RP-HPLC法测定不同采收期黄花乌头中附甲素的含量
作者：冯 锋* 黄 剑 刘静涵
单位：中国药科大学天然药物化学教研室 南京210009
关键词：黄花乌头；关附甲素；RP-HPLC；含量测定
中草药990709 摘 要 采用RP-HPLC方法对黄花乌头Aconitum coreanum抗心律失常有效成分关附甲素(guanfu base A)的含量进行了测定。并对不同采收期黄花乌头的不同部位中关附甲素的含量进行比较，结果显示关附甲素在8月份采收的根中含量最高。实验采用C18柱，以乙腈-磷酸三乙胺缓冲液为流动相，检测波长208 nm，以外标法定量，为合理有效地利用药物资源提供了参考。
Assay of Guanfu Base A in Korean Monkshood (Aconitum coreanum)
, http://www.100md.com
at Different Stages of Reaping by RP-HPLC
Feng Feng, Huang Jian and Liu Jinghan (Department of Phytochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)
Abstract A method for the determination of guanfu base A, the active anti-arrhythmic principle in Aconitum coreanum (.) Raipaics by RP-HPLC was reported. Results showed that its content was higher in the root collected in August. A good seperation and quantitative determination method was accomplished on an ODS column with UV detector at 208 nm. CH3CN/H2O-H3PO4-NEt3 (2∶8 v/v, pH 3.04) was used as the mobile phase.
, 百拇医药
Key words Acontium coreanum (.) Raipaics guanfu base A RP-HPLC
关白附子为毛茛科乌头属植物黄花乌头Aconitum coreanum(Levl.) Rapaics的块根，具有祛风、燥湿、化痰、止痛的功效，主治中风痰壅、口眼歪斜、头痛、癫痫、风寒湿痹等，为中医临床常用中药之一[1，2]。据文献报道，已从关白附子中得到了十几种生物碱，且大多数具有较显著的生理活性[1]。药理研究表明，其主要成分关附甲素、关附庚素、关附壬素具有抗心律失常、抗炎、镇痛作用[1]，其中盐酸关附甲素注射液由中国药科大学申报国家一类新药，现已进入一期临床研究末期，有望成为一个疗效显著的新型抗心律失常药。本实验应用RP-HPLC法测定关附甲素的含量，具有分离度好、准确、快速等优点，并根据不同采收期黄花乌头的不同器官中该生物碱含量，提出黄花乌头的最佳药用部位及最佳采收期，为有效合理地利用生药资源提供了参考。
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1 仪器与药品
1.1 仪器：岛津LC-10AT高效液相色谱仪，岛津SPD-10AV型紫外-可见光检测器，WDL-95色谱工作站(中科院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心)，CQ250型超声清洗器，pHS-25型数显酸度计。
1.2 药品：对照品：关附甲素由植化教研室刘静涵教授提供；供试品：共11种，由沈阳药材公司宁绍智提供。
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醚、浓氨水、三乙胺、磷酸均为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件：色谱柱：Alltech alltima C18 5 μ 150 mm×4.6 mm色谱柱和Alltechpellicular C18 refill 3 grs预柱。
, 百拇医药
流动相：乙腈-磷酸三乙胺缓冲液(pH 3.04)(2∶8)，流速1.0 mL/min。
检测波长与灵敏度：检测波长208 nm，AUFS=0.05。
2.2 样品溶液的制备：取生药粉末约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加10%氨溶液0.5 mL及乙醚15 mL，冷浸40 h，滤过。残渣用乙醚洗涤3次，每次5 mL，合并醚液，挥干。残渣加少量甲醇溶解，移入2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。
2.3 标准曲线的制备：精密称定关附甲素对照品约10 mg，甲醇定容至10 mL，制成浓度约为1.0 mg/mL的关附甲素对照品溶液。分别量取该对照液2.0、1.0、0.8、0.5、0.3 mL，甲醇定容至2.0 mL容量瓶，得系列关附甲素对照品溶液。在选定的色谱条件下各进样10 μL，测定峰面积，以平均峰面积A对进样量W(μ g)计算回归方程：
, 百拇医药
A=1.5415+1.6380×104W (n=5,r=0.9998)，线性范围：1.55～10.3 μg。
2.4 精密度试验
2.4.1 进样精密度试验：取浓度约为1.0 mg/mL对照液10 μL，连续进样5次，RSD=2.9%。
2.4.2 方法精密度试验：平行称取同种药材(1997-8-24采集根)3份，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，RSD=0.9%。
2.5 稳定性试验：将关附甲素对照液放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，按上述色谱条件进行测定，其峰面积的RSD=3.3%，表明关附甲素甲醇溶液在3 h内稳定。
2.6 回收率试验：精密称取2份1997年采老根样品各2 g，分别加入浓度为0.992 mg/mL的关附甲素对照液1 mL和0.5 mL，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，结果回收率为92.1%、97.2%。
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2.7 样品关附甲素含量测定：分取供试品溶液进样，依法测定，按标准曲线计算含量。结果见表1。
表1 不同采收期黄花乌头不同部位的关附甲素含量 供试品编号
采集部位
采集时间
甲素含量(%)
1
小枝
1997-08-24
0.2088
2
主干
, 百拇医药
1997-08-24
0.1360
3
花
1997-08-24
0.1999
4
根
1997-08-24
1.1580
5
地上茎
1997-10
, http://www.100md.com
0.1352
6
根
1997-10
0.4480
7
地上茎
1997-11
0.1053
8
根
1997-11
0.08009
, 百拇医药
9
老根
1997
0.07354
10
根
1997-08-30
1.072
11
根
1997-07-25
0.9166
3 结论与讨论
, 百拇医药
由本实验的数据结果可知，不同采收期黄花乌头的不同部位中关附甲素的含量有显著差异，其中根中含量最高，尤以8月份采集的根中含量最高。因此建议黄花乌头的最佳采集部位是根，最佳采集期为8月份。
在实验过程中，注意到关附甲素在甲醇中长时间放置不稳定，易分解成为胺醇。因而在实验过程中尽量缩短样品在甲醇中的时间，对照品溶液最好现配现用，以保证实验结果的准确性。
参考文献
1 刘静涵，等.中草药，1981，12(3)：1
2 孙友富，等.中国中药杂志，1991，16(12)：738
收稿日期：1998-09-21, 百拇医药(作者：冯 锋* 黄 剑 刘静涵)
单位：中国药科大学天然药物化学教研室 南京210009
关键词：黄花乌头；关附甲素；RP-HPLC；含量测定
中草药990709 摘 要 采用RP-HPLC方法对黄花乌头Aconitum coreanum抗心律失常有效成分关附甲素(guanfu base A)的含量进行了测定。并对不同采收期黄花乌头的不同部位中关附甲素的含量进行比较，结果显示关附甲素在8月份采收的根中含量最高。实验采用C18柱，以乙腈-磷酸三乙胺缓冲液为流动相，检测波长208 nm，以外标法定量，为合理有效地利用药物资源提供了参考。
Assay of Guanfu Base A in Korean Monkshood (Aconitum coreanum)
, http://www.100md.com
at Different Stages of Reaping by RP-HPLC
Feng Feng, Huang Jian and Liu Jinghan (Department of Phytochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)
Abstract A method for the determination of guanfu base A, the active anti-arrhythmic principle in Aconitum coreanum (.) Raipaics by RP-HPLC was reported. Results showed that its content was higher in the root collected in August. A good seperation and quantitative determination method was accomplished on an ODS column with UV detector at 208 nm. CH3CN/H2O-H3PO4-NEt3 (2∶8 v/v, pH 3.04) was used as the mobile phase.
, 百拇医药
Key words Acontium coreanum (.) Raipaics guanfu base A RP-HPLC
关白附子为毛茛科乌头属植物黄花乌头Aconitum coreanum(Levl.) Rapaics的块根，具有祛风、燥湿、化痰、止痛的功效，主治中风痰壅、口眼歪斜、头痛、癫痫、风寒湿痹等，为中医临床常用中药之一[1，2]。据文献报道，已从关白附子中得到了十几种生物碱，且大多数具有较显著的生理活性[1]。药理研究表明，其主要成分关附甲素、关附庚素、关附壬素具有抗心律失常、抗炎、镇痛作用[1]，其中盐酸关附甲素注射液由中国药科大学申报国家一类新药，现已进入一期临床研究末期，有望成为一个疗效显著的新型抗心律失常药。本实验应用RP-HPLC法测定关附甲素的含量，具有分离度好、准确、快速等优点，并根据不同采收期黄花乌头的不同器官中该生物碱含量，提出黄花乌头的最佳药用部位及最佳采收期，为有效合理地利用生药资源提供了参考。
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1 仪器与药品
1.1 仪器：岛津LC-10AT高效液相色谱仪，岛津SPD-10AV型紫外-可见光检测器，WDL-95色谱工作站(中科院大连化学物理研究所，国家色谱研究分析中心)，CQ250型超声清洗器，pHS-25型数显酸度计。
1.2 药品：对照品：关附甲素由植化教研室刘静涵教授提供；供试品：共11种，由沈阳药材公司宁绍智提供。
试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，无水乙醚、浓氨水、三乙胺、磷酸均为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件：色谱柱：Alltech alltima C18 5 μ 150 mm×4.6 mm色谱柱和Alltechpellicular C18 refill 3 grs预柱。
, 百拇医药
流动相：乙腈-磷酸三乙胺缓冲液(pH 3.04)(2∶8)，流速1.0 mL/min。
检测波长与灵敏度：检测波长208 nm，AUFS=0.05。
2.2 样品溶液的制备：取生药粉末约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加10%氨溶液0.5 mL及乙醚15 mL，冷浸40 h，滤过。残渣用乙醚洗涤3次，每次5 mL，合并醚液，挥干。残渣加少量甲醇溶解，移入2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。
2.3 标准曲线的制备：精密称定关附甲素对照品约10 mg，甲醇定容至10 mL，制成浓度约为1.0 mg/mL的关附甲素对照品溶液。分别量取该对照液2.0、1.0、0.8、0.5、0.3 mL，甲醇定容至2.0 mL容量瓶，得系列关附甲素对照品溶液。在选定的色谱条件下各进样10 μL，测定峰面积，以平均峰面积A对进样量W(μ g)计算回归方程：
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A=1.5415+1.6380×104W (n=5,r=0.9998)，线性范围：1.55～10.3 μg。
2.4 精密度试验
2.4.1 进样精密度试验：取浓度约为1.0 mg/mL对照液10 μL，连续进样5次，RSD=2.9%。
2.4.2 方法精密度试验：平行称取同种药材(1997-8-24采集根)3份，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，RSD=0.9%。
2.5 稳定性试验：将关附甲素对照液放置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，按上述色谱条件进行测定，其峰面积的RSD=3.3%，表明关附甲素甲醇溶液在3 h内稳定。
2.6 回收率试验：精密称取2份1997年采老根样品各2 g，分别加入浓度为0.992 mg/mL的关附甲素对照液1 mL和0.5 mL，依“供试品制备”项下方法制备溶液，在上述色谱条件下测定含量，结果回收率为92.1%、97.2%。
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2.7 样品关附甲素含量测定：分取供试品溶液进样，依法测定，按标准曲线计算含量。结果见表1。
表1 不同采收期黄花乌头不同部位的关附甲素含量 供试品编号
采集部位
采集时间
甲素含量(%)
1
小枝
1997-08-24
0.2088
2
主干
, 百拇医药
1997-08-24
0.1360
3
花
1997-08-24
0.1999
4
根
1997-08-24
1.1580
5
地上茎
1997-10
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0.1352
6
根
1997-10
0.4480
7
地上茎
1997-11
0.1053
8
根
1997-11
0.08009
, 百拇医药
9
老根
1997
0.07354
10
根
1997-08-30
1.072
11
根
1997-07-25
0.9166
3 结论与讨论
, 百拇医药
由本实验的数据结果可知，不同采收期黄花乌头的不同部位中关附甲素的含量有显著差异，其中根中含量最高，尤以8月份采集的根中含量最高。因此建议黄花乌头的最佳采集部位是根，最佳采集期为8月份。
在实验过程中，注意到关附甲素在甲醇中长时间放置不稳定，易分解成为胺醇。因而在实验过程中尽量缩短样品在甲醇中的时间，对照品溶液最好现配现用，以保证实验结果的准确性。
参考文献
1 刘静涵，等.中草药，1981，12(3)：1
2 孙友富，等.中国中药杂志，1991，16(12)：738
收稿日期：1998-09-21, 百拇医药(作者：冯 锋* 黄 剑 刘静涵)