中国河南林州市食管鳞状细胞癌组织中Ras蛋白的表达
作者：李 健 赵治国 冯常炜 周 琦 王立东
单位：李 健 赵治国 冯常炜 河南医科大学 1第二附属医院消化科； 周 琦 王立东 癌症研究室 河南省郑州市 450003
关键词：食管肿瘤；癌，鳞状细胞；癌基因ras
世界华人消化杂志990835
中国图书馆分类号 R735.102
Subject headings esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; oncogene ras
癌基因ras蛋白在细胞的生长和分化中起重要的作用，其编码的蛋白分子量约为Mr 21000，称P21蛋白，P21蛋白位于细胞浆膜内面. 具有与鸟苷酸结合的能力和GTP酶的活性，参与膜的信号传递[1]. 癌基因ras突变，特别是第12，13和61密码子部位的点突变可使细胞发生恶性转化[2]. 消化道肿瘤，尤其是结肠癌，有较高的ras基因突变发生率[1，2]，但是有关食管癌和ras基因变化的关系的研究报道不尽一致[3，4]. 我们通过对我国食管癌高发区食管癌组织中癌基因ras蛋白的研究，进一步了解不同地区食管癌发生和发展的分子学基础，加深对食管癌变机制的认识.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 食管癌患者36例来自中国食管癌高发区河南林州市人民医院. 所有患者术前未经化疗和放疗，手术切除组织经850mL/L酒精固定，常规组织学脱水，石蜡包埋和切片. 切片用于病理学诊断和免疫组化测定.
1.2 方法 采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法. 所用材料有：鼠单克隆抗人Ras蛋白抗体Pan-ras (Ab-3)，20g/L小牛冻干血清蛋白(BSA)，ABC试剂盒和DAB底物试剂盒分别为美国Oncogene公司，Sigma公司及Vector公司提供. 主要步骤如下：切片脱蜡至水，1mL/L H2O2室温孵育20min；正常马血清(1∶50)室温孵育20min封闭非特异性免疫球蛋白反应；20g/L BSA稀释Ⅰ抗 ras 1∶100，4℃孵育12h；2% BSA稀释生物素标记的Ⅱ抗1∶200，室温孵育45min；再用新鲜配制的ABC室温下孵育60min；二氨基联苯胺(DAB)和3mL/L H2O2混合孵育5min～10min，显微镜下观察. 采用生产第二抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应与省略孵育第一抗体作为阴性对照.
, 百拇医药
2 结果
2.1 结果判定 Ras蛋白染色呈棕黄色颗粒状分布于食管上皮胞质中，以胞质为主. 免疫组化阳性标准参考以往的文献报道[5].
2.2 食管鳞癌组织中Ras蛋白表达 在36例食管癌手术切除标本中，有9例出现免疫阳性反应，其阳性反应率为25%，同时还发现同一食管癌组织中食管粘膜固有腺体上皮也出现免疫阳性反应，其表达强度高于鳞癌组织.
3 讨论
对中国河南食管癌高发区居民食管鳞癌组织中癌基因ras蛋白变化的研究表明，在36例食管癌手术切除标本中，有9例出现免疫阳性反应，其免疫阳性反应率为25%，同时还发现同一食管癌组织中食管粘膜固有腺体上皮也出现免疫阳性反应，其表达强度高于鳞状上皮. 上述结果提示尽管食管癌终末阶段发生Ras蛋白表达变化，但是在食管鳞状上皮的癌变过程中，ras癌基因可能不是癌变的重要分子学变化，癌基因ras蛋白表达是食管癌变晚期阶段的一个分子学变化.
, 百拇医药
癌基因ras在消化道肿瘤发生突变的频率较高，特别是肠道肿瘤，其突变发生率为40%，癌基因ras突变在结肠癌变过程中起重要作用的观点已被大多数学者所共识[1，2]. 然而，食管癌中癌基因ras的研究结果却不尽一致[3，4]. Hollstein et al[6]研究表明，在与烟草等危险因素有相关性的法国和乌拉圭食管癌高发区中，食管癌组织中肿瘤抑制基因p53存在着G→T的颠换，而未见癌基因ras的突变；在亚硝酸盐和霉菌毒素为主要危险因素的食管癌高发区，如中国一些地区[7]和南非[8]，应用PCR序列分析技术未发现癌基因ras突变的证据. 值得指出的是，在利用甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱导的大鼠食管癌变的动物实验中却发生较稳定的第12密码子的ras基因突变[9]，这可能是人体和动物实验分子学研究结果明显不一致的原因. 另一个重要现象是，来自法国[10]和加拿大[11]的研究表明，食管癌组织中癌基因ras的扩增率分别为14%(7/51)和40%(4/10)，而Roul et al[12]研究发现，在意大利和美国食管鳞癌组织中，Ras蛋白的阳性表达率为88.5%(46/52). 而王立东等以往的研究结果表明[13]，在食管癌前病变阶段未见ras蛋白的阳性表达. ras基因在不同地区人群食管癌发生和发展的作用的研究结果的不尽一致，可能提示环境因素在食管癌变中的重要作用；很显然，比较研究这些来自不同地区人群同一肿瘤发生的分子学基础的变化，对揭示其癌变机制并为加深了解其密切相关的病因学都具有重要意义.
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国家自然科学基金资助课题,No.39840012
通讯作者 李健
4 参考文献
1 Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res, 1989;49:4682-4689
2 Barbacid M. ras oncogenes: their role in neoplasia. Eur J Clin Invest, 1990;20:225-230
3 李健，牛正先，王立东. 食管癌分子生物学的研究. 新消化病学杂志，1997；3：189-191
4 王立东. 食管癌的分子生物学. 见：王立东主编. 食管癌分子病理学进展. 郑州：河南科学技术出版社，1994：41-88
, http://www.100md.com
5 Wang LD. Shi ST. Zhou Q, Goldstein S, Hong JY, Shao P. Chang Y. Changes in p53 and Cyclin D1 protein expression and cell proliferation in different stages of human esophageal and gastric cardia carcinogenesis. Int J Cancer, 1994;59:514-519
6 Hollstein MC, Peri L. Mandard AM, Welsh JA, Montesan R, Metcalf RA, Yang P. Genetic analysis of human esophageal tumors from two high incidence geographic areas: frequent p53 base substitutions and absence of ras mutations. Cancer Res, 1991;51:4102-4106
, http://www.100md.com
7 Jiang W, Kahn SM, Guillem JG, Lu SH, Weinstein IB. Rapid detection of ras oncogenes in human tumors: applications to colon, esophageal, and gastric cancer. Oncogene 1989;4:923-928
8 Victor T, Toit RD, Jordan AM, Bester AJ, van Helden PD. No evidence for point mutation in codons 12,13, and 61 of the ras gene in a high incidence area for esophageaal and gastric cancers. Cancer Res, 1990;50:4911-4914
9 Wang Y, You M, Reynolds SH, Stoner GD, Anderson MW. Mutational activation of the cellular Harvey ras oncogene in rat esophageal papillomas induced by methylbenzyinitrosamine. Cancer Res, 1990;50:1591-1595
, 百拇医药
10 Galiana C, Fusco A, Yamasaki H. Roles of ras mutations and amplification in human esophageal carcinogenesis. Pro Am Asso Cancer Res, 1992;33:124
11 Sorsdahl K, Casson AG, Troster M, Meyel DV, Inculet R, Chambers AF. p53 and ras gene expression in human esophageal cancer and Barrett＇s epithelium: a prospective study. Cancer Dete and Prev, 1994;18:179-185
12 Roul A, Stephens JK, Michelassi F, Segalin A, Chiarelli S, Peracchia A. Expression of ras oncogenes p21 protein in esophageal squamous cell carcinoma. J Surg Onol, 1990;44:142-145
13 王立东，周琦，王耀红，裘宋良. 食管癌高发区人群食管癌前病变癌基因EGFR、C-jun和Ras蛋白表达的研究. 河南医科大学学报，1995；30：143-145ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):715
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, http://www.100md.com
单位：李 健 赵治国 冯常炜 河南医科大学 1第二附属医院消化科； 周 琦 王立东 癌症研究室 河南省郑州市 450003
关键词：食管肿瘤；癌，鳞状细胞；癌基因ras
世界华人消化杂志990835
中国图书馆分类号 R735.102
Subject headings esophageal neoplasms; carcinoma, squamous cell; oncogene ras
癌基因ras蛋白在细胞的生长和分化中起重要的作用，其编码的蛋白分子量约为Mr 21000，称P21蛋白，P21蛋白位于细胞浆膜内面. 具有与鸟苷酸结合的能力和GTP酶的活性，参与膜的信号传递[1]. 癌基因ras突变，特别是第12，13和61密码子部位的点突变可使细胞发生恶性转化[2]. 消化道肿瘤，尤其是结肠癌，有较高的ras基因突变发生率[1，2]，但是有关食管癌和ras基因变化的关系的研究报道不尽一致[3，4]. 我们通过对我国食管癌高发区食管癌组织中癌基因ras蛋白的研究，进一步了解不同地区食管癌发生和发展的分子学基础，加深对食管癌变机制的认识.
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1 材料和方法
1.1 材料 食管癌患者36例来自中国食管癌高发区河南林州市人民医院. 所有患者术前未经化疗和放疗，手术切除组织经850mL/L酒精固定，常规组织学脱水，石蜡包埋和切片. 切片用于病理学诊断和免疫组化测定.
1.2 方法 采用卵白素-生物素-辣根过氧化氢酶复合物(ABC)法. 所用材料有：鼠单克隆抗人Ras蛋白抗体Pan-ras (Ab-3)，20g/L小牛冻干血清蛋白(BSA)，ABC试剂盒和DAB底物试剂盒分别为美国Oncogene公司，Sigma公司及Vector公司提供. 主要步骤如下：切片脱蜡至水，1mL/L H2O2室温孵育20min；正常马血清(1∶50)室温孵育20min封闭非特异性免疫球蛋白反应；20g/L BSA稀释Ⅰ抗 ras 1∶100，4℃孵育12h；2% BSA稀释生物素标记的Ⅱ抗1∶200，室温孵育45min；再用新鲜配制的ABC室温下孵育60min；二氨基联苯胺(DAB)和3mL/L H2O2混合孵育5min～10min，显微镜下观察. 采用生产第二抗体的正常动物血清封闭非特异性免疫球蛋白反应与省略孵育第一抗体作为阴性对照.
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2 结果
2.1 结果判定 Ras蛋白染色呈棕黄色颗粒状分布于食管上皮胞质中，以胞质为主. 免疫组化阳性标准参考以往的文献报道[5].
2.2 食管鳞癌组织中Ras蛋白表达 在36例食管癌手术切除标本中，有9例出现免疫阳性反应，其阳性反应率为25%，同时还发现同一食管癌组织中食管粘膜固有腺体上皮也出现免疫阳性反应，其表达强度高于鳞癌组织.
3 讨论
对中国河南食管癌高发区居民食管鳞癌组织中癌基因ras蛋白变化的研究表明，在36例食管癌手术切除标本中，有9例出现免疫阳性反应，其免疫阳性反应率为25%，同时还发现同一食管癌组织中食管粘膜固有腺体上皮也出现免疫阳性反应，其表达强度高于鳞状上皮. 上述结果提示尽管食管癌终末阶段发生Ras蛋白表达变化，但是在食管鳞状上皮的癌变过程中，ras癌基因可能不是癌变的重要分子学变化，癌基因ras蛋白表达是食管癌变晚期阶段的一个分子学变化.
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癌基因ras在消化道肿瘤发生突变的频率较高，特别是肠道肿瘤，其突变发生率为40%，癌基因ras突变在结肠癌变过程中起重要作用的观点已被大多数学者所共识[1，2]. 然而，食管癌中癌基因ras的研究结果却不尽一致[3，4]. Hollstein et al[6]研究表明，在与烟草等危险因素有相关性的法国和乌拉圭食管癌高发区中，食管癌组织中肿瘤抑制基因p53存在着G→T的颠换，而未见癌基因ras的突变；在亚硝酸盐和霉菌毒素为主要危险因素的食管癌高发区，如中国一些地区[7]和南非[8]，应用PCR序列分析技术未发现癌基因ras突变的证据. 值得指出的是，在利用甲基苄基亚硝胺(MBNA)诱导的大鼠食管癌变的动物实验中却发生较稳定的第12密码子的ras基因突变[9]，这可能是人体和动物实验分子学研究结果明显不一致的原因. 另一个重要现象是，来自法国[10]和加拿大[11]的研究表明，食管癌组织中癌基因ras的扩增率分别为14%(7/51)和40%(4/10)，而Roul et al[12]研究发现，在意大利和美国食管鳞癌组织中，Ras蛋白的阳性表达率为88.5%(46/52). 而王立东等以往的研究结果表明[13]，在食管癌前病变阶段未见ras蛋白的阳性表达. ras基因在不同地区人群食管癌发生和发展的作用的研究结果的不尽一致，可能提示环境因素在食管癌变中的重要作用；很显然，比较研究这些来自不同地区人群同一肿瘤发生的分子学基础的变化，对揭示其癌变机制并为加深了解其密切相关的病因学都具有重要意义.
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国家自然科学基金资助课题,No.39840012
通讯作者 李健
4 参考文献
1 Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res, 1989;49:4682-4689
2 Barbacid M. ras oncogenes: their role in neoplasia. Eur J Clin Invest, 1990;20:225-230
3 李健，牛正先，王立东. 食管癌分子生物学的研究. 新消化病学杂志，1997；3：189-191
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6 Hollstein MC, Peri L. Mandard AM, Welsh JA, Montesan R, Metcalf RA, Yang P. Genetic analysis of human esophageal tumors from two high incidence geographic areas: frequent p53 base substitutions and absence of ras mutations. Cancer Res, 1991;51:4102-4106
, http://www.100md.com
7 Jiang W, Kahn SM, Guillem JG, Lu SH, Weinstein IB. Rapid detection of ras oncogenes in human tumors: applications to colon, esophageal, and gastric cancer. Oncogene 1989;4:923-928
8 Victor T, Toit RD, Jordan AM, Bester AJ, van Helden PD. No evidence for point mutation in codons 12,13, and 61 of the ras gene in a high incidence area for esophageaal and gastric cancers. Cancer Res, 1990;50:4911-4914
9 Wang Y, You M, Reynolds SH, Stoner GD, Anderson MW. Mutational activation of the cellular Harvey ras oncogene in rat esophageal papillomas induced by methylbenzyinitrosamine. Cancer Res, 1990;50:1591-1595
, 百拇医药
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11 Sorsdahl K, Casson AG, Troster M, Meyel DV, Inculet R, Chambers AF. p53 and ras gene expression in human esophageal cancer and Barrett＇s epithelium: a prospective study. Cancer Dete and Prev, 1994;18:179-185
12 Roul A, Stephens JK, Michelassi F, Segalin A, Chiarelli S, Peracchia A. Expression of ras oncogenes p21 protein in esophageal squamous cell carcinoma. J Surg Onol, 1990;44:142-145
13 王立东，周琦，王耀红，裘宋良. 食管癌高发区人群食管癌前病变癌基因EGFR、C-jun和Ras蛋白表达的研究. 河南医科大学学报，1995；30：143-145ISSN 1007-9319 CN 14-1218/R 世界华人消化杂志，1999;7(8):715
收稿日期 1999-04-08 修回日期 1999-06-03, http://www.100md.com