低剂量辐射对淋巴细胞肿瘤杀伤活性的影响
作者：田海林 苏燎原 杜泽吉 邹华伟 王爱青
单位：田海林 苏州医学院环境卫生学教研室； 苏燎原 杜泽吉 放射生物学教研室； 邹华伟 附属一院放疗科，王爱青33核医学重点实验室，苏州，215007
关键词：低剂量辐射；淋巴细胞亚群；兴奋效应；NK活性
苏州医学院学报990906 摘要 应用单克隆抗体铺皿法，从人外周血中分离出CD4，CD8，CD19(B)和CD57(NK)4种淋巴细胞亚群，观察了各亚群细胞的肿瘤杀伤活性和相互调节以及小剂量辐射对CD57细胞功能和亚群间调节的影响。结果发现，以上4种淋巴细胞亚群均具有肿瘤杀伤活性，其中以CD57细胞的杀伤活性最强。CD4和CD57细胞混合培养后的总NK活性超过两者之和，而CD8，CD19分别与CD57细胞混合培养后，总NK活性与两者单独培养之和相比无显著性差异。50cGy和80cGy的r线照射可使CD57细胞的功能增强。照射CD4或CD57细胞后两者混合培养的总NK活性比未受照的混合培养组显著升高。而CD8或CD19分别与CD57混合培养则无此现象。结果表明小剂量辐射可增强CD4和CD57细胞间的协同作用。外周血NK细胞受到多种亚群细胞的影响，外周血NK活性反映了多种细胞自然杀伤活性的总和。
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中图法分类 R811.5
Effects of Low Dose Radiation on Regulatory Function Between Lymphocyte Subsets
Tian Hailin,Shu Liaoyuan,Du Zhejie,et al
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Four kinds of McAbs were used to separate CD4,CD8,CD19 and CD57 cells from human peripheral blood by “Panning-direct” method.First the nature killing activity of each subsets and the regulatory functions between CD57 and other subsets were studied.Then the effects of low dose radiation on the function of CD57 cells and the regulatory functions between CD57 and other subsets were studied.The results showed that the NK activity was found in all of the four subsets and CD57 cell had the strongest activity.When CD4 and CD57 cells were cocultrued,the total NK activity was higher than that of the sum of these two single subsets,i.e.there was synergistic effects between CD4 and CD57 cells.When CD8 or CD19 cells were co-cultured separately with CD57 cells,no synergistic effect was observed.Irradiation by gamma rays at dose of 50 cGy and 80 cGy was able to stimulate the function of CD57 cells.After CD4 or CD57 cells were irradiated,the total NK activity of their co-culture increased significantly.This phenomenon was not found in the other subsets.This suggests that low dose radiation can enhance the synergistic action between CD4 and CD57 cells.So at least four subsets contribute to the total NK activity of peripheral blood mononuclear cells.
, 百拇医药
Key words low dose radiation;lymphocyte subset;hormesis;NK activity
近年来低剂量辐射生物效应的研究日益受到重视，国内外许多学者报道低剂量辐射对淋巴细胞的功能具有刺激作用[1～3]。T、B淋巴细胞及NK细胞是机体重要的免疫活性细胞，共同承担机体特异和非特异、体液和细胞免疫功能。我们以前的工作表明[4]，低剂量辐射可以增强人外周血淋巴细胞NK活性。本文在此基础上进一步应用单克隆抗体分离各主要淋巴细胞亚群，探讨CD4，CD8，CD19三种亚群细胞对CD57细胞的调节作用。并以对肿瘤细胞的杀伤活性的指标，观察了低剂量辐射对CD57细胞功能的影响以及三种亚群细胞和CD57细胞间相互调节的影响，拟从淋巴细胞亚群的角度对低剂量辐射增强NK活性的机制作初步探索。
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1 材料和方法
1.1 单克隆抗体分离CD4，CD8，B(CD19)及NK细胞：健康献血员外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海荣盛生物试剂厂)分离出单个核细胞(MNC)，以HBSS液洗三次，最后用RPMI1640培养液稀释成(0.5～1)×107/ml的细胞悬液，加到无菌培养皿(corning,USA)中，每皿加细胞悬液3～5ml,37℃静置90min。然后吸取非贴壁细胞，再用HBSS液洗二次，即为去单核的单个核细胞，备用。贴壁细胞为单核细胞，收集后供亚群培养时用。分别加200μl McAb CD4, 100μl McAb CD8,100μl McAb CD19和100μl McAb CD57于培养皿中，立即加3ml 0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液(pH9.5)，轻轻摇匀后置4℃冰箱60min。吸弃上清，用0.01mol/L PBS液(pH7.2)洗三次，再用含1%小牛血清的0.01mol/L PBS洗一次，并静置10min，封闭皿内剩余结合位点，最后用0.01mol/L PBS洗一次，4℃放置备用。按Wysocki等人建立的Panning法[5]——直接法，分离各亚群细胞。将去单核的单个核细胞悬液分成四份，分别加到包被好McAb的培养皿中，每皿所加细胞数为(2×3)×107个，用0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释到3ml，摇匀后在4℃下放置60min，其间每15min轻摇一次。吸弃非粘附细胞，用HBSS液清洗2次。最后加入1640培养液，用滴管用力吹打，洗脱全部粘附细胞并收集，再洗细胞2次，所得细胞分别为CD4，CD8，CD19和CD57细胞。
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1.2 CD4，CD8，CD19和CD57细胞的纯度，存活率及产额的测定：采用间接免疫荧光试验[6]和台盼蓝拒染法分别鉴定所分离细胞的纯度和存活率。细胞产额为所分离的CD4、CD8、CD19和CD57细胞占淋巴细胞总量的百分数。
1.3 照射条件：将镭-226γ源，固定于培养箱底部，在培养箱内搁置三夹板，照射时将样品置于三夹板上，剂量率为1.30cGy/h,源距25cm。
1.4 靶细胞：人红白血病K562细胞，使用时取对数生长期的K562细胞3ml，加入3H-TdR 1.2×104Bq,37℃培养6h，PBS液洗3次，然后用RPMI 1640培养液配成1×106个/ml细胞悬液，备用。
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1.5 小剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响：将按上法获得的CD57(NK)细胞加到培养瓶中，5×105个/瓶，再加入含10%AB血清的1640液3ml，置37℃培养箱内照射。照射结束后每瓶加入标记好的靶细胞1×105个，效：靶为5∶1，同时设单纯靶细胞组及未受照对照组。在37℃培养16h后每瓶以终浓度为0.15%胰酶和0.0125%DNA酶处理30min，按常规方法收获细胞，Beckman液体闪烁计数仪测每分钟放射性计数(CPM)，按下式计算NK相对活性：
1.6 各亚群的肿瘤杀伤活性及相互调节作用：每个培养瓶内加入靶细胞1×105个，将按上法获得的CD4，CD8，CD19和CD57细胞分别加到培养瓶中，5×105个/瓶。观察亚群间调节作用时，所加每一种亚群细胞数减半，两种亚群相加后效应细胞总数仍为5×105个/瓶，靶细胞为1×105个/瓶，同时设单纯靶细胞组。按上法培养及收获细胞，并测CPM值，按下式计算肿瘤细胞杀伤活性(NK活性)：NK活性(CPM/5×105 cells)=单纯靶细胞组CPM-实验组CPM，本式得到的差值即表示各亚群细胞破坏肿瘤细胞所释放的CPM值，该值越大，说明对肿瘤杀伤活性越强，反之则越弱。
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1.7 低剂量辐射对亚群细胞间调节的影响：按上法将CD4，CD8，CD19细胞分别与CD57细胞混合培养，每瓶所加细胞数及效：靶比同前，按下列组合方式分组：CDX-CD57，CDX-CD57(r),CDX(r)-CD57，上式中x取值分别为4，8，19，“r”表示辐照。据文献报道[7]，人外周血淋巴细胞受到50cGy照射后，NK活性增强最明显，所以将CD57细胞的照射剂量定为50cGy，其余各亚群细胞的受照剂量均为10cGy,按下式计算各混合培养组的NK活性：NK活性(CPM/5×105 cells)=单纯靶细胞组CPM-实验组CPM，各照射组分别以相应未照射组为对照，作统计分析。
1.8 数据处理：数据经平方根转换或arcSin
转换后再作t检验或F检验。
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2 结果
2.1 单克隆抗体分离各淋巴细胞亚群的纯度、存活率和产额：用Panning直接法分离出CD4，CD8，CD19和CD57细胞，其纯度和存活率较高，产额略偏低(表1)，结果与文献报道相近[8]，说明按此法分离到的淋巴细胞亚群可满足实验要求。
表1 单抗分离淋巴细胞亚群的纯度，存活率和产额(%，
±s) 指标
CD4
CD8
CD19(B)
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CD57(NK)
纯度
89.3±3.5
91.3±1.5
91.5±1.1
90.5±3.4
存活率
96.0±1.9
95.8±1.5
96.0±2.4
95.3±1.5
产额
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26.5±4.4
18.7±2.3
16.3±1.9
14.8±2.4
n=4
2.2 低剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响：分离出的CD57细胞经低剂量r线照射后再与靶细胞混合培养，以未受照组为对照，计算NK活性(表2)。在30cGy剂量以下的r线照射，对CD57细胞的NK活性没有明显的影响，当受照剂量为50和80cGy时，NK活性显著升高。当照射剂量为120cGy时，NK活性升高现象消失。
表2 低剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响(±s) 剂量(cGy)
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NK活性(%)
0
100
10
102.7±6.7
30
106.2±7.6
50
128.5±8.7**
80
134.2±12.3**
120
, 百拇医药
102.3±10.1
n=6,与0 cGy组比**P<0.01
2.3 各淋巴细胞亚群的肿瘤杀伤活性及其对CD57细胞的调节作用：分别测定了CD4、CD8、CD19和CD57细胞的肿瘤杀伤活性以及CD4，CD8，CD19分别与CD57细胞混合培养后肿瘤杀伤活性的变化。并将混合培养后测得的CPM值乘2后与该两种亚群细胞单独培养时的CPM值之和作比较(效应细胞总数相同)，观察相互间的调节作用。(表3)，各亚群间比较，CD4，CD19的肿瘤杀伤活性显著低于CD57；CD8与CD57相比无显著性差异；CD4，CD8，CD19间比较无明显差异。在混合培养组，CD4-CD57的NK活性显著高于其余两组，而CD8-CD57和CD19-CD57两组间无显著性差异。统计分析还发现，CD4和CD57细胞混合培养后总的NK活性大于两种亚群单独培养时的NK活性之和，说明这两种细胞间具有协同作用。而CD8，CD19分别与CD57混合培养后未观察到协同作用或抑制作用。
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表3 各淋巴细胞亚群的NK活性及其对CD57细胞的调节作用(±s) 编号
组别
CPM/5×105细胞
组间比较
1
CD4
941±203
2
CD8
1311±212
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3
CD19
921±214
4
CD57
1582±325
5
CD4-CD57
1779±372
1∶4** 6∶7N
6
, 百拇医药 CD8-CD57
1079±254
2∶4N (1+4)∶5*
3∶4**(2+4)∶6N
5∶6**
5∶7*(3+4)∶7N
7
CD19-CD57
1187±289
n=5,*P<0.05，**P<0.01，NP>0.05
, 百拇医药
2.4 低剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节作用的影响：将获得的CD4，CD8和CD19细胞分别与CD57细胞混合培养，分别照射其中某一亚群，并以两亚群均未受照组为对照，观察辐射后NK活性的变化，结果见表4。由表可见，分别对CD57或CD4细胞中的一种进行照射，均可使两者混合培养后的总NK活性显著升高，尤其以照射CD4细胞更为明显。说明低剂量辐射增强了两种细胞间的协同作用，而在其它混合培养组均未发现显著性差异。
表4 低剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节作用的影响(±s) 组别
NK活性
(CPM/5×105细胞)
, 百拇医药
与对照的
百分比%
CD4-CD57
1616±358
100
CD4-CD57(r)
2270±368*
143.1±23.3
CD4(r)-CD57
2157±364*
, 百拇医药
138.5±31.9
CD8-CD57
1027±173
100
CD8-CD57(r)
1337±186
127.8±34.3
CD8(r)-CD57
995±226
96.8±16.5
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CD19-CD57
1237±288
100
CD19-CD57(r)
1537±383
133.6±31.5
CD19(r)-CD57
1308±340
105.4±14.1
n=5,*P<0.05
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3 讨论
淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，也是对辐射最敏感的细胞之一，因此对淋巴细胞及其亚群的研究是探讨免疫刺激效应的有效手段。我们在测定人外周血淋巴细胞经小剂量辐射后NK活性变化的基础上，进一步应用鼠抗人单克隆抗体CD57，从人体外周血中分离出高纯度的NK细胞，经r线照射后测定其NK活性。发现经50和80cGy照射后，NK活性明显升高，而其余各剂量均无显著变化，表明50和80cGy r线照射刺激了NK细胞的功能，但使NK细胞产生刺激效应的剂量较其它淋巴细胞为高。NK细胞为辐射抗性细胞，使其产生刺激效应的辐射剂量可能有所偏高。另外经80cGy r线照射后，全淋巴细胞与分离的CD57细胞NK活性的变化也存在差异，即外周血淋巴细胞受照后NK活性没有明显变化，而CD57细胞受照后NK活性升高，这可能由于某种原因使分离后的细胞与全血中的细胞对辐射的反应有所差别，尚需深入探讨。
实验中发现除NK细胞外，CD4，CD8和B细胞均能单独杀伤肿瘤细胞，与一般认为NK活性归于NK细胞的见解不同，是在分离亚群细胞的基础上取得的新认识。CD4和CD57细胞间具有协同作用，可能以CD4细胞促进CD57细胞的功能为主，而CD8，CD19细胞对CD57细胞的调节作用不明显。一般认为CD8细胞以抑制性成分为主，它能抑制B细胞的功能。本实验将CD8与CD57细胞混合培养后并未观察到明显的抑制作用，表明CD8细胞对NK细胞功能并无抑制作用。
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在CD4和CD57细胞混合培养组，不论照射CD57或CD4细胞，混合培养后的NK活性均显著升高，表明低剂量辐射可增强CD4与CD57细胞间的协同作用。综合分析，外周血淋巴细胞经低剂量照射后NK活性的升高可能至少来自以下三方面：(1)NK细胞本身被激活，(2)其它淋巴细胞被激活后通过释放某些淋巴因子导致NK细胞的功能增强，(3)因为外周血淋巴细胞中除NK细胞外，其它各主要亚群细胞(CD4，CD8，CD19)均具有一定的肿瘤杀伤活性，所以它们受到激活后将使总NK活性有所升高。在这三方面，可能以NK细胞本身被激活起主导作用。
参考文献
1 Liu SZ.Radiation hormesis,new concept in radiological science.Chin Med J English.1989,102∶750
, 百拇医药
2 苏医卫生系第三教研室(苏燎原执笔).电离辐射对人血淋巴细胞转化能力的影响.生物化学与生物物理进展，1977,3∶10
3 Makinodan T,et al.T cell potentiation by low dose ionizing radiation:possible mechanisms.Health Phys.1990,59∶29
4 田海林，等.低剂量辐射对肿瘤病人，正常人外周血NK活性的影响.中国核科技报告.SMC-0110.北京∶原子能出版社，1994
5 Wysocki LJ,et al.“Panning”for lymphocytes:a method for cell selection.Proc Natl Acad Sci USA.1978，75∶2844
6 Reinherz EL,et al.Further characteriation of the human inducer T cell subset defined by monoclonal antibody.J Immunol.1979，123∶2894
7 杜泽吉，等.小剂量辐射对淋巴细胞亚群刺激性效应的研究.辐射研究与辐射工艺学报.1994，12∶59
8 Young C,et al.A comparative investigation of three methods of separation of CD4 and CD8 cells from human peripheral blood cells.J Immunol Methods.1988，107∶31
(1998年3月2日收稿), 百拇医药
单位：田海林 苏州医学院环境卫生学教研室； 苏燎原 杜泽吉 放射生物学教研室； 邹华伟 附属一院放疗科，王爱青33核医学重点实验室，苏州，215007
关键词：低剂量辐射；淋巴细胞亚群；兴奋效应；NK活性
苏州医学院学报990906 摘要 应用单克隆抗体铺皿法，从人外周血中分离出CD4，CD8，CD19(B)和CD57(NK)4种淋巴细胞亚群，观察了各亚群细胞的肿瘤杀伤活性和相互调节以及小剂量辐射对CD57细胞功能和亚群间调节的影响。结果发现，以上4种淋巴细胞亚群均具有肿瘤杀伤活性，其中以CD57细胞的杀伤活性最强。CD4和CD57细胞混合培养后的总NK活性超过两者之和，而CD8，CD19分别与CD57细胞混合培养后，总NK活性与两者单独培养之和相比无显著性差异。50cGy和80cGy的r线照射可使CD57细胞的功能增强。照射CD4或CD57细胞后两者混合培养的总NK活性比未受照的混合培养组显著升高。而CD8或CD19分别与CD57混合培养则无此现象。结果表明小剂量辐射可增强CD4和CD57细胞间的协同作用。外周血NK细胞受到多种亚群细胞的影响，外周血NK活性反映了多种细胞自然杀伤活性的总和。
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中图法分类 R811.5
Effects of Low Dose Radiation on Regulatory Function Between Lymphocyte Subsets
Tian Hailin,Shu Liaoyuan,Du Zhejie,et al
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Four kinds of McAbs were used to separate CD4,CD8,CD19 and CD57 cells from human peripheral blood by “Panning-direct” method.First the nature killing activity of each subsets and the regulatory functions between CD57 and other subsets were studied.Then the effects of low dose radiation on the function of CD57 cells and the regulatory functions between CD57 and other subsets were studied.The results showed that the NK activity was found in all of the four subsets and CD57 cell had the strongest activity.When CD4 and CD57 cells were cocultrued,the total NK activity was higher than that of the sum of these two single subsets,i.e.there was synergistic effects between CD4 and CD57 cells.When CD8 or CD19 cells were co-cultured separately with CD57 cells,no synergistic effect was observed.Irradiation by gamma rays at dose of 50 cGy and 80 cGy was able to stimulate the function of CD57 cells.After CD4 or CD57 cells were irradiated,the total NK activity of their co-culture increased significantly.This phenomenon was not found in the other subsets.This suggests that low dose radiation can enhance the synergistic action between CD4 and CD57 cells.So at least four subsets contribute to the total NK activity of peripheral blood mononuclear cells.
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Key words low dose radiation;lymphocyte subset;hormesis;NK activity
近年来低剂量辐射生物效应的研究日益受到重视，国内外许多学者报道低剂量辐射对淋巴细胞的功能具有刺激作用[1～3]。T、B淋巴细胞及NK细胞是机体重要的免疫活性细胞，共同承担机体特异和非特异、体液和细胞免疫功能。我们以前的工作表明[4]，低剂量辐射可以增强人外周血淋巴细胞NK活性。本文在此基础上进一步应用单克隆抗体分离各主要淋巴细胞亚群，探讨CD4，CD8，CD19三种亚群细胞对CD57细胞的调节作用。并以对肿瘤细胞的杀伤活性的指标，观察了低剂量辐射对CD57细胞功能的影响以及三种亚群细胞和CD57细胞间相互调节的影响，拟从淋巴细胞亚群的角度对低剂量辐射增强NK活性的机制作初步探索。
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1 材料和方法
1.1 单克隆抗体分离CD4，CD8，B(CD19)及NK细胞：健康献血员外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液(上海荣盛生物试剂厂)分离出单个核细胞(MNC)，以HBSS液洗三次，最后用RPMI1640培养液稀释成(0.5～1)×107/ml的细胞悬液，加到无菌培养皿(corning,USA)中，每皿加细胞悬液3～5ml,37℃静置90min。然后吸取非贴壁细胞，再用HBSS液洗二次，即为去单核的单个核细胞，备用。贴壁细胞为单核细胞，收集后供亚群培养时用。分别加200μl McAb CD4, 100μl McAb CD8,100μl McAb CD19和100μl McAb CD57于培养皿中，立即加3ml 0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液(pH9.5)，轻轻摇匀后置4℃冰箱60min。吸弃上清，用0.01mol/L PBS液(pH7.2)洗三次，再用含1%小牛血清的0.01mol/L PBS洗一次，并静置10min，封闭皿内剩余结合位点，最后用0.01mol/L PBS洗一次，4℃放置备用。按Wysocki等人建立的Panning法[5]——直接法，分离各亚群细胞。将去单核的单个核细胞悬液分成四份，分别加到包被好McAb的培养皿中，每皿所加细胞数为(2×3)×107个，用0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释到3ml，摇匀后在4℃下放置60min，其间每15min轻摇一次。吸弃非粘附细胞，用HBSS液清洗2次。最后加入1640培养液，用滴管用力吹打，洗脱全部粘附细胞并收集，再洗细胞2次，所得细胞分别为CD4，CD8，CD19和CD57细胞。
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1.2 CD4，CD8，CD19和CD57细胞的纯度，存活率及产额的测定：采用间接免疫荧光试验[6]和台盼蓝拒染法分别鉴定所分离细胞的纯度和存活率。细胞产额为所分离的CD4、CD8、CD19和CD57细胞占淋巴细胞总量的百分数。
1.3 照射条件：将镭-226γ源，固定于培养箱底部，在培养箱内搁置三夹板，照射时将样品置于三夹板上，剂量率为1.30cGy/h,源距25cm。
1.4 靶细胞：人红白血病K562细胞，使用时取对数生长期的K562细胞3ml，加入3H-TdR 1.2×104Bq,37℃培养6h，PBS液洗3次，然后用RPMI 1640培养液配成1×106个/ml细胞悬液，备用。
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1.5 小剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响：将按上法获得的CD57(NK)细胞加到培养瓶中，5×105个/瓶，再加入含10%AB血清的1640液3ml，置37℃培养箱内照射。照射结束后每瓶加入标记好的靶细胞1×105个，效：靶为5∶1，同时设单纯靶细胞组及未受照对照组。在37℃培养16h后每瓶以终浓度为0.15%胰酶和0.0125%DNA酶处理30min，按常规方法收获细胞，Beckman液体闪烁计数仪测每分钟放射性计数(CPM)，按下式计算NK相对活性：
1.6 各亚群的肿瘤杀伤活性及相互调节作用：每个培养瓶内加入靶细胞1×105个，将按上法获得的CD4，CD8，CD19和CD57细胞分别加到培养瓶中，5×105个/瓶。观察亚群间调节作用时，所加每一种亚群细胞数减半，两种亚群相加后效应细胞总数仍为5×105个/瓶，靶细胞为1×105个/瓶，同时设单纯靶细胞组。按上法培养及收获细胞，并测CPM值，按下式计算肿瘤细胞杀伤活性(NK活性)：NK活性(CPM/5×105 cells)=单纯靶细胞组CPM-实验组CPM，本式得到的差值即表示各亚群细胞破坏肿瘤细胞所释放的CPM值，该值越大，说明对肿瘤杀伤活性越强，反之则越弱。
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1.7 低剂量辐射对亚群细胞间调节的影响：按上法将CD4，CD8，CD19细胞分别与CD57细胞混合培养，每瓶所加细胞数及效：靶比同前，按下列组合方式分组：CDX-CD57，CDX-CD57(r),CDX(r)-CD57，上式中x取值分别为4，8，19，“r”表示辐照。据文献报道[7]，人外周血淋巴细胞受到50cGy照射后，NK活性增强最明显，所以将CD57细胞的照射剂量定为50cGy，其余各亚群细胞的受照剂量均为10cGy,按下式计算各混合培养组的NK活性：NK活性(CPM/5×105 cells)=单纯靶细胞组CPM-实验组CPM，各照射组分别以相应未照射组为对照，作统计分析。
1.8 数据处理：数据经平方根转换或arcSin
转换后再作t检验或F检验。, 百拇医药
2 结果
2.1 单克隆抗体分离各淋巴细胞亚群的纯度、存活率和产额：用Panning直接法分离出CD4，CD8，CD19和CD57细胞，其纯度和存活率较高，产额略偏低(表1)，结果与文献报道相近[8]，说明按此法分离到的淋巴细胞亚群可满足实验要求。
表1 单抗分离淋巴细胞亚群的纯度，存活率和产额(%，
±s) 指标CD4
CD8
CD19(B)
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CD57(NK)
纯度
89.3±3.5
91.3±1.5
91.5±1.1
90.5±3.4
存活率
96.0±1.9
95.8±1.5
96.0±2.4
95.3±1.5
产额
, http://www.100md.com
26.5±4.4
18.7±2.3
16.3±1.9
14.8±2.4
n=4
2.2 低剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响：分离出的CD57细胞经低剂量r线照射后再与靶细胞混合培养，以未受照组为对照，计算NK活性(表2)。在30cGy剂量以下的r线照射，对CD57细胞的NK活性没有明显的影响，当受照剂量为50和80cGy时，NK活性显著升高。当照射剂量为120cGy时，NK活性升高现象消失。
表2 低剂量辐射对CD57细胞NK活性的影响(
±s) 剂量(cGy), 百拇医药
NK活性(%)
0
100
10
102.7±6.7
30
106.2±7.6
50
128.5±8.7**
80
134.2±12.3**
120
, 百拇医药
102.3±10.1
n=6,与0 cGy组比**P<0.01
2.3 各淋巴细胞亚群的肿瘤杀伤活性及其对CD57细胞的调节作用：分别测定了CD4、CD8、CD19和CD57细胞的肿瘤杀伤活性以及CD4，CD8，CD19分别与CD57细胞混合培养后肿瘤杀伤活性的变化。并将混合培养后测得的CPM值乘2后与该两种亚群细胞单独培养时的CPM值之和作比较(效应细胞总数相同)，观察相互间的调节作用。(表3)，各亚群间比较，CD4，CD19的肿瘤杀伤活性显著低于CD57；CD8与CD57相比无显著性差异；CD4，CD8，CD19间比较无明显差异。在混合培养组，CD4-CD57的NK活性显著高于其余两组，而CD8-CD57和CD19-CD57两组间无显著性差异。统计分析还发现，CD4和CD57细胞混合培养后总的NK活性大于两种亚群单独培养时的NK活性之和，说明这两种细胞间具有协同作用。而CD8，CD19分别与CD57混合培养后未观察到协同作用或抑制作用。
, 百拇医药
表3 各淋巴细胞亚群的NK活性及其对CD57细胞的调节作用(
±s) 编号组别
CPM/5×105细胞
组间比较
1
CD4
941±203
2
CD8
1311±212
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3
CD19
921±214
4
CD57
1582±325
5
CD4-CD57
1779±372
1∶4** 6∶7N
6
, 百拇医药 CD8-CD57
1079±254
2∶4N (1+4)∶5*
3∶4**(2+4)∶6N
5∶6**
5∶7*(3+4)∶7N
7
CD19-CD57
1187±289
n=5,*P<0.05，**P<0.01，NP>0.05
, 百拇医药
2.4 低剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节作用的影响：将获得的CD4，CD8和CD19细胞分别与CD57细胞混合培养，分别照射其中某一亚群，并以两亚群均未受照组为对照，观察辐射后NK活性的变化，结果见表4。由表可见，分别对CD57或CD4细胞中的一种进行照射，均可使两者混合培养后的总NK活性显著升高，尤其以照射CD4细胞更为明显。说明低剂量辐射增强了两种细胞间的协同作用，而在其它混合培养组均未发现显著性差异。
表4 低剂量辐射对淋巴细胞亚群间调节作用的影响(
±s) 组别NK活性
(CPM/5×105细胞)
, 百拇医药
与对照的
百分比%
CD4-CD57
1616±358
100
CD4-CD57(r)
2270±368*
143.1±23.3
CD4(r)-CD57
2157±364*
, 百拇医药
138.5±31.9
CD8-CD57
1027±173
100
CD8-CD57(r)
1337±186
127.8±34.3
CD8(r)-CD57
995±226
96.8±16.5
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CD19-CD57
1237±288
100
CD19-CD57(r)
1537±383
133.6±31.5
CD19(r)-CD57
1308±340
105.4±14.1
n=5,*P<0.05
, http://www.100md.com
3 讨论
淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，也是对辐射最敏感的细胞之一，因此对淋巴细胞及其亚群的研究是探讨免疫刺激效应的有效手段。我们在测定人外周血淋巴细胞经小剂量辐射后NK活性变化的基础上，进一步应用鼠抗人单克隆抗体CD57，从人体外周血中分离出高纯度的NK细胞，经r线照射后测定其NK活性。发现经50和80cGy照射后，NK活性明显升高，而其余各剂量均无显著变化，表明50和80cGy r线照射刺激了NK细胞的功能，但使NK细胞产生刺激效应的剂量较其它淋巴细胞为高。NK细胞为辐射抗性细胞，使其产生刺激效应的辐射剂量可能有所偏高。另外经80cGy r线照射后，全淋巴细胞与分离的CD57细胞NK活性的变化也存在差异，即外周血淋巴细胞受照后NK活性没有明显变化，而CD57细胞受照后NK活性升高，这可能由于某种原因使分离后的细胞与全血中的细胞对辐射的反应有所差别，尚需深入探讨。
实验中发现除NK细胞外，CD4，CD8和B细胞均能单独杀伤肿瘤细胞，与一般认为NK活性归于NK细胞的见解不同，是在分离亚群细胞的基础上取得的新认识。CD4和CD57细胞间具有协同作用，可能以CD4细胞促进CD57细胞的功能为主，而CD8，CD19细胞对CD57细胞的调节作用不明显。一般认为CD8细胞以抑制性成分为主，它能抑制B细胞的功能。本实验将CD8与CD57细胞混合培养后并未观察到明显的抑制作用，表明CD8细胞对NK细胞功能并无抑制作用。
, 百拇医药
在CD4和CD57细胞混合培养组，不论照射CD57或CD4细胞，混合培养后的NK活性均显著升高，表明低剂量辐射可增强CD4与CD57细胞间的协同作用。综合分析，外周血淋巴细胞经低剂量照射后NK活性的升高可能至少来自以下三方面：(1)NK细胞本身被激活，(2)其它淋巴细胞被激活后通过释放某些淋巴因子导致NK细胞的功能增强，(3)因为外周血淋巴细胞中除NK细胞外，其它各主要亚群细胞(CD4，CD8，CD19)均具有一定的肿瘤杀伤活性，所以它们受到激活后将使总NK活性有所升高。在这三方面，可能以NK细胞本身被激活起主导作用。
参考文献
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(1998年3月2日收稿), 百拇医药