丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合多表位抗原基因与谷胱甘肽转硫酶基因的融合表达及其在小鼠中免疫应答的研究
作者：①黄建生② 钟雄林② 毕惠祥② 董文其② 张 潜 解咏梅 袁纪军 李安康 董 宁 任大明
单位：复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433
关键词：丙型肝炎；恶性疟原虫；免疫应答；融合表达；双价疫苗；谷胱甘肽转硫酶
中国免疫学杂志/990603 摘 要 目的：探讨复合多表位丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)及恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, Pf)双价疫苗的可行性。方法：将人工合成的复合多表位HCV基因PCX及Pf抗原基因AB(SPf66+SPf105)克隆到谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferase, GST)表达载体pGEX-2T中，并在大肠杆菌中高效表达GST-HCV-Pf复合抗原(GST-CAB)，分析表达产物的免疫特异性、免疫原性及安全性。结果：GST-CAB可被HCV患者血清、鼠抗GZ-PCX及鼠抗Pf抗体特异识别，可诱发小鼠产生针对GST-CAB、GZ-PCX及Pf Ag的特异性体液免疫应答及针对GST-CAB、GZ-PCX的迟发性超敏反应，免疫后CD8+T细胞比例略为升高，免疫小鼠未见明显的毒副作用。结论：GST-CAB融合蛋白具有良好的HCV及Pf免疫特异性，可诱发理想的体液及细胞免疫应答，可望成为HCV-Pf双价疫苗的候选抗原。
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中国图书分类号 Q781
Expression of multi-epitopes antigen gene of hepatitis C virus and plasmodium falciparum fused to glutathione S-transferase gene and studies on its immunogenicity in mice
HUANG Jian-Sheng, ZHONG Xiong-Lin, BI Hui-Xiang et al.
State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai 200433
Abstract Objective:To explore the possibility of bivalent vaccine corresponding to hepatitis C virus (HCV) and plasmodium falciparum (Pf). Methods：Two synthetic multiple epitopes antigen genes PCX of HCV and AB of Pf were cloned into glutathione S-transferase fusion expression vector pGEX-2T to highly express the fusion antigen GST-CAB. The immunological specificity,immune response and safety in mice were studied. Results:GST-CAB specifically reacted with anti-HCV and anti-Pf sera, and induced highly specific antibodies, which could recognize GST-CAB、GZ-PCX antigen and the ratio of CD8+T cells was slightly higher as compared with that of blank control. Conclusion：The results show the hybrid antigen GST-CAB has excellent antigenicity and might be able to serve as a bivalent vaccine candidate specific for both hepatitis C virus and plasmodium falciparum.
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Key words Hepatitis C virus (HCV) Plasmodium falciparum (Pf) Immune response Fused expression Bivalent vaccine Glutathione S-transferase (GST)
有人曾对我国5个自然村的中青年人群中疟疾和HCV感染进行流行病学调查，结果表明单采血浆还输血细胞献血者疟疾发病率和HCV感染率分别为4.14%和84.06%，双重感染率为3.72%，疟疾患者合并HCV感染率为89.74%[1]，而用ELISA法筛选献血员丙肝抗体却能基本防止输血疟发生[2]，可见HCV与疟疾感染具有一定的相关性。HCV与Pf虽然种属不同，但其病原体本身都具有高度变异性，其免疫均以细胞免疫为主，因此设计一种能同时针对这两种疾病，特别是可诱发高水平细胞免疫应答的疫苗，将具有重要的意义。本研究将人工设计合成的已经被证实具有良好免疫特异性的HCV多表位复合抗原基因PCX及恶性疟疾原虫复合多价疫苗基因AB(SPf66+SPf105)串联起来[3]，并与GST基因融合后在大肠杆菌中高效表达，研究该HCV-Pf双价抗原在小鼠中的免疫应答水平及免疫特异性。
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1 材料与方法
1.1 菌株与质粒 质粒pUC119/PCX、pWR/CAB及大肠杆菌TG1、JM105、DH5α为本实验室提供。质粒pGEX-2T为第一军医大学钟雄林老师惠赠。
1.2 试剂 限制性内切酶及T4 DNA连接酶均购自Promega公司；异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司；DNase I购自Boehinger Mannheim公司；DNA标志物、蛋白质次低分子量标记物、HRP-兔抗人IgG、兔抗鼠、羊抗兔IgG、邻苯二胺(OPD)、弗氏完全佐剂均购自华舜生物工程公司。GZ-PCX蛋白为我室所纯化[4]。恶性疟原虫抗原(Pf Ag)为第一军医大学毕惠祥及董文其老师赠送。
1.3 血清 HCV+/-血清为上海市第一人民医院谢匡成医生赠送，鼠抗GZ-PCX(滴度1∶106)及鼠抗Pf血清(1∶3 200)为本实验室所制备(待发表)。
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1.4 引物的设计及基因的扩增 以质粒pWR/CAB中CAB基因为模板，根据pGEX-2T的酶切图谱，合成一对5′端及3′端分别带有BamH I及EcoR I位点的引物，序列如下：
按以下方法扩增CAB片段：96℃×6 min，1个循环；94℃×30 s，55℃×30 s，72℃×30 s，20个循环；72℃×6 min。2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定CAB基因的扩增产物。
1.5 CAB基因与GST基因的连接 利用胶回收Kit(华舜生物工程公司)回收上述PCR扩增产物CAB，用BamH I/EcoR I分别酶切该片段及载体pGEX-2T，两片段在T4 DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，取5 μl连接液转化E.coli TG1，涂氨苄平板，挑取转化子，小抽质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取比对照质粒pGEX-2T略大的质粒，用BamH I/EcoR I酶切后，2.0%琼脂糖凝胶电泳，重组质粒命名为pGEX/CAB，该质粒即带有GST-CAB融合基因。
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1.6 pGEX/CAB在JM105及DH5α中的高效表达 把上述鉴定正确的重组质粒pGEX/CAB及对照载体pGEX-2T分别转化JM105及DH5α，获得重组表达菌株JM105(pGEX/CAB)、JM105(pGEX-2T)及DH5α(pGEX/CAB)、DH5α(pGEX-2T)。按常规方法进行诱导表达，表达的目的蛋白命名为GST-CAB，载体表达的蛋白为GST。
1.7 JM105(pGEX/CAB)的发酵表达 把筛选到的高效表达目的蛋白GST-CAB的重组菌株JM105(pGEX/CAB)接种到TB培养基中，培养后转接到2 L的TB培养基中(5 L发酵罐)，通气速度6 L/min，搅拌速度380 r/min，于37℃发酵3.5 h时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，进行诱导，继续培养4.0 h后收菌，用于蛋白质的纯化。
1.8 GZ-CAB蛋白的纯化及复性 参照文献[5]进行。
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1.9 ELISA法分析融合抗原的免疫特异性 参照文献[5]进行。GST-CAB按1 μg/孔4℃包被过夜，一抗分别为HCV+/-血清、鼠抗GZ-PCX血清及鼠抗Pf血清，分别以1∶20、1∶2 000、1∶500稀释，二抗分别为HRP-兔抗人及兔抗鼠IgG。
1.10 小鼠免疫 ICR小鼠购自海军医学研究所实验动物中心，健康雌性4周龄小鼠，17～21 g，每组小鼠5只。把所纯化的蛋白质GST-CAB用适量的PBS溶解后，加等体积弗氏完全佐剂乳化完全，于小鼠尾部皮下多点注射免疫，每只免疫量为0.1 mg/次，分别于0、2、4 w时相同剂量各免疫10次。隔2 w采集血清10次。
1.11 免疫血清特异性抗体的检测 ELISA方法同上。同一份血清同时用GST-CAB及GZ-PCX蛋白包被后检测。
1.12 迟发性超敏反应(DTH) 于免疫后第8周，分别用GST-CAB及GZ-PCX抗原皮下注射小鼠后足趾，注射剂量为10 μg，观察注射部位的变化。
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1.13 CD4、CD8淋巴细胞亚群的检测 自小鼠眼球采血2～3滴，取20 μl抗凝血，加入20 μl抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15 min后加入200 μl细胞裂解液，5 min后加入1 ml PBS，3 000 r/min×2 min，沉淀用400 μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc.)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4/CD8比值。
1.14 免疫小鼠体重及肝脾重量变化 免疫后不同时间分别称取小鼠体重，至第12周处死小鼠，观察小鼠肝脾大小。
2 结果
2.1 pGEX/CAB的克隆 图1为获得的重组质粒pGEX/CAB的酶切PAGE电泳结果，重组正确。
2.2 CAB基因在JM105及DH5α中的表达 图2为GST-CAB基因在JM105中的表达情况，GST-CAB及GST分别为42、25 kU，前者比理论推算值(48 kU)略小，目的蛋白的表达量约20%。加入IPTG诱导后，4.0 h 目的蛋白GST-CAB的表达量最高。GST-CAB基因在DH5α中的表达水平与在JM105中的相似(图略)。
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图1 质粒pGEX/CAB酶切图(2% agarose)
Fig.1 Enzyme digestion of pGEX/CAB plasmid (2% agarose)
Note：1，2.pGEX/CAB BamH I/EcoR I；3.CAB PCR products；4.pGEM7zf(+) HaeⅢ
图2 GST-CAB基因在JM105中的表达(12% SDS-PAGE)
Fig.2 Expression of GST-CAB gene in JM105(12% SDS-PAGE)
Note：1.JM105；2.JM105(pGEX-2T) non-induced;3，4.JM105(pGEX-2T)induced；5.JM105(pGEX/CAB)non-induced；6，7.JM105(pGEX/CAB)induced;8.protein marker
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2.3 GST-CAB融合抗原的纯化 纯化结果见图3。用改良后的纯化包涵体及其溶解方法，测得包涵体溶解率约80%，GZ-CAB蛋白经计算机扫描纯度为92.6%。
图3 GST-CAB蛋白的纯化(12%SDS-PAGE)
Fig.3 Purification of GST-CAB protein (12% SDS-PAGE)
Note:1.protein marker；2.GST-CAB solubilized supernatant;3.dissolubilized inclusion body;4.washed supernatant of inclusion body
2.4 ELISA检测GZ-CAB抗原性结果 图4为GST-CAB融合蛋白分别与人HCV血清(H-HCV)、鼠抗Pf血清(M-Pf)及鼠抗GZ-PCX血清(M-GZ-PCX)阳性及阴性血清反应的结果，两者都存在显著性差异(P<0.001、<0.005及<0.01)，证实该融合蛋白具有良好的HCV及Pf的免疫特异性。
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图4 GST-CAB抗原与不同血清反应
Fig.4 GST-CAB antigen reacted with different sera
2.5 免疫血清的检测 免疫后小鼠可产生高滴度的抗GST-CAB IgG(最高达1∶105)，其抗体消长情况见图5。抗血清可以识别GZ-PCX中的HCV PCX抗原部分以及Pf抗原(图5，6)，与空白对照组相比，P<0.001，但后者滴度较低。
图5 GST-CAB蛋白免疫后抗体消长情况(Ab∶1∶1000稀释)
Fig.5 Antibody responses after immunization (Ab：1∶1 000 dilution)
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图6 抗GST-CAB IgG与不同抗原反应
Fig.6 Anti-GST-CAB IgG reacted with different antigens
2.6 DTH结果 GST-CAB疫苗免疫组小鼠足趾明显肿大，但针对GZ-PCX蛋白的DTH反应则稍弱(只有PCX抗原部分参与DTH反应，而前者则是整个GST-CAB抗原)，空白对照组则未见阳性反应。
2.7 CD4/CD8结果 CD4/CD8平均比值为3.27，而空白对照组为3.94，两者比较P>0.2，未见显著性差异。但CD8+T细胞在免疫后比例升高，提示CD8+T细胞在该抗原的免疫应答中可能起重要的作用。
2.8 安全性 免疫后小鼠体重未见明显下降，处死小鼠后发现脾脏肿大约1.5倍，而肝脏则未见明显变化。
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3 讨论
目前认为人工合成疫苗适合于所有疫苗的研究，是一种安全、价廉、多价、易于储存运输、具有极好的靶攻击特异性等优点，这都是传统疫苗所不能比及的。我们所设计的HCV-Pf复合多表位基因中含有多个高度保守的B/T细胞保护性表位，为诱发高效的免疫应答及可能产生的免疫保护力打下良好的基础。
目前重组蛋白的表达一般有融合蛋白和游离蛋白两种方式，虽然游离蛋白能更好地保持蛋白的天然状态，但融合蛋白表达系统相比起来有以下几个明显的优点：①融合蛋白的转录和翻译的起始均由正常的大肠杆菌调控基因和结构基因控制，可获得高产量的表达产物，有利于融合蛋白的纯化；②融合蛋白在宿主菌中不象外源蛋白那样容易被蛋白酶所降解，具有较好的稳定性；③融合蛋白具有较大的分子量，有助于提高分子量较小的外源蛋白的免疫原性，可以直接从电泳凝胶上割下融合蛋白条带磨碎后进行免疫。最常用的融合蛋白表达系统是把外源蛋白与β-半乳糖苷酶LacZ融合，由于β-半乳糖苷酶活性检测方法简便易行，有利于表达产物的检测。另有一种表达系统是外源蛋白与25 kU的GST融合，表达的融合蛋白用凝血酶原酶解，可获得游离目的蛋白，这在必须获得游离蛋白而外源蛋白分子量又较小以及直接表达游离蛋白困难较大的情况下更为有用。
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本研究把HCV-Pf双价基因与GST融合后，获得了高效表达，所表达的目的蛋白具有良好的免疫特异性，可被抗HCV Ab及抗Pf Ab特异识别。小鼠免疫后，可诱发高水平的抗体反应，最高滴度可达1∶105，且抗体的持久性较好。免疫血清要识别GST-PCX、GZ-PCX、Pf Ag，都显示该复合抗原作为HCV-Pf双价疫苗的可行性。我们正尝试用thrombin酶解GST-CAB蛋白，以期获得HCV-Pf游离蛋白，进一步研究其免疫特异性。
致谢：本研究得到第二军医大学张明薇老师，曹雪涛教授的帮助，在此表示谢意!
①本课题受国家自然科学基金资助(39780002)
②第一军医大学免疫学教研室，广州510515
作者简介：黄建生，男，29岁，博士生，主要从事基因工程疫苗及基因工程抗体研究
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4 参考文献
1 陈素良，张志坤，赵 勇 et al. 单采血浆还输血细胞引起疟疾和丙型肝炎的流行病学研究.中国公共卫生，1995；11(1)：1
2 钱 朴，吴定芬.输血后疟疾的预防措施及与丙肝抗体检测关系之探讨.中级医刊，1996；31(5)：24
3 王昌才，钟雄林，陈仕荣 et al. 恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究.上海免疫学杂志，1997；17(3)：139
4 黄建生，解咏梅，沈先荣 et al. HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998；37(4)：551
5 Huang J S, Wang C C, Ren D M et al. Immunogenicity of recombinant attenuated salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of plasmodium falciparum. J Med Col PLA, 1997;12(2):166
〔收稿1998-09-21 修回1998-10-15〕, 百拇医药
单位：复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海200433
关键词：丙型肝炎；恶性疟原虫；免疫应答；融合表达；双价疫苗；谷胱甘肽转硫酶
中国免疫学杂志/990603 摘 要 目的：探讨复合多表位丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)及恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, Pf)双价疫苗的可行性。方法：将人工合成的复合多表位HCV基因PCX及Pf抗原基因AB(SPf66+SPf105)克隆到谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferase, GST)表达载体pGEX-2T中，并在大肠杆菌中高效表达GST-HCV-Pf复合抗原(GST-CAB)，分析表达产物的免疫特异性、免疫原性及安全性。结果：GST-CAB可被HCV患者血清、鼠抗GZ-PCX及鼠抗Pf抗体特异识别，可诱发小鼠产生针对GST-CAB、GZ-PCX及Pf Ag的特异性体液免疫应答及针对GST-CAB、GZ-PCX的迟发性超敏反应，免疫后CD8+T细胞比例略为升高，免疫小鼠未见明显的毒副作用。结论：GST-CAB融合蛋白具有良好的HCV及Pf免疫特异性，可诱发理想的体液及细胞免疫应答，可望成为HCV-Pf双价疫苗的候选抗原。
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Expression of multi-epitopes antigen gene of hepatitis C virus and plasmodium falciparum fused to glutathione S-transferase gene and studies on its immunogenicity in mice
HUANG Jian-Sheng, ZHONG Xiong-Lin, BI Hui-Xiang et al.
State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai 200433
Abstract Objective:To explore the possibility of bivalent vaccine corresponding to hepatitis C virus (HCV) and plasmodium falciparum (Pf). Methods：Two synthetic multiple epitopes antigen genes PCX of HCV and AB of Pf were cloned into glutathione S-transferase fusion expression vector pGEX-2T to highly express the fusion antigen GST-CAB. The immunological specificity,immune response and safety in mice were studied. Results:GST-CAB specifically reacted with anti-HCV and anti-Pf sera, and induced highly specific antibodies, which could recognize GST-CAB、GZ-PCX antigen and the ratio of CD8+T cells was slightly higher as compared with that of blank control. Conclusion：The results show the hybrid antigen GST-CAB has excellent antigenicity and might be able to serve as a bivalent vaccine candidate specific for both hepatitis C virus and plasmodium falciparum.
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Key words Hepatitis C virus (HCV) Plasmodium falciparum (Pf) Immune response Fused expression Bivalent vaccine Glutathione S-transferase (GST)
有人曾对我国5个自然村的中青年人群中疟疾和HCV感染进行流行病学调查，结果表明单采血浆还输血细胞献血者疟疾发病率和HCV感染率分别为4.14%和84.06%，双重感染率为3.72%，疟疾患者合并HCV感染率为89.74%[1]，而用ELISA法筛选献血员丙肝抗体却能基本防止输血疟发生[2]，可见HCV与疟疾感染具有一定的相关性。HCV与Pf虽然种属不同，但其病原体本身都具有高度变异性，其免疫均以细胞免疫为主，因此设计一种能同时针对这两种疾病，特别是可诱发高水平细胞免疫应答的疫苗，将具有重要的意义。本研究将人工设计合成的已经被证实具有良好免疫特异性的HCV多表位复合抗原基因PCX及恶性疟疾原虫复合多价疫苗基因AB(SPf66+SPf105)串联起来[3]，并与GST基因融合后在大肠杆菌中高效表达，研究该HCV-Pf双价抗原在小鼠中的免疫应答水平及免疫特异性。
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1 材料与方法
1.1 菌株与质粒 质粒pUC119/PCX、pWR/CAB及大肠杆菌TG1、JM105、DH5α为本实验室提供。质粒pGEX-2T为第一军医大学钟雄林老师惠赠。
1.2 试剂 限制性内切酶及T4 DNA连接酶均购自Promega公司；异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司；DNase I购自Boehinger Mannheim公司；DNA标志物、蛋白质次低分子量标记物、HRP-兔抗人IgG、兔抗鼠、羊抗兔IgG、邻苯二胺(OPD)、弗氏完全佐剂均购自华舜生物工程公司。GZ-PCX蛋白为我室所纯化[4]。恶性疟原虫抗原(Pf Ag)为第一军医大学毕惠祥及董文其老师赠送。
1.3 血清 HCV+/-血清为上海市第一人民医院谢匡成医生赠送，鼠抗GZ-PCX(滴度1∶106)及鼠抗Pf血清(1∶3 200)为本实验室所制备(待发表)。
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1.4 引物的设计及基因的扩增 以质粒pWR/CAB中CAB基因为模板，根据pGEX-2T的酶切图谱，合成一对5′端及3′端分别带有BamH I及EcoR I位点的引物，序列如下：
按以下方法扩增CAB片段：96℃×6 min，1个循环；94℃×30 s，55℃×30 s，72℃×30 s，20个循环；72℃×6 min。2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定CAB基因的扩增产物。
1.5 CAB基因与GST基因的连接 利用胶回收Kit(华舜生物工程公司)回收上述PCR扩增产物CAB，用BamH I/EcoR I分别酶切该片段及载体pGEX-2T，两片段在T4 DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，取5 μl连接液转化E.coli TG1，涂氨苄平板，挑取转化子，小抽质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，取比对照质粒pGEX-2T略大的质粒，用BamH I/EcoR I酶切后，2.0%琼脂糖凝胶电泳，重组质粒命名为pGEX/CAB，该质粒即带有GST-CAB融合基因。
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1.6 pGEX/CAB在JM105及DH5α中的高效表达 把上述鉴定正确的重组质粒pGEX/CAB及对照载体pGEX-2T分别转化JM105及DH5α，获得重组表达菌株JM105(pGEX/CAB)、JM105(pGEX-2T)及DH5α(pGEX/CAB)、DH5α(pGEX-2T)。按常规方法进行诱导表达，表达的目的蛋白命名为GST-CAB，载体表达的蛋白为GST。
1.7 JM105(pGEX/CAB)的发酵表达 把筛选到的高效表达目的蛋白GST-CAB的重组菌株JM105(pGEX/CAB)接种到TB培养基中，培养后转接到2 L的TB培养基中(5 L发酵罐)，通气速度6 L/min，搅拌速度380 r/min，于37℃发酵3.5 h时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，进行诱导，继续培养4.0 h后收菌，用于蛋白质的纯化。
1.8 GZ-CAB蛋白的纯化及复性 参照文献[5]进行。
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1.9 ELISA法分析融合抗原的免疫特异性 参照文献[5]进行。GST-CAB按1 μg/孔4℃包被过夜，一抗分别为HCV+/-血清、鼠抗GZ-PCX血清及鼠抗Pf血清，分别以1∶20、1∶2 000、1∶500稀释，二抗分别为HRP-兔抗人及兔抗鼠IgG。
1.10 小鼠免疫 ICR小鼠购自海军医学研究所实验动物中心，健康雌性4周龄小鼠，17～21 g，每组小鼠5只。把所纯化的蛋白质GST-CAB用适量的PBS溶解后，加等体积弗氏完全佐剂乳化完全，于小鼠尾部皮下多点注射免疫，每只免疫量为0.1 mg/次，分别于0、2、4 w时相同剂量各免疫10次。隔2 w采集血清10次。
1.11 免疫血清特异性抗体的检测 ELISA方法同上。同一份血清同时用GST-CAB及GZ-PCX蛋白包被后检测。
1.12 迟发性超敏反应(DTH) 于免疫后第8周，分别用GST-CAB及GZ-PCX抗原皮下注射小鼠后足趾，注射剂量为10 μg，观察注射部位的变化。
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1.13 CD4、CD8淋巴细胞亚群的检测 自小鼠眼球采血2～3滴，取20 μl抗凝血，加入20 μl抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15 min后加入200 μl细胞裂解液，5 min后加入1 ml PBS，3 000 r/min×2 min，沉淀用400 μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc.)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4/CD8比值。
1.14 免疫小鼠体重及肝脾重量变化 免疫后不同时间分别称取小鼠体重，至第12周处死小鼠，观察小鼠肝脾大小。
2 结果
2.1 pGEX/CAB的克隆 图1为获得的重组质粒pGEX/CAB的酶切PAGE电泳结果，重组正确。
2.2 CAB基因在JM105及DH5α中的表达 图2为GST-CAB基因在JM105中的表达情况，GST-CAB及GST分别为42、25 kU，前者比理论推算值(48 kU)略小，目的蛋白的表达量约20%。加入IPTG诱导后，4.0 h 目的蛋白GST-CAB的表达量最高。GST-CAB基因在DH5α中的表达水平与在JM105中的相似(图略)。
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图1 质粒pGEX/CAB酶切图(2% agarose)
Fig.1 Enzyme digestion of pGEX/CAB plasmid (2% agarose)
Note：1，2.pGEX/CAB BamH I/EcoR I；3.CAB PCR products；4.pGEM7zf(+) HaeⅢ
图2 GST-CAB基因在JM105中的表达(12% SDS-PAGE)
Fig.2 Expression of GST-CAB gene in JM105(12% SDS-PAGE)
Note：1.JM105；2.JM105(pGEX-2T) non-induced;3，4.JM105(pGEX-2T)induced；5.JM105(pGEX/CAB)non-induced；6，7.JM105(pGEX/CAB)induced;8.protein marker
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2.3 GST-CAB融合抗原的纯化 纯化结果见图3。用改良后的纯化包涵体及其溶解方法，测得包涵体溶解率约80%，GZ-CAB蛋白经计算机扫描纯度为92.6%。
图3 GST-CAB蛋白的纯化(12%SDS-PAGE)
Fig.3 Purification of GST-CAB protein (12% SDS-PAGE)
Note:1.protein marker；2.GST-CAB solubilized supernatant;3.dissolubilized inclusion body;4.washed supernatant of inclusion body
2.4 ELISA检测GZ-CAB抗原性结果 图4为GST-CAB融合蛋白分别与人HCV血清(H-HCV)、鼠抗Pf血清(M-Pf)及鼠抗GZ-PCX血清(M-GZ-PCX)阳性及阴性血清反应的结果，两者都存在显著性差异(P<0.001、<0.005及<0.01)，证实该融合蛋白具有良好的HCV及Pf的免疫特异性。
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图4 GST-CAB抗原与不同血清反应
Fig.4 GST-CAB antigen reacted with different sera
2.5 免疫血清的检测 免疫后小鼠可产生高滴度的抗GST-CAB IgG(最高达1∶105)，其抗体消长情况见图5。抗血清可以识别GZ-PCX中的HCV PCX抗原部分以及Pf抗原(图5，6)，与空白对照组相比，P<0.001，但后者滴度较低。
图5 GST-CAB蛋白免疫后抗体消长情况(Ab∶1∶1000稀释)
Fig.5 Antibody responses after immunization (Ab：1∶1 000 dilution)
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图6 抗GST-CAB IgG与不同抗原反应
Fig.6 Anti-GST-CAB IgG reacted with different antigens
2.6 DTH结果 GST-CAB疫苗免疫组小鼠足趾明显肿大，但针对GZ-PCX蛋白的DTH反应则稍弱(只有PCX抗原部分参与DTH反应，而前者则是整个GST-CAB抗原)，空白对照组则未见阳性反应。
2.7 CD4/CD8结果 CD4/CD8平均比值为3.27，而空白对照组为3.94，两者比较P>0.2，未见显著性差异。但CD8+T细胞在免疫后比例升高，提示CD8+T细胞在该抗原的免疫应答中可能起重要的作用。
2.8 安全性 免疫后小鼠体重未见明显下降，处死小鼠后发现脾脏肿大约1.5倍，而肝脏则未见明显变化。
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3 讨论
目前认为人工合成疫苗适合于所有疫苗的研究，是一种安全、价廉、多价、易于储存运输、具有极好的靶攻击特异性等优点，这都是传统疫苗所不能比及的。我们所设计的HCV-Pf复合多表位基因中含有多个高度保守的B/T细胞保护性表位，为诱发高效的免疫应答及可能产生的免疫保护力打下良好的基础。
目前重组蛋白的表达一般有融合蛋白和游离蛋白两种方式，虽然游离蛋白能更好地保持蛋白的天然状态，但融合蛋白表达系统相比起来有以下几个明显的优点：①融合蛋白的转录和翻译的起始均由正常的大肠杆菌调控基因和结构基因控制，可获得高产量的表达产物，有利于融合蛋白的纯化；②融合蛋白在宿主菌中不象外源蛋白那样容易被蛋白酶所降解，具有较好的稳定性；③融合蛋白具有较大的分子量，有助于提高分子量较小的外源蛋白的免疫原性，可以直接从电泳凝胶上割下融合蛋白条带磨碎后进行免疫。最常用的融合蛋白表达系统是把外源蛋白与β-半乳糖苷酶LacZ融合，由于β-半乳糖苷酶活性检测方法简便易行，有利于表达产物的检测。另有一种表达系统是外源蛋白与25 kU的GST融合，表达的融合蛋白用凝血酶原酶解，可获得游离目的蛋白，这在必须获得游离蛋白而外源蛋白分子量又较小以及直接表达游离蛋白困难较大的情况下更为有用。
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本研究把HCV-Pf双价基因与GST融合后，获得了高效表达，所表达的目的蛋白具有良好的免疫特异性，可被抗HCV Ab及抗Pf Ab特异识别。小鼠免疫后，可诱发高水平的抗体反应，最高滴度可达1∶105，且抗体的持久性较好。免疫血清要识别GST-PCX、GZ-PCX、Pf Ag，都显示该复合抗原作为HCV-Pf双价疫苗的可行性。我们正尝试用thrombin酶解GST-CAB蛋白，以期获得HCV-Pf游离蛋白，进一步研究其免疫特异性。
致谢：本研究得到第二军医大学张明薇老师，曹雪涛教授的帮助，在此表示谢意!
①本课题受国家自然科学基金资助(39780002)
②第一军医大学免疫学教研室，广州510515
作者简介：黄建生，男，29岁，博士生，主要从事基因工程疫苗及基因工程抗体研究
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4 参考文献
1 陈素良，张志坤，赵 勇 et al. 单采血浆还输血细胞引起疟疾和丙型肝炎的流行病学研究.中国公共卫生，1995；11(1)：1
2 钱 朴，吴定芬.输血后疟疾的预防措施及与丙肝抗体检测关系之探讨.中级医刊，1996；31(5)：24
3 王昌才，钟雄林，陈仕荣 et al. 恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究.上海免疫学杂志，1997；17(3)：139
4 黄建生，解咏梅，沈先荣 et al. HCV多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998；37(4)：551
5 Huang J S, Wang C C, Ren D M et al. Immunogenicity of recombinant attenuated salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of plasmodium falciparum. J Med Col PLA, 1997;12(2):166
〔收稿1998-09-21 修回1998-10-15〕, 百拇医药