c-Fos表达的检测在前庭功能研究中的应用
作者：刘志强 裴静琛 阚广捍
单位：航天医学工程研究所，北京 100094
关键词：c-Fos；前庭神经；运动病
航天医学与医学工程990516摘要：在机体细胞中多种因素可诱导即刻早期基因迅速的一过性表达，这种表达是机体对环境变化发生反应的一个重要过程。本文介绍了即刻早期基因c-Fos表达在前庭功能研究中的应用，讨论了前庭中枢神经系统在应答刺激过程中c-Fos的表达特征，认为c-Fos表达在前庭中枢神经系统间功能联系和定位的研究和空间运动病机理的研究中有一定的应用价值。
中图分类号：R852.33 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)05-0381-05
The Use of c-Fos Expression in Vestibular Function Investigation
, http://www.100md.com
LIU Zhi-qiang，PEI Jing-chen，KAN Guang-han
Abstract： Certain forms of cellular activation lead to immediate early gene(IEGPs)transcription. The biochemical cascade involving IEGPs has been demonstrated to be an important part that cells response to evironmental events. The article reviewed the feature of c-Fos expression in vestibular complexes under stimuli.It was considered that c-Fos expression might be a cue parameter in studying the connection of all vestibular complexes, and to reveal the mechanism of motion sickness.
, 百拇医药
Key words：c-Fos；vestibular nerve;motion sickness
Address reprint requests to：LIU Zhi-qiang. Institute of Space Medico-Engineering, Beijing 100094, China
关于即刻早期基因
即刻早期基因(IEG)及其表达的研究是80年代末迅速发展起来的一种新的研究方法，被广泛地应用到机体对环境变化反应的各个领域，尤其在神经生理学领域。IEG是指该基因能对外界刺激引起神经递质、激素、神经冲动等的传入信息在数分钟内作出反应，进行表达。
在神经系统的反射弧中，初级神经元的兴奋引起神经递质(或激素)的分泌，作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，激活胞内的第二信使(包括cAMP、cGMP、DG、Ca2+等)，第二信使作用于相关的蛋白激酶，在引起细胞瞬时反应(如神经元的兴奋或抑制、肌细胞的收缩、腺细胞的分泌等)的同时，也可以激活第三信使，引起基因转录的变化。第三信使是一类核蛋白，能与转录因子或转录调节因子的特异序列结合，发挥转录因子或转录调节因子的作用。
, http://www.100md.com
目前已发现的IEG至少有十几种，根据它们的结构和功能特征大致可分为c-Fos和c-jun家族、c-myc家族、egr家族。其中研究最为深入的主要为c-Fos和c-jun家族，而在前庭神经系统中c-Fos及其产物Fos核蛋白的研究最多。
在机体细胞中多种因素(如物理刺激、化学刺激、电刺激和药物刺激等)可诱导c-Fos迅速的一过性表达，c-Fos的转录激活在5 min之内就可发生，一般维持15～20 min。c-FosmRNA的蓄积在刺激后30～45 min达高峰，半衰期为12 min。Fos核蛋白出现稍晚，但在1 h内就可有明显反应，半衰期为2 h[1]。
c-FosmRNA和Fos核蛋白的的测定
原位杂交法测定c-FosmRNA 原位杂交法是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否能被直接检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两种：直接法主要用放射同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影技术、荧光显微镜技术或成色酶促反应直接显示；间接法一般用半抗原标记探针，最后通过放免组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针和靶核酸形成的杂交体[2]。
, 百拇医药
免疫组化测定Fos核蛋白 组织取材与切片同原位杂交。免疫组化反应有两种：直接法和间接法。直接法是在抗体上结合一定的标记物，如荧光素，一次孵育成功，此法虽然操作方便，但灵敏度低；间接法无需标记特异抗体(第一抗体)而是在第一抗体与组织中抗原结合后，用各种方法来显示第一抗体，间接法的灵敏度大大高于直接法。经过两次甚至多次反应，标记强度得到放大，而且每一种显示系统均可以显示第一抗体。最常用的有间接荧光法、过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase anti-peroxidase complex PAP)及抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin peroxidase complex ABC)法3种。
原位杂交法与免疫组化法的相互补充 原位杂交法和免疫组化法都是显示细胞化学成分的方法，各有其适用范围及优、缺点。两种方法相辅相成。两种方法的一个共同的问题是反应的特异性问题，两种方法的相互印证(如在相邻的两张切片上分别进行两种方法的测定)，可以彼此作为其特异性的有力证据。
, 百拇医药
c-FosmRNA和Fos核蛋白的检测在前庭功能研究中的应用
c-Fos及其表达已经被广泛地作为中枢神经系统的标志物，特别是作为中枢神经系统功能联系和定位的一种手段。虽然它不属于传统上经典的电生理传导范畴，但其检测细胞内第二信使的水平远比简单的电生理学方法精确。c-FosmRNA的产物Fos蛋白的产生，反应了细胞膜上的短期信号变化转变为长期的生化变化的机制，这些机制包括新蛋白的合成、机体对环境变化的应答产生的适应或代偿反应的建立[7]等。正常情况下机体IEG仅有极低水平的表达或无表达，在受刺激的情况下可以迅速短暂地表达。近年来，IEG的表达在前庭功能研究方面的应用十分广泛，利用多种前庭刺激手段如单侧迷路破坏术、旋转刺激、药物等诱发c-Fos的表达，围绕前庭神经系统的几个传导通路来探讨前庭各器官之间的相互联系及功能定位。
目前单侧迷路破坏术后前庭代偿机制形成过程的研究较多，选择代偿机制的原因是因为其包括了几乎所有的前庭器官和通路。
, http://www.100md.com
神经电生理学研究表明，单侧迷路破坏形成的姿态和运动障碍是由于破坏侧迷路器官处于暂时性休眠状态而造成的双侧前庭神经冲动发放不平衡所导致的。损伤侧的前庭神经的自发性活动减少，而健侧增多。在代偿形成过程中，病、健双侧的前庭器官均参与前庭神经的再平衡过程。这一过程的形成可能包括神经传导环路中神经元突触转换前部分和转换后部分(即周围神经部分和中枢神经部分)，突触转换前部分可能是通过损伤侧感受器替代物、或感受器的增生、或其它传入通路的影响(包括健侧传入通路的加强)来替代损伤侧迷路感觉传入。突触转换后部分可能是通过前庭中枢神经系统的内在特性的自我调整来完成的，包括神经数量的增多和受体亲和力的提高[3]。但是，到目前为止，能证明这一假设的证据很少。IEG的研究，如c-Fos和c-jun表达，可以帮助我们揭开单侧迷路损伤形成的机体感觉和运动障碍和代偿形成的分子生物学机制；而且能为我们提供一个包括所有中枢神经系统全程的、动态的变化过程。c-Fos表达的增加表明了神经冲动发放频率的增加或神经可塑性的改变[4]。在前庭失代偿和代偿阶段，涉及的神经器官不仅有前庭核、下橄榄核、网状结构，而且还有小脑和大脑皮层等[5]。而迷路损伤模型的c-FosmRNA和Fos核蛋白的测定结果正好证实了这一论点，即代偿现象的发生是整个大脑协调作用的结果。以下主要介绍单侧迷路破坏术后c-Fos表达的特征。
, 百拇医药
前庭核的c-FosmRNA和Fos核蛋白变化 大鼠在单侧迷路破坏3 h后，前庭上核(SuVe)、前庭内侧核(MVe)、前庭下核(SpVe)、Y细胞群等处c-FosmRNA和Fos核蛋白呈双侧性升高，但这种升高是不对称的。在MVe背侧部分健侧比损伤侧升高更明显，而在其腹侧部分损伤侧比健侧升高更明显。这些实验结果说明背侧MVe不仅控制同侧迷路的兴奋，同时也对对侧迷路进行抑制性控制，而这种抑制性控制可以通过直接通路(也就是联系神经元系统)和间接通路(即通过小脑皮层)两种途径，这种控制的实施是通过腹侧MVE和抑制性GABA等中间神经元来抑制对侧前庭二级神经元的[6]。这样，损伤后3 h健侧MVe因迷路冲动传入而兴奋，而损伤侧MVe丧失了对健侧迷路冲动传入的抑制，造成前庭神经双侧冲动传入的不平衡(健侧升高，损伤侧降低)，导致了身体和头部倾斜，眼球转向损伤侧等症状。MVe背侧部分是前庭神经二级神经元所在地，而其腹侧部分是作用于对侧前庭核的联合神经所在地。由于这些结构与前庭眼动及前庭脊髓的投射十分广泛，因此可以推测这些结构与迷路损伤所形成的眼震和姿态平衡障碍有关。而且发现舌下神经核、罗勒氏核以及中介核的c-FosmRNA和Fos核蛋白也呈双侧不对称性升高。这些结构接受双侧MVe和SpVe的传入投射，同时也发出神经纤维到这些前庭核和外展核，提示了前庭核参与眼和头部运动的控制。
, http://www.100md.com
损伤后6 h和12 h，损伤同侧MVe腹侧部分和对侧背侧部分c-FosmRNA和Fos核蛋白消失，但是同侧MVe背侧部分c-FosmRNA和Fos核蛋白明显地升高。这一结果与用药物破坏迷路或用直流电刺激一侧迷路所得结果一致[7]，有证据表明MVe内c-FosmRNA和Fos核蛋白表达的改变并不是由损伤刺激本身所引起的。损伤侧腹侧MVe的c-FosmRNA和Fos核蛋白升高是中间联合神经细胞活动减弱的结果。
在损伤后6 h，位于腹侧MVe中的联络神经元对健侧背侧MVe产生抑制性作用，从而导致了c-FosmRNA和Fos核蛋白分布的改变，如果这一发现是可靠的，将给前庭功能的代偿过程提供一个最早期的证据。损伤后6 h背侧MVe c-Fos表达的增强说明某些额外的迷路传入冲动(可能是损伤侧腹侧MVe中的联络神经元)也可以作用于其同侧背侧MVe，这是损伤侧前庭神经系统内部自我调节的结果，使得因损伤而造成的前庭休眠状态得以纠正。当然，与眼震快相相关的前庭神经核内的有节律的突发式的放电活动也可造成c-Fos表达的增强。舌下神经核的c-Fos改变是由于前庭神经传入冲动的再分配所制。损伤后肢体姿态的改变至少部分地由于前庭外侧核(LVe)发放冲动的不对称性改变所引起[8]。LVe的前庭脊髓神经系统接受迷路的传入，同时发放冲动(兴奋)到同侧肢体，但是，双侧LVe中只发现少量c-FosmRNA的增加，并不伴随Fos核蛋白的改变，其原因有待于进一步研究。另有证据表明鼠在旋转笼中进行平衡运动训练后，LVe(和小脑核一样，接受小脑皮层的直接投射)中c-Fos表达升高。小脑核和LVe均是小脑的输出单元。LVe在前庭脊髓通路中的下传贯穿整个脊髓，大部分c-Fos表达阳性的部位是向脊髓投射的神经细胞所在地。LVe中c-Fos表达的增强是在运动中前庭功能发挥作用的体现。
, 百拇医药
小脑及旧小脑的变化 损伤后3 h，小脑双侧小结、绒球、副绒球的第9、10小叶中c-Fos表达增高，但损伤侧更明显，6～12 h后这种不对称性消失。在这些小脑皮层中，c-Fos表达主要呈纵向分布，中间间以无c-Fos表达的条纹区，c-Fos表达同时也出现在颗粒细胞层和蒲氏纤维细胞层，但并不伴随Fos核蛋白的增加。这与电刺激小脑感觉和运动皮层所获得的结果一致[9]。可能是由于c-FosmRNA已经诱发，但还没来得及合成Fos核蛋白，或Fos核蛋白已经合成，但是没有被抗体检测到(由于抗体浓度低或Fos核蛋白的快速分解)。旧小脑结构、旁正中核和网状结构(可能与脊髓小脑通路有关)变化同上，这可能是由于LVe的突发性放电所致，因为LVe是通过交叉性的脊髓-网状结构-小脑通路和健侧蒲氏细胞来激动损伤侧前庭脊髓通路的。6 h后c-Fos表达的降低说明双侧网状结构和小脑活动的恢复。
损伤后3 h健侧下橄榄核的某些部位如β下核、Kooy核顶背部、背核、中背核群和B、C下核c-FosmRNA和Fos核蛋白增高，6 h后下降，24 h后消失[10]。健侧区域神经的活动性增强，和损伤同侧MVe和SpVe向该侧橄榄核区的直接投射，导致了这些部位c-Fos表达的变化。下橄榄核区不仅接受前庭神经的输入，也接受视输入。这些信息可以到达前庭脊髓小脑系统和脊髓小脑系统。橄榄核c-Fos表达的变化在前庭代偿机制中起十分重要的作用。可能是由于健侧橄榄核活动的增强，通过上行纤维，抑制了损伤侧蒲氏纤维的简单峰电位(而这种峰电位由于单侧损伤造成的双侧网状小脑系统不平衡而发放增加)。对于损伤侧橄榄核情况则相反。除了这种短期变化的峰电位活动外，由上行纤维向损伤侧小脑皮层的输入也可导致长期变化，这种变化是用来降低蒲氏纤维细胞的峰电位活动，同时也用来减轻蒲氏纤维细胞向小脑和前庭输入的抑制性影响，所有这些变化都使得双侧的不平衡状态得以纠正。
, 百拇医药
基底神经节的变化 损伤3 h后，尾状核和豆状核双侧c-FosmRNA和Fos核蛋白增高，但损伤同侧增高更显著。而且c-FosmRNA分布分散。这一发现证明了Musken的假设，即基底神经节是前庭神经系统的前哨站。损伤后3 h在中央灰质的背侧部和黑质中c-Fos表达是对称性升高，有证据表明中央灰质的背侧部分空间位置感觉输入，参与和控制靶系统产生对新环境的适应性动作(包括整合前庭和眼的感觉输入)。
大脑皮层和皮层下结构的变化 损伤后3 h一些新皮层区c-Fos表达基本上是双侧对称性增高，这一方面是由于特殊感觉通路，包括从健侧前庭器官而来的交叉和不交叉上升投射，另一方面是与损伤造成的本体感觉和视前庭的不正常刺激以及损伤造成的疲劳和紧张有关。
c-FosmRNA和Fos核蛋白的检测在运动病机理研究中的应用
随着航天航空航海事业的发展，有关运动病的研究也越来越被人们重视。近年来的研究是主要采用计算机测量、心脑照相术、心动描记术、脑血流图等手段研究前庭刺激诱发运动病的状态下机体的平衡能力、主观症状、胃电节律、心率变异、皮肤导电水平等方面的病理生理反应，也有研究关于中枢神经系统中单胺物质与运动病的关系。目前已经有人开展将运动病大鼠中枢神经系统的行为状态与细胞的分子信号通道联系起来这方面的工作[12]。金淑仪发现，运动病大鼠中枢神经系统中去甲肾上腺素含量下降，5-羟色胺含量上升，提出运动病可能是一种应激反应，与中枢觉醒成正相关。而去甲肾上腺素等神经递质是参与这种调控的活跃物质，同时去甲肾上腺素通过β受体诱发大脑皮层c-Fos表达已证实[13]。在偏心旋转刺激诱发运动病的大鼠中发现[12]：大脑皮质、脑干、和小脑皮质中c-FosmRNA和Fos核蛋白含量均有增加；本文作者也发现旋转刺激下大鼠前庭核c-Fos表达增强。认为运动病发作时神经细胞间递质含量的改变和Ca2+内流等细胞内信使活动的同时引起c-Fos基因快速转录和翻译，形成Fos蛋白，Fos与jun以“亮氨酸拉链”形成异源二聚体AP-1并结合到靶基因的TGACTA位点。Jabbar[12]认为，Fos/jun二聚体结合到DNA特殊位点上是最终激活MAP激酶的一系列蛋白激酶和PKC调控的重要环节。不同的蛋白激酶又受到二聚体组成成分以及与DNA结合状态的影响。这些蛋白激酶引起一系列蛋白活性的改变，使细胞处于应激反应状态，从而诱发运动病。但是c-Fos基因表达与AP-1与细胞内不同蛋白激酶系统之间如何诱发运动病的确切关系尚待进一步研究。
, 百拇医药
通过对c-Fos表达在中枢神经系统解剖结构的定位研究，我们可以断定c-Fos的表达并不是简单反应神经和代谢活动的电生理活动的信号，而是反应神经中枢内部长远的可塑性的特征，它与神经活动的关系非常复杂。特别是c-Fos表达反应的是与神经通路中信息传递有关的早期变化，为神经传递的过程提供了一个基因水平的步骤。引起c-Fos表达改变的一个可能的机理是去甲肾上腺素能神经活动的改变。去甲肾上腺素能神经在许多结构中都有投射，如前庭核、小脑、尾状核、豆状核和大脑皮层等。在这些结构中，由于蓝斑核的活动而释放的去甲肾上腺素不仅可引起短时程的分子水平活动的改变(通过提高传入信号信噪比)，而且也可以诱发c-Fos表达。另一个可能的机理是兴奋性神经元递质通过激活谷氨酸-N-甲基-D门冬氨酸(NMDA)受体或毒菌碱受体，可诱导c-FosmRNA，证据是c-FosmRNA与Fos核蛋白在脑内的分布与NMDA受体的分布一致，而且NMDA受体拮抗剂MK801能消除或削弱c-Fos的表达[14]。c-Fos表达与神经细胞钙通道的开放、细胞内Ca2+超载及cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化增加有关[11]。
, http://www.100md.com
目前需要解决的问题是c-Fos的表达究竟是因为刺激本身引起的损伤性变化产物，还是机体应答环境变化的适应性反应产物,它对机体起什么作用；c-Fos的表达是不是机体对刺激应答必不可少的步骤；对于运动病发作个体，使用抗运动病药物能否引起c-Fos的表达的改变。故下一步工作是确定前庭神经细胞中产生c-Fos的神经化学特性；用局部注射c-Fos反意低聚核苷酸阻滞c-Fos表达，是否干扰前庭代偿机制的建立以及是否影响运动病的发生。
尽管c-Fos仍然有许多问题有待解决，c-Fos表达的增加也仅仅说明在特定条件下，有关神经元的活动发生了变化，这种变化的性质和结果是多种多样的，还不能将各种不同的刺激引起c-Fos表达的特异性以及各种信息的特定意义区分开来。但是，c-Fos的研究对于机体平衡机能维持的机理、前庭稳定性的维持、运动病发病机理及其防治、前庭代偿机制的建立(与前庭功能训练有关)等方面都是有益的。
参考文献
, 百拇医药
[1]韩济生.神经科学纲要[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1993:274～278
[2]姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社.1996:128～137
[3]Darlington CL,Flohr H,Smith PF.Molecular mechanisms of brainstem plasticity.The vestibular compensation model[J].Neurobiol,1991,5(1):355～368
[4]Muskens LJJ.The central connexions of the vestibular nuclei with the corpus striatum,and their significance for oculor movements and for locomotion[J].Brain.1929,45(4):421～451
, 百拇医药
[5]Di Giorgio AM.Effetti di lesioni unilaterali della corteccia cerebrale sui fenomeni di compenso da emislabirintazione[S].Atti Accad Fisioc Fad Med Siena,Ser.XI2,382～384
[6]Furuya N,Yabe T.Neurotransmitters in the vestibular commisural system of cat[M].New York:Acad Sci,1992:594～601
[7]Aronin N,Sagar SM,Sharp FR.Light regulates expression of a FOS-related protein in rat suprachias matic nuclei[C].Proc Natl Acad Sci USA 87,1990:5959～5962
, 百拇医药
[8]Pompeiano O.(1986)Neuronal mechanisms underlying compensation of otolith fuction after vestibular lesion[M].In:Keller EL,Zee DS.eds.Adaptive processes in visual and oculomotor systems.Advances in Bioscience:Oxford,Pergamon Press
[9]Sharp FR,Gonzalez MF,Sharp JW.C-FOS expression and (14C)2-deoxyglucose uptake in the caudal cerebellum of the rat during motor/sensory cortex stimulation[J].J Comp Neurol,1989: 284(11),621～636
[10]Kaufman GD,Anderson J H,Beitz A J.Brainstem Fos expression following acute unilateral labyrinthectomy in the rat[J].Neuro,1992:report 3,829～832
, 百拇医药
[11]Dash PK,Moore AN,Dixon CE.Spatial memory deficits,increased phosphorylation of the transcription factor CREB,and induction of the AP-1 complex following experimental brain injury[J].J Neurosci,1995,15(3pt1):2030
[12]王 琰,董文度,袁驾南等.实验性运动病大鼠脑细胞c-Fos基因表达[J].海军医高专学报,1998,20(1):9～12
[13]Bing G,Stone EA,Zhang Y.Immunohistochemical studies of noradrenergic-induced expression of c-Fos in the rat CNS[J].Brain Res,1992,592:57～62
[14]Kitihara T,Takeda N,Saika T.Effects of MK801 of Fos expression in the rat brainstem after unilateral labyrinthectomy[J],Brain Res.,1995,700(84):182～190
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药
单位：航天医学工程研究所，北京 100094
关键词：c-Fos；前庭神经；运动病
航天医学与医学工程990516摘要：在机体细胞中多种因素可诱导即刻早期基因迅速的一过性表达，这种表达是机体对环境变化发生反应的一个重要过程。本文介绍了即刻早期基因c-Fos表达在前庭功能研究中的应用，讨论了前庭中枢神经系统在应答刺激过程中c-Fos的表达特征，认为c-Fos表达在前庭中枢神经系统间功能联系和定位的研究和空间运动病机理的研究中有一定的应用价值。
中图分类号：R852.33 文献标识码：A 文章编号：1002-0837(1999)05-0381-05
The Use of c-Fos Expression in Vestibular Function Investigation
, http://www.100md.com
LIU Zhi-qiang，PEI Jing-chen，KAN Guang-han
Abstract： Certain forms of cellular activation lead to immediate early gene(IEGPs)transcription. The biochemical cascade involving IEGPs has been demonstrated to be an important part that cells response to evironmental events. The article reviewed the feature of c-Fos expression in vestibular complexes under stimuli.It was considered that c-Fos expression might be a cue parameter in studying the connection of all vestibular complexes, and to reveal the mechanism of motion sickness.
, 百拇医药
Key words：c-Fos；vestibular nerve;motion sickness
Address reprint requests to：LIU Zhi-qiang. Institute of Space Medico-Engineering, Beijing 100094, China
关于即刻早期基因
即刻早期基因(IEG)及其表达的研究是80年代末迅速发展起来的一种新的研究方法，被广泛地应用到机体对环境变化反应的各个领域，尤其在神经生理学领域。IEG是指该基因能对外界刺激引起神经递质、激素、神经冲动等的传入信息在数分钟内作出反应，进行表达。
在神经系统的反射弧中，初级神经元的兴奋引起神经递质(或激素)的分泌，作为第一信使，作用于靶细胞的细胞膜，激活胞内的第二信使(包括cAMP、cGMP、DG、Ca2+等)，第二信使作用于相关的蛋白激酶，在引起细胞瞬时反应(如神经元的兴奋或抑制、肌细胞的收缩、腺细胞的分泌等)的同时，也可以激活第三信使，引起基因转录的变化。第三信使是一类核蛋白，能与转录因子或转录调节因子的特异序列结合，发挥转录因子或转录调节因子的作用。
, http://www.100md.com
目前已发现的IEG至少有十几种，根据它们的结构和功能特征大致可分为c-Fos和c-jun家族、c-myc家族、egr家族。其中研究最为深入的主要为c-Fos和c-jun家族，而在前庭神经系统中c-Fos及其产物Fos核蛋白的研究最多。
在机体细胞中多种因素(如物理刺激、化学刺激、电刺激和药物刺激等)可诱导c-Fos迅速的一过性表达，c-Fos的转录激活在5 min之内就可发生，一般维持15～20 min。c-FosmRNA的蓄积在刺激后30～45 min达高峰，半衰期为12 min。Fos核蛋白出现稍晚，但在1 h内就可有明显反应，半衰期为2 h[1]。
c-FosmRNA和Fos核蛋白的的测定
原位杂交法测定c-FosmRNA 原位杂交法是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否能被直接检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两种：直接法主要用放射同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影技术、荧光显微镜技术或成色酶促反应直接显示；间接法一般用半抗原标记探针，最后通过放免组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针和靶核酸形成的杂交体[2]。
, 百拇医药
免疫组化测定Fos核蛋白 组织取材与切片同原位杂交。免疫组化反应有两种：直接法和间接法。直接法是在抗体上结合一定的标记物，如荧光素，一次孵育成功，此法虽然操作方便，但灵敏度低；间接法无需标记特异抗体(第一抗体)而是在第一抗体与组织中抗原结合后，用各种方法来显示第一抗体，间接法的灵敏度大大高于直接法。经过两次甚至多次反应，标记强度得到放大，而且每一种显示系统均可以显示第一抗体。最常用的有间接荧光法、过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(peroxidase anti-peroxidase complex PAP)及抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物(avidin-biotin peroxidase complex ABC)法3种。
原位杂交法与免疫组化法的相互补充 原位杂交法和免疫组化法都是显示细胞化学成分的方法，各有其适用范围及优、缺点。两种方法相辅相成。两种方法的一个共同的问题是反应的特异性问题，两种方法的相互印证(如在相邻的两张切片上分别进行两种方法的测定)，可以彼此作为其特异性的有力证据。
, 百拇医药
c-FosmRNA和Fos核蛋白的检测在前庭功能研究中的应用
c-Fos及其表达已经被广泛地作为中枢神经系统的标志物，特别是作为中枢神经系统功能联系和定位的一种手段。虽然它不属于传统上经典的电生理传导范畴，但其检测细胞内第二信使的水平远比简单的电生理学方法精确。c-FosmRNA的产物Fos蛋白的产生，反应了细胞膜上的短期信号变化转变为长期的生化变化的机制，这些机制包括新蛋白的合成、机体对环境变化的应答产生的适应或代偿反应的建立[7]等。正常情况下机体IEG仅有极低水平的表达或无表达，在受刺激的情况下可以迅速短暂地表达。近年来，IEG的表达在前庭功能研究方面的应用十分广泛，利用多种前庭刺激手段如单侧迷路破坏术、旋转刺激、药物等诱发c-Fos的表达，围绕前庭神经系统的几个传导通路来探讨前庭各器官之间的相互联系及功能定位。
目前单侧迷路破坏术后前庭代偿机制形成过程的研究较多，选择代偿机制的原因是因为其包括了几乎所有的前庭器官和通路。
, http://www.100md.com
神经电生理学研究表明，单侧迷路破坏形成的姿态和运动障碍是由于破坏侧迷路器官处于暂时性休眠状态而造成的双侧前庭神经冲动发放不平衡所导致的。损伤侧的前庭神经的自发性活动减少，而健侧增多。在代偿形成过程中，病、健双侧的前庭器官均参与前庭神经的再平衡过程。这一过程的形成可能包括神经传导环路中神经元突触转换前部分和转换后部分(即周围神经部分和中枢神经部分)，突触转换前部分可能是通过损伤侧感受器替代物、或感受器的增生、或其它传入通路的影响(包括健侧传入通路的加强)来替代损伤侧迷路感觉传入。突触转换后部分可能是通过前庭中枢神经系统的内在特性的自我调整来完成的，包括神经数量的增多和受体亲和力的提高[3]。但是，到目前为止，能证明这一假设的证据很少。IEG的研究，如c-Fos和c-jun表达，可以帮助我们揭开单侧迷路损伤形成的机体感觉和运动障碍和代偿形成的分子生物学机制；而且能为我们提供一个包括所有中枢神经系统全程的、动态的变化过程。c-Fos表达的增加表明了神经冲动发放频率的增加或神经可塑性的改变[4]。在前庭失代偿和代偿阶段，涉及的神经器官不仅有前庭核、下橄榄核、网状结构，而且还有小脑和大脑皮层等[5]。而迷路损伤模型的c-FosmRNA和Fos核蛋白的测定结果正好证实了这一论点，即代偿现象的发生是整个大脑协调作用的结果。以下主要介绍单侧迷路破坏术后c-Fos表达的特征。
, 百拇医药
前庭核的c-FosmRNA和Fos核蛋白变化 大鼠在单侧迷路破坏3 h后，前庭上核(SuVe)、前庭内侧核(MVe)、前庭下核(SpVe)、Y细胞群等处c-FosmRNA和Fos核蛋白呈双侧性升高，但这种升高是不对称的。在MVe背侧部分健侧比损伤侧升高更明显，而在其腹侧部分损伤侧比健侧升高更明显。这些实验结果说明背侧MVe不仅控制同侧迷路的兴奋，同时也对对侧迷路进行抑制性控制，而这种抑制性控制可以通过直接通路(也就是联系神经元系统)和间接通路(即通过小脑皮层)两种途径，这种控制的实施是通过腹侧MVE和抑制性GABA等中间神经元来抑制对侧前庭二级神经元的[6]。这样，损伤后3 h健侧MVe因迷路冲动传入而兴奋，而损伤侧MVe丧失了对健侧迷路冲动传入的抑制，造成前庭神经双侧冲动传入的不平衡(健侧升高，损伤侧降低)，导致了身体和头部倾斜，眼球转向损伤侧等症状。MVe背侧部分是前庭神经二级神经元所在地，而其腹侧部分是作用于对侧前庭核的联合神经所在地。由于这些结构与前庭眼动及前庭脊髓的投射十分广泛，因此可以推测这些结构与迷路损伤所形成的眼震和姿态平衡障碍有关。而且发现舌下神经核、罗勒氏核以及中介核的c-FosmRNA和Fos核蛋白也呈双侧不对称性升高。这些结构接受双侧MVe和SpVe的传入投射，同时也发出神经纤维到这些前庭核和外展核，提示了前庭核参与眼和头部运动的控制。
, http://www.100md.com
损伤后6 h和12 h，损伤同侧MVe腹侧部分和对侧背侧部分c-FosmRNA和Fos核蛋白消失，但是同侧MVe背侧部分c-FosmRNA和Fos核蛋白明显地升高。这一结果与用药物破坏迷路或用直流电刺激一侧迷路所得结果一致[7]，有证据表明MVe内c-FosmRNA和Fos核蛋白表达的改变并不是由损伤刺激本身所引起的。损伤侧腹侧MVe的c-FosmRNA和Fos核蛋白升高是中间联合神经细胞活动减弱的结果。
在损伤后6 h，位于腹侧MVe中的联络神经元对健侧背侧MVe产生抑制性作用，从而导致了c-FosmRNA和Fos核蛋白分布的改变，如果这一发现是可靠的，将给前庭功能的代偿过程提供一个最早期的证据。损伤后6 h背侧MVe c-Fos表达的增强说明某些额外的迷路传入冲动(可能是损伤侧腹侧MVe中的联络神经元)也可以作用于其同侧背侧MVe，这是损伤侧前庭神经系统内部自我调节的结果，使得因损伤而造成的前庭休眠状态得以纠正。当然，与眼震快相相关的前庭神经核内的有节律的突发式的放电活动也可造成c-Fos表达的增强。舌下神经核的c-Fos改变是由于前庭神经传入冲动的再分配所制。损伤后肢体姿态的改变至少部分地由于前庭外侧核(LVe)发放冲动的不对称性改变所引起[8]。LVe的前庭脊髓神经系统接受迷路的传入，同时发放冲动(兴奋)到同侧肢体，但是，双侧LVe中只发现少量c-FosmRNA的增加，并不伴随Fos核蛋白的改变，其原因有待于进一步研究。另有证据表明鼠在旋转笼中进行平衡运动训练后，LVe(和小脑核一样，接受小脑皮层的直接投射)中c-Fos表达升高。小脑核和LVe均是小脑的输出单元。LVe在前庭脊髓通路中的下传贯穿整个脊髓，大部分c-Fos表达阳性的部位是向脊髓投射的神经细胞所在地。LVe中c-Fos表达的增强是在运动中前庭功能发挥作用的体现。
, 百拇医药
小脑及旧小脑的变化 损伤后3 h，小脑双侧小结、绒球、副绒球的第9、10小叶中c-Fos表达增高，但损伤侧更明显，6～12 h后这种不对称性消失。在这些小脑皮层中，c-Fos表达主要呈纵向分布，中间间以无c-Fos表达的条纹区，c-Fos表达同时也出现在颗粒细胞层和蒲氏纤维细胞层，但并不伴随Fos核蛋白的增加。这与电刺激小脑感觉和运动皮层所获得的结果一致[9]。可能是由于c-FosmRNA已经诱发，但还没来得及合成Fos核蛋白，或Fos核蛋白已经合成，但是没有被抗体检测到(由于抗体浓度低或Fos核蛋白的快速分解)。旧小脑结构、旁正中核和网状结构(可能与脊髓小脑通路有关)变化同上，这可能是由于LVe的突发性放电所致，因为LVe是通过交叉性的脊髓-网状结构-小脑通路和健侧蒲氏细胞来激动损伤侧前庭脊髓通路的。6 h后c-Fos表达的降低说明双侧网状结构和小脑活动的恢复。
损伤后3 h健侧下橄榄核的某些部位如β下核、Kooy核顶背部、背核、中背核群和B、C下核c-FosmRNA和Fos核蛋白增高，6 h后下降，24 h后消失[10]。健侧区域神经的活动性增强，和损伤同侧MVe和SpVe向该侧橄榄核区的直接投射，导致了这些部位c-Fos表达的变化。下橄榄核区不仅接受前庭神经的输入，也接受视输入。这些信息可以到达前庭脊髓小脑系统和脊髓小脑系统。橄榄核c-Fos表达的变化在前庭代偿机制中起十分重要的作用。可能是由于健侧橄榄核活动的增强，通过上行纤维，抑制了损伤侧蒲氏纤维的简单峰电位(而这种峰电位由于单侧损伤造成的双侧网状小脑系统不平衡而发放增加)。对于损伤侧橄榄核情况则相反。除了这种短期变化的峰电位活动外，由上行纤维向损伤侧小脑皮层的输入也可导致长期变化，这种变化是用来降低蒲氏纤维细胞的峰电位活动，同时也用来减轻蒲氏纤维细胞向小脑和前庭输入的抑制性影响，所有这些变化都使得双侧的不平衡状态得以纠正。
, 百拇医药
基底神经节的变化 损伤3 h后，尾状核和豆状核双侧c-FosmRNA和Fos核蛋白增高，但损伤同侧增高更显著。而且c-FosmRNA分布分散。这一发现证明了Musken的假设，即基底神经节是前庭神经系统的前哨站。损伤后3 h在中央灰质的背侧部和黑质中c-Fos表达是对称性升高，有证据表明中央灰质的背侧部分空间位置感觉输入，参与和控制靶系统产生对新环境的适应性动作(包括整合前庭和眼的感觉输入)。
大脑皮层和皮层下结构的变化 损伤后3 h一些新皮层区c-Fos表达基本上是双侧对称性增高，这一方面是由于特殊感觉通路，包括从健侧前庭器官而来的交叉和不交叉上升投射，另一方面是与损伤造成的本体感觉和视前庭的不正常刺激以及损伤造成的疲劳和紧张有关。
c-FosmRNA和Fos核蛋白的检测在运动病机理研究中的应用
随着航天航空航海事业的发展，有关运动病的研究也越来越被人们重视。近年来的研究是主要采用计算机测量、心脑照相术、心动描记术、脑血流图等手段研究前庭刺激诱发运动病的状态下机体的平衡能力、主观症状、胃电节律、心率变异、皮肤导电水平等方面的病理生理反应，也有研究关于中枢神经系统中单胺物质与运动病的关系。目前已经有人开展将运动病大鼠中枢神经系统的行为状态与细胞的分子信号通道联系起来这方面的工作[12]。金淑仪发现，运动病大鼠中枢神经系统中去甲肾上腺素含量下降，5-羟色胺含量上升，提出运动病可能是一种应激反应，与中枢觉醒成正相关。而去甲肾上腺素等神经递质是参与这种调控的活跃物质，同时去甲肾上腺素通过β受体诱发大脑皮层c-Fos表达已证实[13]。在偏心旋转刺激诱发运动病的大鼠中发现[12]：大脑皮质、脑干、和小脑皮质中c-FosmRNA和Fos核蛋白含量均有增加；本文作者也发现旋转刺激下大鼠前庭核c-Fos表达增强。认为运动病发作时神经细胞间递质含量的改变和Ca2+内流等细胞内信使活动的同时引起c-Fos基因快速转录和翻译，形成Fos蛋白，Fos与jun以“亮氨酸拉链”形成异源二聚体AP-1并结合到靶基因的TGACTA位点。Jabbar[12]认为，Fos/jun二聚体结合到DNA特殊位点上是最终激活MAP激酶的一系列蛋白激酶和PKC调控的重要环节。不同的蛋白激酶又受到二聚体组成成分以及与DNA结合状态的影响。这些蛋白激酶引起一系列蛋白活性的改变，使细胞处于应激反应状态，从而诱发运动病。但是c-Fos基因表达与AP-1与细胞内不同蛋白激酶系统之间如何诱发运动病的确切关系尚待进一步研究。
, 百拇医药
通过对c-Fos表达在中枢神经系统解剖结构的定位研究，我们可以断定c-Fos的表达并不是简单反应神经和代谢活动的电生理活动的信号，而是反应神经中枢内部长远的可塑性的特征，它与神经活动的关系非常复杂。特别是c-Fos表达反应的是与神经通路中信息传递有关的早期变化，为神经传递的过程提供了一个基因水平的步骤。引起c-Fos表达改变的一个可能的机理是去甲肾上腺素能神经活动的改变。去甲肾上腺素能神经在许多结构中都有投射，如前庭核、小脑、尾状核、豆状核和大脑皮层等。在这些结构中，由于蓝斑核的活动而释放的去甲肾上腺素不仅可引起短时程的分子水平活动的改变(通过提高传入信号信噪比)，而且也可以诱发c-Fos表达。另一个可能的机理是兴奋性神经元递质通过激活谷氨酸-N-甲基-D门冬氨酸(NMDA)受体或毒菌碱受体，可诱导c-FosmRNA，证据是c-FosmRNA与Fos核蛋白在脑内的分布与NMDA受体的分布一致，而且NMDA受体拮抗剂MK801能消除或削弱c-Fos的表达[14]。c-Fos表达与神经细胞钙通道的开放、细胞内Ca2+超载及cAMP应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化增加有关[11]。
, http://www.100md.com
目前需要解决的问题是c-Fos的表达究竟是因为刺激本身引起的损伤性变化产物，还是机体应答环境变化的适应性反应产物,它对机体起什么作用；c-Fos的表达是不是机体对刺激应答必不可少的步骤；对于运动病发作个体，使用抗运动病药物能否引起c-Fos的表达的改变。故下一步工作是确定前庭神经细胞中产生c-Fos的神经化学特性；用局部注射c-Fos反意低聚核苷酸阻滞c-Fos表达，是否干扰前庭代偿机制的建立以及是否影响运动病的发生。
尽管c-Fos仍然有许多问题有待解决，c-Fos表达的增加也仅仅说明在特定条件下，有关神经元的活动发生了变化，这种变化的性质和结果是多种多样的，还不能将各种不同的刺激引起c-Fos表达的特异性以及各种信息的特定意义区分开来。但是，c-Fos的研究对于机体平衡机能维持的机理、前庭稳定性的维持、运动病发病机理及其防治、前庭代偿机制的建立(与前庭功能训练有关)等方面都是有益的。
参考文献
, 百拇医药
[1]韩济生.神经科学纲要[M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社.1993:274～278
[2]姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社.1996:128～137
[3]Darlington CL,Flohr H,Smith PF.Molecular mechanisms of brainstem plasticity.The vestibular compensation model[J].Neurobiol,1991,5(1):355～368
[4]Muskens LJJ.The central connexions of the vestibular nuclei with the corpus striatum,and their significance for oculor movements and for locomotion[J].Brain.1929,45(4):421～451
, 百拇医药
[5]Di Giorgio AM.Effetti di lesioni unilaterali della corteccia cerebrale sui fenomeni di compenso da emislabirintazione[S].Atti Accad Fisioc Fad Med Siena,Ser.XI2,382～384
[6]Furuya N,Yabe T.Neurotransmitters in the vestibular commisural system of cat[M].New York:Acad Sci,1992:594～601
[7]Aronin N,Sagar SM,Sharp FR.Light regulates expression of a FOS-related protein in rat suprachias matic nuclei[C].Proc Natl Acad Sci USA 87,1990:5959～5962
, 百拇医药
[8]Pompeiano O.(1986)Neuronal mechanisms underlying compensation of otolith fuction after vestibular lesion[M].In:Keller EL,Zee DS.eds.Adaptive processes in visual and oculomotor systems.Advances in Bioscience:Oxford,Pergamon Press
[9]Sharp FR,Gonzalez MF,Sharp JW.C-FOS expression and (14C)2-deoxyglucose uptake in the caudal cerebellum of the rat during motor/sensory cortex stimulation[J].J Comp Neurol,1989: 284(11),621～636
[10]Kaufman GD,Anderson J H,Beitz A J.Brainstem Fos expression following acute unilateral labyrinthectomy in the rat[J].Neuro,1992:report 3,829～832
, 百拇医药
[11]Dash PK,Moore AN,Dixon CE.Spatial memory deficits,increased phosphorylation of the transcription factor CREB,and induction of the AP-1 complex following experimental brain injury[J].J Neurosci,1995,15(3pt1):2030
[12]王 琰,董文度,袁驾南等.实验性运动病大鼠脑细胞c-Fos基因表达[J].海军医高专学报,1998,20(1):9～12
[13]Bing G,Stone EA,Zhang Y.Immunohistochemical studies of noradrenergic-induced expression of c-Fos in the rat CNS[J].Brain Res,1992,592:57～62
[14]Kitihara T,Takeda N,Saika T.Effects of MK801 of Fos expression in the rat brainstem after unilateral labyrinthectomy[J],Brain Res.,1995,700(84):182～190
收稿日期：1998-12-21, 百拇医药