通痹灵对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响
作者：陈纪藩 沈晓燕 赵会芳 李迎敏 李颂华 廖世煌 黄仰模 奥西秀树 邱联群 关 彤 方永奇 刘晓玲
单位：陈纪藩 沈晓燕 赵会芳 李迎敏 李颂华 廖世煌 黄仰模 奥西秀树△；邱联群 关 彤 方永奇 刘晓玲(广州中医药大学第一附属医院 广州510405)
关键词：佐剂性关节炎；TNF-α；mRNA；RT-PCR；通痹灵
中国中医基础医学杂志990508 Effects of Tongbiling on TNF-αmRNA Expression in Synoviocytes
from Adjuvant Arthritis Rat
Chen Jifan, Sheng Xiaoyian, Zhao Huifang, Li Yingming, Li Shonghua, Liao Sihuang,Huan Yianmuo, Hideki OKUNISHI, Qu Lianqun, Guan tong, Fang Yongqi, Lu Xiaoling
, 百拇医药
(The First Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University, Guangzhou 510405)
Abstract:The expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes from adjuvant arthritis rats (AA) were measured by semiquantitative RT-PCR.The results showed that the production of TNF-α mRNA by synoviocytes from AA rats were greatly enhanced as compared with that of normal controls (P<0.01).After treatment with Tongbiling (TBL),the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes were significantly decreased (P<0.01).The effects could be observed in methotrexate-treated grop (P<0.05),but less than in TBL-treated grop.Whereas indomethacin further enhanced the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes (P<0.05).Our data suggest that abnormal expression of TNF-α mRNA in synoviocytes plays an important role in the pathogenesis of AA rats.The mechanisms of the therapeutic effect of TBL on AA might be due to inhibit the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes,and then to decrease the production of TNF-α.
, 百拇医药
Key words:Adjuvant Arthritis TNF-α mRNA RT-PCR TongBiLing
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种免疫介导的炎症性疾病，多种细胞因子如：IL-1、IL-6及TNF单独或联合介导RA炎症组织损伤。其中TNF在RA炎症、软骨吸收和骨破坏中起重要作用，是RA发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子[1]。目前从细胞因子角度在分子和细胞水平上研究RA的发病机理和抗风湿药的作用机理，已引起国内外的广泛重视。我们以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成的复方制剂通痹灵(TBL)，在长期的临床观察中取得了良好的疗效，文献报道了TBL具有抗炎和免疫调节作用，近期的实验也证明TBL能明显抑制AA大鼠滑膜细胞分泌IL-1、TNF-α和PGE2[2～4]。本文采用半定量逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)进一步研究TBL治疗RA的分子免疫学机理。
, 百拇医药
材料与方法
1 材料
1.1 药品与试剂
TBL由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄、白术、防风、川乌、水牛角、乳香、没药、马钱子、蜈蚣、玉竹等15味药组成，由本院第一附属医院制剂室生产，每片相当于生药10g；消炎痛(IM)上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(MTX)广州石歧制药厂产品。完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品。脂多糖(LPS)、Ⅱ型胶原酶Sigma公司产品；胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装； DMEM培养粉Gibco公司产品；DNA分子量标准为华美公司产品；细胞总RNA分离试剂盒，Promega公司产品； RT—PCR试剂盒为达安基因公司产品。TNF-α引物：正义链TGAGCACTGAAAGCATGATC，反义链TTATCTCTCAGCTCCACGCC，扩增产物为363bp；β-actin引物：正义链TTCCAGCCTTCCTT-CCTGG，反义链TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT，扩增产物为225bp，由达安基因公司合成。
, 百拇医药
2 方法
2.1 AA大鼠模型复制和分组用药
清洁级SD大鼠(中山医科大学实验动物中心提供)50只，♂，随机分为通痹灵组、消炎痛组、甲氨喋呤组、模型组、正常组，每组10只，分别于各鼠左后肢足跖皮内注射0.1ml完全佛氏佐剂致炎(正常组免注射)。于致炎后第24d分组灌药，通痹灵组和消炎痛组分别以5g/(kg.d)及2mg/(kg.d)灌胃，甲氨喋呤组以1.5mg/(kg.w)灌胃给药，对照组按10ml/kg/d灌以生理盐水。
2.2 大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mRNA的诱生和总RNA的抽提
于实验第8周断头处死大鼠，参照文献[5]获取滑膜细胞，用含有5mg/LLPS的DMEM培养液将滑膜细胞数调整至1×106mL-1，加入24孔培养板内，每孔1ml，于37℃、5%CO2培养箱培养4h。细胞总RNA抽提按试剂盒说明进行，产量和纯度用紫外分光光度计测定。
, 百拇医药
2.3 半定量RT-PCR
参照试剂盒说明进行。逆转录：10mmol/LdNTP2ul、Rnase抑制剂20U、逆转录酶50U、50umol/L随机引物1ul，25mmol/LMgCl2 4ul、10×PCR Buffer 2ul、总RNA2ul、总体积20ul，置37℃水浴箱反应40min。PCR：Amli-Taq多聚酶2.5U、15umol/L TNF-α正义链和反义链引物各1ul，15umol/L β-actin正义链和反义链引物各1ul蒸馏水63.5ul，与逆转录反管混合，终体积为100ul。扩增条件为：预变性94℃5min，变性94℃50s，退火58℃50s，延伸72℃50s，后延伸72℃5min，30个循环。取10ulPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙淀染色，在紫外检测仪上观察结果并照像，用图像分析仪(英国UVP产品)对底片条带进行扫描，计算TNF-α产物与β-actin产物的比值，以此比值来反映细胞因子mRNA量的变化。
, 百拇医药
2.4 统计学处理
组间均数比较采用双侧t检验。
结果
1 AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平
附表结果表明，AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平均较正常大鼠明显增高(P<0.001)。
2 TBL对大鼠滑膜细胞 TNF-αmRNA表达的影响
附表结果表明，TBL能显著抑制AA大鼠滑膜细胞异常升高的TNF-αmRNA的表达，使其趋于正常(P<0.001)；甲氨喋呤对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA的表达也有一定的下调作用(P<0.05)；但消炎痛却进一步上调了AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达(P<0.05)。
, 百拇医药
附表 通痹灵对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响 组别
例数
TNF-αmRNA
正常组
10
0.94±0.16
AIA组
9
1.86±0.42***
TBL组
9
1.13±0.33△△△
, 百拇医药
MTX组
10
1.34±0.35*△
IM组
8
2.17±0.44***△
注：与正常组比较：*P<0.05,***P<0.001;与AA组比较：△P<0.05,△△△P<0.001。
图2 TBL对AA大鼠滑膜细胞TNFαmRNA表达的抑制作用
(条带A为AA组，B为IM组，C为MTX组，D为TBL组，E为正常组)
, 百拇医药
讨论
RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病。细胞因子网络失调与RA发病及病程进展关系密切。RA发病时，滑膜细胞胞核染色体的细胞因子基因转录相应的mRNA迅速增加，进而合成多种细胞因子，释放入滑膜液和血液中。其中TNF-α在RA炎症、软骨吸收和骨破坏中起重要作用，TNF-α是破骨细胞活化因子，它诱导软骨细胞产生过氧化反应，参与软骨吸收，加速氨基糖的降解，引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维细胞的增生；刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶，引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解。有实验表明，体外培养的RA滑膜细胞加入抗TNF-α抗体，可以完全抑制IL—1和GM—CSF的产生。MHC Ⅱ类分子的表达也显著降低，说明TNF-α在RA关节的细胞因子网络中起中心作用[6～7]。因此有效抑制RA滑膜细胞TNF-αmRNA的异常表达，降低TNF-α的产生，是RA治疗的可取途径。
中医理论认为，RA的发生是由于气血虚弱，肝肾不足，复感风寒湿邪。寒热错杂，阴阳失衡，虚实相兼是其主要病理特点。辨证论治以平衡阴阳、扶正祛邪为原则。以此理论为指导，我们以经方桂枝芍药知母汤为基础研制成通痹灵片，具有清热除湿、滋阴通阳、活血通络、化瘀止痛的功效。以往的研究表明，TBL对RA具有良好的临床治疗效果，无毒副作用，抗炎镇痛作用好，能降低模型动物抗胶原抗体效价，抑制关节骨质破坏，调节淋巴细胞功能等功效[2～4]。本研究采用与人类RA有着相似病理改变的AA大鼠模型，运用半定量RT—PCR方法，进一步研究了TBL对滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响，力图从细胞因子角度为TBL抗RA作用提供部分分子药理学基础。结果表明，AA大鼠滑膜细胞表达TNF-αmRNA明显增强，TBL能明显抑制AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达，使其趋于正常；MTX也在一定程度上降低了AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达，但作用没有TBL明显；而IM则进一步提高了异常升高的AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达。这不仅提示了TBL治疗RA作用机理之一可能是通过抑制滑膜细胞异常表达的TNF-αmRNA，从而下调TNF-α的产生而实现的，还提示了非甾体抗炎药长期使用的危害性。同时在实验中观察到，TBL组大鼠的平均体重、进食量、外观毛色及活动状况均优于MTX组和IM组。
, 百拇医药
本实验建立了对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平的半定量测定的有效方法，确定了最佳循环数和选择能与靶序列平行扩增的内参照，减少了扩增体系的系统误差。本项研究及我们以往的资料说明，中药复方制剂TBL可以改善症状而且可以改变RA病情，为一很有前途的治疗RA新药，其进一步的作用机理尚待研究。
* 广东省自然科学基金资助课题。课题顺序号：960550
Δ 日本岛根医科大学
作者简介：陈纪藩，男，57岁，教授.学科带头人、博士研究生导师。现任广东省中西结合学会风湿类疾病专业委员会主任委员，中南六省风湿病防治协作组副组长，现任广州中医药大学第一附属医院院长。主要从事经方治疗风湿病的临床和实验研究。
参考文献
[1] 王斌，陈敏珠，徐叔云.类风湿关节炎滑膜细胞功能的研究进展.中国药理学通报 1993；9(2)：99～101
, http://www.100md.com
[2] 陈纪藩，赵会芳，廖世煌，等.通痹灵治疗类风湿性关节炎137例临床研究.新中医 1997；(9)：13～14
[3] 李颂华，山内康平，小林裕太，等.通痹灵のⅡ型コテ一グン诱癸关节炎记すゐ作用.炎症 1993；13(6)：575～579
[4] Li S-H,Kobayashi Y,Yamauchi Y,Gondda T and T sunematsu T. Suppressive effects of a herbal for mula TBL-1 on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice. Clin Exp Pharmacol Physiol 1996; 20:236～240
[5] 王斌，陈敏珠.滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖反应的影响.安徽医科大学学报 1997； 32(5)：534～536
[6] 赵阴环，张凤山.类风湿性关节炎分子免疫发病机理.国外医学.免疫学分册 1992；(2)：73～75
[7] 蒋明，等主编.风湿病学.第1版.北京：科学出版社，1995：830
(收稿日期 1998—09—14 修回日期 1999—01—24), http://www.100md.com
单位：陈纪藩 沈晓燕 赵会芳 李迎敏 李颂华 廖世煌 黄仰模 奥西秀树△；邱联群 关 彤 方永奇 刘晓玲(广州中医药大学第一附属医院 广州510405)
关键词：佐剂性关节炎；TNF-α；mRNA；RT-PCR；通痹灵
中国中医基础医学杂志990508 Effects of Tongbiling on TNF-αmRNA Expression in Synoviocytes
from Adjuvant Arthritis Rat
Chen Jifan, Sheng Xiaoyian, Zhao Huifang, Li Yingming, Li Shonghua, Liao Sihuang,Huan Yianmuo, Hideki OKUNISHI, Qu Lianqun, Guan tong, Fang Yongqi, Lu Xiaoling
, 百拇医药
(The First Affiliated Hospital of Guangzhou TCM University, Guangzhou 510405)
Abstract:The expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes from adjuvant arthritis rats (AA) were measured by semiquantitative RT-PCR.The results showed that the production of TNF-α mRNA by synoviocytes from AA rats were greatly enhanced as compared with that of normal controls (P<0.01).After treatment with Tongbiling (TBL),the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes were significantly decreased (P<0.01).The effects could be observed in methotrexate-treated grop (P<0.05),but less than in TBL-treated grop.Whereas indomethacin further enhanced the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes (P<0.05).Our data suggest that abnormal expression of TNF-α mRNA in synoviocytes plays an important role in the pathogenesis of AA rats.The mechanisms of the therapeutic effect of TBL on AA might be due to inhibit the expression levels of TNF-α mRNA in synoviocytes,and then to decrease the production of TNF-α.
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Key words:Adjuvant Arthritis TNF-α mRNA RT-PCR TongBiLing
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种免疫介导的炎症性疾病，多种细胞因子如：IL-1、IL-6及TNF单独或联合介导RA炎症组织损伤。其中TNF在RA炎症、软骨吸收和骨破坏中起重要作用，是RA发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子[1]。目前从细胞因子角度在分子和细胞水平上研究RA的发病机理和抗风湿药的作用机理，已引起国内外的广泛重视。我们以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成的复方制剂通痹灵(TBL)，在长期的临床观察中取得了良好的疗效，文献报道了TBL具有抗炎和免疫调节作用，近期的实验也证明TBL能明显抑制AA大鼠滑膜细胞分泌IL-1、TNF-α和PGE2[2～4]。本文采用半定量逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)进一步研究TBL治疗RA的分子免疫学机理。
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材料与方法
1 材料
1.1 药品与试剂
TBL由桂枝、芍药、知母、生姜、甘草、麻黄、白术、防风、川乌、水牛角、乳香、没药、马钱子、蜈蚣、玉竹等15味药组成，由本院第一附属医院制剂室生产，每片相当于生药10g；消炎痛(IM)上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(MTX)广州石歧制药厂产品。完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品。脂多糖(LPS)、Ⅱ型胶原酶Sigma公司产品；胰蛋白酶(1∶250)，Difco产品进口分装； DMEM培养粉Gibco公司产品；DNA分子量标准为华美公司产品；细胞总RNA分离试剂盒，Promega公司产品； RT—PCR试剂盒为达安基因公司产品。TNF-α引物：正义链TGAGCACTGAAAGCATGATC，反义链TTATCTCTCAGCTCCACGCC，扩增产物为363bp；β-actin引物：正义链TTCCAGCCTTCCTT-CCTGG，反义链TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT，扩增产物为225bp，由达安基因公司合成。
, 百拇医药
2 方法
2.1 AA大鼠模型复制和分组用药
清洁级SD大鼠(中山医科大学实验动物中心提供)50只，♂，随机分为通痹灵组、消炎痛组、甲氨喋呤组、模型组、正常组，每组10只，分别于各鼠左后肢足跖皮内注射0.1ml完全佛氏佐剂致炎(正常组免注射)。于致炎后第24d分组灌药，通痹灵组和消炎痛组分别以5g/(kg.d)及2mg/(kg.d)灌胃，甲氨喋呤组以1.5mg/(kg.w)灌胃给药，对照组按10ml/kg/d灌以生理盐水。
2.2 大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mRNA的诱生和总RNA的抽提
于实验第8周断头处死大鼠，参照文献[5]获取滑膜细胞，用含有5mg/LLPS的DMEM培养液将滑膜细胞数调整至1×106mL-1，加入24孔培养板内，每孔1ml，于37℃、5%CO2培养箱培养4h。细胞总RNA抽提按试剂盒说明进行，产量和纯度用紫外分光光度计测定。
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2.3 半定量RT-PCR
参照试剂盒说明进行。逆转录：10mmol/LdNTP2ul、Rnase抑制剂20U、逆转录酶50U、50umol/L随机引物1ul，25mmol/LMgCl2 4ul、10×PCR Buffer 2ul、总RNA2ul、总体积20ul，置37℃水浴箱反应40min。PCR：Amli-Taq多聚酶2.5U、15umol/L TNF-α正义链和反义链引物各1ul，15umol/L β-actin正义链和反义链引物各1ul蒸馏水63.5ul，与逆转录反管混合，终体积为100ul。扩增条件为：预变性94℃5min，变性94℃50s，退火58℃50s，延伸72℃50s，后延伸72℃5min，30个循环。取10ulPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙淀染色，在紫外检测仪上观察结果并照像，用图像分析仪(英国UVP产品)对底片条带进行扫描，计算TNF-α产物与β-actin产物的比值，以此比值来反映细胞因子mRNA量的变化。
, 百拇医药
2.4 统计学处理
组间均数比较采用双侧t检验。
结果
1 AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平
附表结果表明，AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平均较正常大鼠明显增高(P<0.001)。
2 TBL对大鼠滑膜细胞 TNF-αmRNA表达的影响
附表结果表明，TBL能显著抑制AA大鼠滑膜细胞异常升高的TNF-αmRNA的表达，使其趋于正常(P<0.001)；甲氨喋呤对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA的表达也有一定的下调作用(P<0.05)；但消炎痛却进一步上调了AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达(P<0.05)。
, 百拇医药
附表 通痹灵对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响 组别
例数
TNF-αmRNA
正常组
10
0.94±0.16
AIA组
9
1.86±0.42***
TBL组
9
1.13±0.33△△△
, 百拇医药
MTX组
10
1.34±0.35*△
IM组
8
2.17±0.44***△
注：与正常组比较：*P<0.05,***P<0.001;与AA组比较：△P<0.05,△△△P<0.001。
图2 TBL对AA大鼠滑膜细胞TNFαmRNA表达的抑制作用
(条带A为AA组，B为IM组，C为MTX组，D为TBL组，E为正常组)
, 百拇医药
讨论
RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病。细胞因子网络失调与RA发病及病程进展关系密切。RA发病时，滑膜细胞胞核染色体的细胞因子基因转录相应的mRNA迅速增加，进而合成多种细胞因子，释放入滑膜液和血液中。其中TNF-α在RA炎症、软骨吸收和骨破坏中起重要作用，TNF-α是破骨细胞活化因子，它诱导软骨细胞产生过氧化反应，参与软骨吸收，加速氨基糖的降解，引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维细胞的增生；刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶，引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解。有实验表明，体外培养的RA滑膜细胞加入抗TNF-α抗体，可以完全抑制IL—1和GM—CSF的产生。MHC Ⅱ类分子的表达也显著降低，说明TNF-α在RA关节的细胞因子网络中起中心作用[6～7]。因此有效抑制RA滑膜细胞TNF-αmRNA的异常表达，降低TNF-α的产生，是RA治疗的可取途径。
中医理论认为，RA的发生是由于气血虚弱，肝肾不足，复感风寒湿邪。寒热错杂，阴阳失衡，虚实相兼是其主要病理特点。辨证论治以平衡阴阳、扶正祛邪为原则。以此理论为指导，我们以经方桂枝芍药知母汤为基础研制成通痹灵片，具有清热除湿、滋阴通阳、活血通络、化瘀止痛的功效。以往的研究表明，TBL对RA具有良好的临床治疗效果，无毒副作用，抗炎镇痛作用好，能降低模型动物抗胶原抗体效价，抑制关节骨质破坏，调节淋巴细胞功能等功效[2～4]。本研究采用与人类RA有着相似病理改变的AA大鼠模型，运用半定量RT—PCR方法，进一步研究了TBL对滑膜细胞TNF-αmRNA表达的影响，力图从细胞因子角度为TBL抗RA作用提供部分分子药理学基础。结果表明，AA大鼠滑膜细胞表达TNF-αmRNA明显增强，TBL能明显抑制AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达，使其趋于正常；MTX也在一定程度上降低了AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达，但作用没有TBL明显；而IM则进一步提高了异常升高的AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达。这不仅提示了TBL治疗RA作用机理之一可能是通过抑制滑膜细胞异常表达的TNF-αmRNA，从而下调TNF-α的产生而实现的，还提示了非甾体抗炎药长期使用的危害性。同时在实验中观察到，TBL组大鼠的平均体重、进食量、外观毛色及活动状况均优于MTX组和IM组。
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本实验建立了对AA大鼠滑膜细胞TNF-αmRNA表达水平的半定量测定的有效方法，确定了最佳循环数和选择能与靶序列平行扩增的内参照，减少了扩增体系的系统误差。本项研究及我们以往的资料说明，中药复方制剂TBL可以改善症状而且可以改变RA病情，为一很有前途的治疗RA新药，其进一步的作用机理尚待研究。
* 广东省自然科学基金资助课题。课题顺序号：960550
Δ 日本岛根医科大学
作者简介：陈纪藩，男，57岁，教授.学科带头人、博士研究生导师。现任广东省中西结合学会风湿类疾病专业委员会主任委员，中南六省风湿病防治协作组副组长，现任广州中医药大学第一附属医院院长。主要从事经方治疗风湿病的临床和实验研究。
参考文献
[1] 王斌，陈敏珠，徐叔云.类风湿关节炎滑膜细胞功能的研究进展.中国药理学通报 1993；9(2)：99～101
, http://www.100md.com
[2] 陈纪藩，赵会芳，廖世煌，等.通痹灵治疗类风湿性关节炎137例临床研究.新中医 1997；(9)：13～14
[3] 李颂华，山内康平，小林裕太，等.通痹灵のⅡ型コテ一グン诱癸关节炎记すゐ作用.炎症 1993；13(6)：575～579
[4] Li S-H,Kobayashi Y,Yamauchi Y,Gondda T and T sunematsu T. Suppressive effects of a herbal for mula TBL-1 on type Ⅱ collagen-induced arthritis in DBA/1J mice. Clin Exp Pharmacol Physiol 1996; 20:236～240
[5] 王斌，陈敏珠.滑膜细胞培养上清液对成纤维细胞增殖反应的影响.安徽医科大学学报 1997； 32(5)：534～536
[6] 赵阴环，张凤山.类风湿性关节炎分子免疫发病机理.国外医学.免疫学分册 1992；(2)：73～75
[7] 蒋明，等主编.风湿病学.第1版.北京：科学出版社，1995：830
(收稿日期 1998—09—14 修回日期 1999—01—24), http://www.100md.com