Wilson病ATP7B基因Arg778Leu突变与临床表型之相关性探讨
作者：刘晓青 张建明 顾学范 吴洁 张雅芬 薛和平 许燮萍 鲍克容 陈瑞冠
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院小儿神经科(刘晓青、张建明、吴洁、许燮萍、鲍克容);上海市儿科医学研究所(顾学范、张雅芬、薛和平、陈瑞冠)
关键词：肝豆状核变性病；基因；突变；表现型；基因型
中华儿科杂志990614 【摘要】 目的 了解Wilson病ATP7B基因的突变与临床表现型的相关性。方法 采用PCR、Msp I酶消化和DNA测序等技术对来自51个家庭的54例Wilson病患者进行ATP7B基因外显子8 Arg778Leu的检测。结果 54例Wilson病患者中36例存在Arg778Leu(CGG→CTG)基因突变，15例为纯合型，21例为杂合型，Arg778Leu等位基因突变频率为47.2 %；46例伴肝损害的患者中33例存在ATP7B基因外显子8的Arg778Leu突变；36例Arg778Leu突变者中34例同时伴有Leu770Leu多态性。结论 Arg 778 Leu突变类型是中国人Wilson病的高频率突变点(47.2%)；Arg 778 Leu突变基因型多数与肝损害临床型相关。
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A study on the relationship between Arg778leu mutation of ATP7B gene and clinical phenotype in Wilson disease patients LIU Xiaoqing*, ZHANG Jianming, GU Xuefan, et al.* Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To study the relationship between Arg778leu mutation of ATP7B gene and clinical phenotype of Wilson disease (WD).Methods Using PCR, Msp I digestion and DNA sequencing, the authors identified the Arg778leu mutations in exon 8 of ATP7B gene in 54 patients from 51 families.Results Among 54 WD patients, 36 were found to carry Arg778leu (CGG-CTG ) mutation, among whom 15 were homozygote, 21 were heterozygote, the frequency of this mutation was 47.2%. Of 46 patients with hepatic damage, 36 were found to have the mutation of Arg778Leu, among whom 34 were found to have Leu770Leu polymorphism simultaneously.Conclusion This study showed that there was a high frequency (47.2%) of Arg778leu mutation in WD patients. The genotype of Arg778leu mutation correlated in most WD patients to the phenotype of hepatic damage.
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【Key words】 Hepatolenticular degeneration Genes Mutation Genotype Phenotype
Wilson病(WD)又称肝豆状核变性(hepatolen- ticular degeneration, HLD)，系P型ATP7B(P-ATP7B)基因缺陷引起铜代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病。由于铜积聚于多脏器，主要引起肝脏、神经系统、角膜、血液系统和肾脏等机能障碍以及精神心理障碍。WD临床症状多样化，但主要表现为不同程度的进行性肝损害或(和)神经系统锥体外系损害，不治疗或延误治疗将危及生命。该症起病大多缓慢，但亦有急性肝衰竭样起病，年幼起病常有肝损害症状，早期仅有肝酶的异常，年长儿或成人则以神经系统表现为首发症状。诊断往往是在症状出现后经综合判断方可建立。近年来国内外学者相继通过对WD患者的ATP7B 基因分析，在ATP7B基因编码区域确定了130余种突变。为进一步了解WD患者ATP7B基因特征，探讨ATP7B基因型和临床表型间的关系，我们将本院神经科门诊随访患者的ATP7B基因外显子8 Arg778Leu DNA检测结果报道如下。
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材料和方法
一、病例来源
54例WD患者分别来自新华医院神经专科随访的51个家庭。发病年龄最小4岁7个月，最大39岁。其中3例<6岁，2例>35岁，余49例为6～17岁。男性33例，女性21例。31例表现肝脏损害，7例表现神经系统锥体外系症状，15例同时伴有肝和神经系统症状，1例无症状(其姐为先证者)。WD诊断根据患者的临床表现、血清铜氧化酶活性、血清铜蓝蛋白及血清铜、尿铜测定、KF环检查及影像学(如MRI)检查，并参照《实用儿科学》(诸福棠主编)、《神经病学》(史玉良主编)关于WD诊断标准综合判断与分型。
二、实验方法
1.DNA提取: 取外周静脉血3 ml, 2%EDTA 100 μl抗凝，常规分离白细胞，通过盐析法抽提基因组DNA。
2.PCR引物和反应条件: 根据文献[1]合成ATP7B基因第8外显子的相应PCR扩增引物：
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ATP7B8a: 5′-aacccttcactgtccttgtc-3′
ATP7B8b: 5′-aggcagctcttttctgaac-3′
PCR反应体积为50 μl，其中包括dNTP各200 μmol/L, 引物各0.5 μmol/L, Taq DNA聚合酶(Promaga公司)2 U, 反应在PE2400热循环仪中进行，扩增条件分别为94℃ 30秒，52℃ 40秒和72℃ 40秒，35个热循环后，72℃延伸10分钟。经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增长度。
3.Msp I限制性内切酶消化：取PCR产物(外显子8)4 μl，Msp I 0.5 μl (5U)，MSP I缓冲液0.5 μl, 37℃消化过夜，于8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，电泳时间3小时，电压100 V。
4.DNA序列分析：采用Sanger双脱氧链末端终止测序法，PCR引物一端在5′端标有生物素，PCR产物与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠混合、纯化，应用T7酶系统测序药盒(Sequenase, 2.0 USB)进行DNA测序反应。经6%变性聚丙酰胺凝胶电泳测序，最后放射自显影48～96小时。
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结 果
一、Msp I 限制性内切酶识别结果
ATP7B基因外显子8引物扩增的PCR片段长度为296 bp，正常序列经Msp I酶消化后成为256 bp和40 bp 2条片段；Arg778Leu基因突变纯合型片段296 bp；同时显示296 bp和256 bp(40 bp因片段过小显示不清)2片段为Arg778Leu基因突变杂合型(图1)。
M：DNA Marker DL200;1：未经Msp I消化的正常对照PCR产物；5：经Msp I消化的正常对照PCR产物；其他编号为WD患者PCR产物。2、7、8：显示未被Msp I识别，为778编码区异常纯合型；3、4：Msp I仅识别1个等位基因，为778编码区异常杂合型；5、6：被Msp I识别，为正常等位基因
图1 Msp I限制性内切酶消化ATP7B外显子8的778编码区部分结果
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二、ATP7B外显子8 DNA序列分析
对所有患者DNA序列分析，在ATP7B基因外显子8区域发现2种基因突变，ATP7B基因778位密码子的第2个碱基发生错义突变(CGG→CTG)，即Arg778Leu。770位密码子的第3个碱基发生保守突变(CTC→CTG)，即Leu770Leu(图2)。
WD011、WD013：Arg778Leu基因突变(G-T)杂合型, 同时伴C2310G多态性；WD012：Arg778Leu基因突变纯合型, 同时伴C2310G多态性；正常对照：为正常序列
图2 部分WD患者的ATP7B外显子8的Arg778Leu基因突变DNA测序结果
三、Arg778L等位基因突变频率
36/54例WD患者发生Arg778Leu基因突变，15/36例为Arg778Leu基因突变纯合型，21/36例为Arg778Leu基因突变杂合型，Arg778Leu突变频率为47.2%。含Arg778Leu 突变等位基因同时伴有Leu770Leu多态性变化者占94%。
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四、Arg778Leu基因突变类型与临床表型之关系
根据病史资料54例WD患者中，46例伴有不同程度的肝脏损害表现，其中单纯肝损害表现的为31例，24例显示Arg778Leu基因突变(77.4%)，15/24例为基因纯合型。15例肝损害同时伴有神经系统功能障碍中9例显示Arg778Leu基因突变杂合型(60%)。
讨 论
1993年Bull等发现WD的基因为P型ATP7B基因，定位于第13号染色体(13q14.3)[2], 已被证明广泛分布于全世界人种中，其发生率在活产婴儿中约占1/30 000，基因频率分布为0.3%～0.7%，照此估计ATP7B基因杂合子携带频率约为1%以上。ATP7B基因主要在肝脏、肾脏和胎盘表达，在心脏、脑、肺、肌肉和胰腺呈低水平表达，全长cDNA序列由1411氨基酸组成，是离子转运P型ATP酶的亚型，具有金属结合区域，离子通道，磷酸化区和转化区[2]。该基因含21个外显子，外显子8于基因的Tm区域，突变可影响铜转运[3]。近年来国内外学者相继开展WD的ATP7B基因突变检测研究，发现日本、韩国、我国台湾省和我国内地WD患者的突变位点热区是Arg778Leu，突变频率分别为28%、37%、27%及37.5%[4-7]。针对这一情况，我们用Msp I限制性内切酶识别正常序列，对不被其识别的检体分别进行ATP7B外显子8的序列分析，结果显示，Arg778Leu的突变发生频率为47.2%。并发现携带该突变的患者同时伴有Leu770Leu的多态性(94%)，这一现象是否与地区人种相关尚有待于进一步研究。
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46例伴有肝损害表现的患者中36例存在Arg778Leu突变，说明WD的肝损害表现与Arg778Leu突变存在相关性。本组有1例患者发病后其妹妹血清铜氧化酶活性降低，诊断为症状前WD，服用青霉胺，经基因检测为WD基因携带者，从而免终身服药。因此，开展基因诊断有助于WD的确诊。
本研究结果提示：WD突变常见部位与日本、韩国和我国台湾等地区的报道相似，Arg778Leu可能与WD肝脏损害表型有密切相关性。为进一步研究WD基因异常，我们正在开展ATP7B基因功能和结构间的相关性研究。
本课题为上海市教育委员会资助项目(96博士点课题)
参考文献
1 Gordon R, Thomas GR, John R, et al. The Wilson disease gene:spectrum of mutations and their conseqences. Nature Genet,1995, 9:210-217.
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2 Bull PC, Thomas GR, Rommens JM, et al. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATP ase similar to the menker gene. Nature Genet, 1993, 5:327-335.
3 Shah AB, Chernov I, Zhang HT, et al. Identification and analysis of mutations in the Wilson disease gene(ATP7B):population frequencies, genotype-phenotype correlation, and functional analyses. Am J Hum Genet, 1997, 61:317-328.
4 Nanji MS, Nguyen VT, Kawasoe JH, et al. Haplotype and mutation analysis in Japanese patients with Wilson disease. Am J Hum Genet, 1997, 60:1423-1427.
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5 Kim EK, Yoo OJ, Song KY, et al. Identification of three novel mutations and a high frequency of the Arg778Leu mutation in Korean patients with Wilson disease. Hum Mutat, 1998, 11:275-278.
6 Chuang LM, Wu HP, Jang MH, et al. High frequency of two mutations in codon 778 in exon 8 of the ATP7B gene in Taiwanese families with Wilson disease. J Med Gengt, 1996, 33:521-523.
7 杨任民，范玉新，余龙.肝豆状核变性基因的一种新型错义突变.中华医学遗传学杂志，1997，77:344-346.
(收稿：1998-07-28 修回：1999-02-04), 百拇医药
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院小儿神经科(刘晓青、张建明、吴洁、许燮萍、鲍克容);上海市儿科医学研究所(顾学范、张雅芬、薛和平、陈瑞冠)
关键词：肝豆状核变性病；基因；突变；表现型；基因型
中华儿科杂志990614 【摘要】 目的 了解Wilson病ATP7B基因的突变与临床表现型的相关性。方法 采用PCR、Msp I酶消化和DNA测序等技术对来自51个家庭的54例Wilson病患者进行ATP7B基因外显子8 Arg778Leu的检测。结果 54例Wilson病患者中36例存在Arg778Leu(CGG→CTG)基因突变，15例为纯合型，21例为杂合型，Arg778Leu等位基因突变频率为47.2 %；46例伴肝损害的患者中33例存在ATP7B基因外显子8的Arg778Leu突变；36例Arg778Leu突变者中34例同时伴有Leu770Leu多态性。结论 Arg 778 Leu突变类型是中国人Wilson病的高频率突变点(47.2%)；Arg 778 Leu突变基因型多数与肝损害临床型相关。
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A study on the relationship between Arg778leu mutation of ATP7B gene and clinical phenotype in Wilson disease patients LIU Xiaoqing*, ZHANG Jianming, GU Xuefan, et al.* Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092
【Abstract】 Objective To study the relationship between Arg778leu mutation of ATP7B gene and clinical phenotype of Wilson disease (WD).Methods Using PCR, Msp I digestion and DNA sequencing, the authors identified the Arg778leu mutations in exon 8 of ATP7B gene in 54 patients from 51 families.Results Among 54 WD patients, 36 were found to carry Arg778leu (CGG-CTG ) mutation, among whom 15 were homozygote, 21 were heterozygote, the frequency of this mutation was 47.2%. Of 46 patients with hepatic damage, 36 were found to have the mutation of Arg778Leu, among whom 34 were found to have Leu770Leu polymorphism simultaneously.Conclusion This study showed that there was a high frequency (47.2%) of Arg778leu mutation in WD patients. The genotype of Arg778leu mutation correlated in most WD patients to the phenotype of hepatic damage.
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【Key words】 Hepatolenticular degeneration Genes Mutation Genotype Phenotype
Wilson病(WD)又称肝豆状核变性(hepatolen- ticular degeneration, HLD)，系P型ATP7B(P-ATP7B)基因缺陷引起铜代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病。由于铜积聚于多脏器，主要引起肝脏、神经系统、角膜、血液系统和肾脏等机能障碍以及精神心理障碍。WD临床症状多样化，但主要表现为不同程度的进行性肝损害或(和)神经系统锥体外系损害，不治疗或延误治疗将危及生命。该症起病大多缓慢，但亦有急性肝衰竭样起病，年幼起病常有肝损害症状，早期仅有肝酶的异常，年长儿或成人则以神经系统表现为首发症状。诊断往往是在症状出现后经综合判断方可建立。近年来国内外学者相继通过对WD患者的ATP7B 基因分析，在ATP7B基因编码区域确定了130余种突变。为进一步了解WD患者ATP7B基因特征，探讨ATP7B基因型和临床表型间的关系，我们将本院神经科门诊随访患者的ATP7B基因外显子8 Arg778Leu DNA检测结果报道如下。
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材料和方法
一、病例来源
54例WD患者分别来自新华医院神经专科随访的51个家庭。发病年龄最小4岁7个月，最大39岁。其中3例<6岁，2例>35岁，余49例为6～17岁。男性33例，女性21例。31例表现肝脏损害，7例表现神经系统锥体外系症状，15例同时伴有肝和神经系统症状，1例无症状(其姐为先证者)。WD诊断根据患者的临床表现、血清铜氧化酶活性、血清铜蓝蛋白及血清铜、尿铜测定、KF环检查及影像学(如MRI)检查，并参照《实用儿科学》(诸福棠主编)、《神经病学》(史玉良主编)关于WD诊断标准综合判断与分型。
二、实验方法
1.DNA提取: 取外周静脉血3 ml, 2%EDTA 100 μl抗凝，常规分离白细胞，通过盐析法抽提基因组DNA。
2.PCR引物和反应条件: 根据文献[1]合成ATP7B基因第8外显子的相应PCR扩增引物：
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ATP7B8a: 5′-aacccttcactgtccttgtc-3′
ATP7B8b: 5′-aggcagctcttttctgaac-3′
PCR反应体积为50 μl，其中包括dNTP各200 μmol/L, 引物各0.5 μmol/L, Taq DNA聚合酶(Promaga公司)2 U, 反应在PE2400热循环仪中进行，扩增条件分别为94℃ 30秒，52℃ 40秒和72℃ 40秒，35个热循环后，72℃延伸10分钟。经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增长度。
3.Msp I限制性内切酶消化：取PCR产物(外显子8)4 μl，Msp I 0.5 μl (5U)，MSP I缓冲液0.5 μl, 37℃消化过夜，于8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，电泳时间3小时，电压100 V。
4.DNA序列分析：采用Sanger双脱氧链末端终止测序法，PCR引物一端在5′端标有生物素，PCR产物与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠混合、纯化，应用T7酶系统测序药盒(Sequenase, 2.0 USB)进行DNA测序反应。经6%变性聚丙酰胺凝胶电泳测序，最后放射自显影48～96小时。
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结 果
一、Msp I 限制性内切酶识别结果
ATP7B基因外显子8引物扩增的PCR片段长度为296 bp，正常序列经Msp I酶消化后成为256 bp和40 bp 2条片段；Arg778Leu基因突变纯合型片段296 bp；同时显示296 bp和256 bp(40 bp因片段过小显示不清)2片段为Arg778Leu基因突变杂合型(图1)。
M：DNA Marker DL200;1：未经Msp I消化的正常对照PCR产物；5：经Msp I消化的正常对照PCR产物；其他编号为WD患者PCR产物。2、7、8：显示未被Msp I识别，为778编码区异常纯合型；3、4：Msp I仅识别1个等位基因，为778编码区异常杂合型；5、6：被Msp I识别，为正常等位基因
图1 Msp I限制性内切酶消化ATP7B外显子8的778编码区部分结果
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二、ATP7B外显子8 DNA序列分析
对所有患者DNA序列分析，在ATP7B基因外显子8区域发现2种基因突变，ATP7B基因778位密码子的第2个碱基发生错义突变(CGG→CTG)，即Arg778Leu。770位密码子的第3个碱基发生保守突变(CTC→CTG)，即Leu770Leu(图2)。
WD011、WD013：Arg778Leu基因突变(G-T)杂合型, 同时伴C2310G多态性；WD012：Arg778Leu基因突变纯合型, 同时伴C2310G多态性；正常对照：为正常序列
图2 部分WD患者的ATP7B外显子8的Arg778Leu基因突变DNA测序结果
三、Arg778L等位基因突变频率
36/54例WD患者发生Arg778Leu基因突变，15/36例为Arg778Leu基因突变纯合型，21/36例为Arg778Leu基因突变杂合型，Arg778Leu突变频率为47.2%。含Arg778Leu 突变等位基因同时伴有Leu770Leu多态性变化者占94%。
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四、Arg778Leu基因突变类型与临床表型之关系
根据病史资料54例WD患者中，46例伴有不同程度的肝脏损害表现，其中单纯肝损害表现的为31例，24例显示Arg778Leu基因突变(77.4%)，15/24例为基因纯合型。15例肝损害同时伴有神经系统功能障碍中9例显示Arg778Leu基因突变杂合型(60%)。
讨 论
1993年Bull等发现WD的基因为P型ATP7B基因，定位于第13号染色体(13q14.3)[2], 已被证明广泛分布于全世界人种中，其发生率在活产婴儿中约占1/30 000，基因频率分布为0.3%～0.7%，照此估计ATP7B基因杂合子携带频率约为1%以上。ATP7B基因主要在肝脏、肾脏和胎盘表达，在心脏、脑、肺、肌肉和胰腺呈低水平表达，全长cDNA序列由1411氨基酸组成，是离子转运P型ATP酶的亚型，具有金属结合区域，离子通道，磷酸化区和转化区[2]。该基因含21个外显子，外显子8于基因的Tm区域，突变可影响铜转运[3]。近年来国内外学者相继开展WD的ATP7B基因突变检测研究，发现日本、韩国、我国台湾省和我国内地WD患者的突变位点热区是Arg778Leu，突变频率分别为28%、37%、27%及37.5%[4-7]。针对这一情况，我们用Msp I限制性内切酶识别正常序列，对不被其识别的检体分别进行ATP7B外显子8的序列分析，结果显示，Arg778Leu的突变发生频率为47.2%。并发现携带该突变的患者同时伴有Leu770Leu的多态性(94%)，这一现象是否与地区人种相关尚有待于进一步研究。
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46例伴有肝损害表现的患者中36例存在Arg778Leu突变，说明WD的肝损害表现与Arg778Leu突变存在相关性。本组有1例患者发病后其妹妹血清铜氧化酶活性降低，诊断为症状前WD，服用青霉胺，经基因检测为WD基因携带者，从而免终身服药。因此，开展基因诊断有助于WD的确诊。
本研究结果提示：WD突变常见部位与日本、韩国和我国台湾等地区的报道相似，Arg778Leu可能与WD肝脏损害表型有密切相关性。为进一步研究WD基因异常，我们正在开展ATP7B基因功能和结构间的相关性研究。
本课题为上海市教育委员会资助项目(96博士点课题)
参考文献
1 Gordon R, Thomas GR, John R, et al. The Wilson disease gene:spectrum of mutations and their conseqences. Nature Genet,1995, 9:210-217.
, http://www.100md.com
2 Bull PC, Thomas GR, Rommens JM, et al. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATP ase similar to the menker gene. Nature Genet, 1993, 5:327-335.
3 Shah AB, Chernov I, Zhang HT, et al. Identification and analysis of mutations in the Wilson disease gene(ATP7B):population frequencies, genotype-phenotype correlation, and functional analyses. Am J Hum Genet, 1997, 61:317-328.
4 Nanji MS, Nguyen VT, Kawasoe JH, et al. Haplotype and mutation analysis in Japanese patients with Wilson disease. Am J Hum Genet, 1997, 60:1423-1427.
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5 Kim EK, Yoo OJ, Song KY, et al. Identification of three novel mutations and a high frequency of the Arg778Leu mutation in Korean patients with Wilson disease. Hum Mutat, 1998, 11:275-278.
6 Chuang LM, Wu HP, Jang MH, et al. High frequency of two mutations in codon 778 in exon 8 of the ATP7B gene in Taiwanese families with Wilson disease. J Med Gengt, 1996, 33:521-523.
7 杨任民，范玉新，余龙.肝豆状核变性基因的一种新型错义突变.中华医学遗传学杂志，1997，77:344-346.
(收稿：1998-07-28 修回：1999-02-04), 百拇医药