内免疫方式，也有用体外免疫方法[5，6]。本实验采用体内和体外联合免疫诱导方式，结果显示：体内免疫后经体外免疫诱导虽不能使细胞数明显增多，但淋巴母细胞的比例却显著增多，而且与SP2/0细胞融合后，有88.5%的细胞培养孔产生了杂交瘤。而用体内免疫方式获得的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，仅35.5%的细胞培养孔产生杂交瘤[2]。融合率增高，有利于提高筛选的阳性率。其机理可能为：IL-2有促进B细胞增殖和分化的作用；IL-6能诱导已活化的B细胞分化为抗体分泌细胞，而PWM作为丝裂原可促进B细胞的活化和增殖。
, 百拇医药
鼻咽癌细胞株HNE2，HNE3和CNE2虽为三株不同的细胞，但10株抗体的ELISA反应是相似的，有明显的交叉反应；而且10株杂交瘤对肺癌和肠癌有明显的反应，部分抗体对宫颈癌和正常成纤维细胞亦有反应，说明这些抗体作用的是肿瘤相关抗原。免疫组化结果表明，HNL1和HNL5两抗体对其他良恶性细胞除个别有阳性反应外，基本表现为阴性反应，提示HNL1和HNL5的针对抗原在这些组织分布甚微或不存在，也表明这两种抗体对鼻咽癌有较好的选择性。
参考文献
1 崔运昌，汪美先，王伯潭，等.人鼻咽癌上皮样细胞系的单克隆抗体(简报).第四军医大学学报，1984，5:209～211
2 孙去病，郭敏，李小玲，等.鼻咽癌的单克隆抗体研究：杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定.湖南医学院学报，1987，12(1):1～3
3 李官成，孙去病.肿瘤相关抗原CA-Hb3对大肠癌血清学诊断的价值. 中国肿瘤临床，1996，23(3)：173～177
, 百拇医药
4 Sun Qubing,Ho JJL,.Human colonic cancer associated antigens detected by three monoclonal antibodies.Chinese Medicine，1986，99(1):63～74
5 Reading CL.Theory and methods for immunization in culture and monoclonal antibody production.J Immunol Methods，1982，53(3):261～291
6 Holley MC.A simple in vitro method for raising monoclonal antibodies to cochlear proteins.Tissue and Cell，1992，24:613
(19990603 收稿), 百拇医药