缺血预处理对肺再灌注损伤脂质过氧化的影响
作者：罗万俊 陈胜喜 胡佳心 蒋海河
单位：湖南医科大学附属湘雅医院心胸外科(长沙 410008)
关键词：局部缺血；肺；再灌注损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化酶
中国病理生理杂志990922
摘 要 目的：观察缺血预处理对在体兔肺常温缺血再灌注损伤脂质过氧化的影响。方法：采用阻断左肺门的肺缺血再灌注损伤模型。硫代巴比妥酸法及DTNB直接法测肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)及肺组织光镜观察。结果：缺血再灌组左肺MDA较假手术组和缺血组为高，而SOD和GSHpx活性较低(P<0.01)，肺组织损伤较重。与缺血再灌组比较，缺血预处理+缺血再灌组有较低的MDA含量和较高的SOD与GSHpx活性(P<0.05),肺损伤亦较轻。结论：缺血预处理可减轻兔肺常温缺血再灌注诱导的脂质过氧化反应。
, 百拇医药
近10年来，缺血预处理已被较多的研究证明对心肌有明显保护作用[1，2]。低温、心脏停跳液和缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)被认为可能是较理想的心肌保护方法[2]。但迄今为止，IP是否对肺有保护作用尚未见报道。我科曾报道了IP可改善兔肺常温(37℃)缺血再灌注后的氧合功能，减轻毛细血管通透性增加[3]。本实验探讨IP对肺再灌注损伤脂质过氧化的影响，了解IP可能的作用机制。
Effect of ischemic preconditioning on lipid peroxidation of lung reperfusion injury
LUO Wan-Jun,CHENG Sheng-Xi,HU Jia-Xin,JIANG Hai-He
Department of Cardiothoracic Surgery,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha (410008)
, 百拇医药
Abstract AIM: To evaluate the effect of ischemic preconditioning(IP)on lipid peroxidation of lung reperfusion injury in situ of rabbits.METHODS：Left lung ischemia was created by occluding left hilum.At the end of experiment,lung tissue was excised for measurement of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase (GSHpx) activities by direct method of DTNB,and malondialdehyde(MDA)content by the barbituric acid method.Histologic change of lung injury was assessed by quantitative method.RESULTS：The MDA content of left lung was increased and SOD,GSHpx activities decreased significantly in ischemia/reperfusion group (I/R group) compared with sham group and ischemia alone group (P<0.01,respectively);Severe histologic injury also occurred in I/R group.There are lower MDA content and higher SOD and GSHpx activities with less lung injury in IP+I/R group than in I/R group (P<0.05).CONCLUSION：Ischemic preconditioning attenuate lipid peroxidation induced by normothermic ischemia reperfusion injury in rabbit lung.
, 百拇医药
MeSH Ischemia;Lung;Reperfusion injury;Malondialdehyde;Superoxide dismutase;Glutathione peroxidase
材料与方法
健康日本大白耳兔25只，体重2.5～3.0kg,由本院动物室提供。静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，气管切开插管接动物呼吸机，吸氧浓度100%，通气频率40～50次/min。潮气量为双侧肺通气15～20 mL/kg，单侧肺通气8～10 mL/kg，吸呼比为1：1.25。实验中连续监测股动脉压及肛温，维持静脉输注Ringers液(10 mL/kg*h-1)，电热器调节体温。经左胸第4或第5肋间开胸，左肺门游离后过阻断带，静脉注射肝素(1 mg/kg)抗疑。按Sekido等报道的方法复制在体兔肺缺血再灌注损伤模型[4]，即阻断左肺门的血管和支气管，中止左肺的血液供应和通气造成左肺缺血，达预定时间后，将阻断带松开恢复左肺血液供应和通气即左肺再灌注。
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实验随机分为5组。假手术组(sham, S组，n=5)：开胸后左肺门只过带，不阻断，观察145 min。缺血组(ischemia, Ⅰ组，n=4)：阻断左肺门60 min，即左全肺缺血。缺血再灌注组(ischemia/reperfusion, I/R组，n=6)：阻断左肺门60 min后开放阻断带再灌注60 min。预处理+缺血再灌注组(IP+I/R组，n=6)：左肺门阻断60 min前阻断左肺门10 min再灌注15 min(即缺血预处理)，余同I/R组。单纯预处理组(IP组，n=4)：左肺门阻断10 min，开放135 min，其后无第二次缺血再灌注。
指标及检测：(1)肺组织丙二醛(malondialdehyde MDA)含量根据硫代巴比妥酸法测定[5]。(2)肺组织谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHpx)活性用DTNB直接法测定[6]。(3)肺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性用黄嘌呤氧化酶法测定[7]。(4)肺组织光镜检查。肺组织福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。每个标本4张切片，抽取其中一张，在光镜下连续观察10个视野(200倍)的肺泡总数。肺泡中细胞总数(红细胞和/或白细胞)超过2个以上视为有肺泡损伤[8]。以损伤的肺泡数与总的肺泡计数的比值作为肺损伤程度的定量评价指标。
, 百拇医药
数据以均数±标准差(±s)表示。采用方差分析和χ2检验。
结果
(一)各组动物均维持至实验结束。肛温维持在36.5～37.8℃。平均动脉压维持在9～11kPa之间，未用任何血管活性药物。组间均衡性良好。
(二)各组动物左肺组织(实验侧肺)MDA含量，GSHpx和SOD活性变化见表1。右肺组织上述指标变化见表2。Ⅰ组左肺MDA较S组为高，但无显著差异(P>0.05，与S组比)。而再灌注60 min后(I/R组)左肺MDA含量显著高于Ⅰ组和S组，SOD和GSHpx活性明显低于Ⅰ组和S组(P<0.01)。缺血组(Ⅰ组)左肺SOD和GSHpx活性与S组比较无显著差异(P>0.05)。IP+I/R组(即肺长时间缺血前进行短时缺血再灌注处理)左肺组织MDA含量显著低于I/R组，SOD和GSHpx活性高于I/R组(P<0.05)。在单纯IP组(即短时间缺血再灌注后)，左肺组织SOD活性GSHpx活性显著高于其它各组(P<0.05)，MDA含量与S组比较差异无显著(P>0.05)。右肺组织MDA含量、SOD和GSHpx活性各组间无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表1 左肺SOD、GSHpx活性和MDA含量变化
Tab 1 SOD,GSHpx activity and MDA content of left lung tissue(±s)
SOD
GHSpx
MDA
Treatment
n
(U/mg protein)
(U/mg protein)
(nmol/mg protein)
, 百拇医药
S
5
4.9±1.5
0.77±0.10
5.1±0.7
I
4
3.6±0.2
0.62±0.16
5.7±0.8
I/R
6
2.3±0.6
, 百拇医药
0.44±0.11
9.0±2.1
IP+I/R
6
4.4±1.1
0.68±0.17
6.5±1.5
IP
4
8.8±1.3Δ
1.20±0.31Δ
, http://www.100md.com
5.3±1.2
*P<0.01，vs S and I group; P<0.05，vs I/R group;
ΔP<0.05，vs other groups表2 右肺SOD、GSHpx活性和MDA含量变化
Tab 2 SOD,GSHpx activity and MDA content of right lung tissue(±s)
SOD
GHSpx
MDA
Treatment
n
, http://www.100md.com
(U/mg protein)
(U/mg protein)
(nmol/mg protein)
S
5
4.7±0.9
0.81±0.12
5.6±0.8
I
4
5.1±0.8
0.74±0.18
, 百拇医药
6.1±1.1
I/R
6
4.9±1.1
0.79±0.14
6.8±2.1
IP+I/R
6
4.6±0.7
0.72±0.13
6.7±1.8
IP
4
, http://www.100md.com
5.8±1.2
0.89±0.21
5.8±1.4
(三)肺组织学损伤评价。见表3。缺血60 min后即有肺损伤，再灌注60 min后(I/R组)肺泡损伤数进一步加重(与Ⅰ组比，P<0.05)。IP+I/R组肺损伤计数较I/R组减轻(P<0.05)，但与S组比较仍有显著差异(P<0.05)。假手术组(S组)、单纯预处理组以及各组右肺组织均未见明显损伤。表3 各组肺组织学损伤定量评价
Tab 3 Quantitative assessment of histologic lung injury(±s，%) Treatment
n
Left lung
, http://www.100md.com
Right lung
S
5
3.2±0.7
2.8±0.6
I
4
18.7±4.2
3.4±1.1
I/R
6
52.6±10.8
, http://www.100md.com
5.2±1.4
IP+I/R
6
31.4±6.3Δ
4.8±1.3
IP
4
3.1±0.8
2.9±0.9
P<0.05，vs S group;P<0.05， vs I group; ΔP<0.05 vs I/R group讨 论
本研究观察到肺组织缺血再灌注期MDA含量升高，抗自由基酶类SOD和GSHpx活性显著下降，说明再灌注期肺组织脂质过氧化反应增强，抗氧化能力降低，这与文献报道一致[9]。缺血再灌注期肺组织可通过黄嘌呤氧化酶系统，白细胞的“呼吸爆发”等途径产生大量氧自由基。同时，内源性抗自由基酶类如SOD和GSHpx等被消耗以及自由基所致的酶活性降低，导致内源性抗氧化能力降低，从而引发了肺组织的脂质过氧化损伤。
, http://www.100md.com
本研究发现，IP可减轻在体兔肺热缺血再灌注损伤所致的脂质过氧化反应，表现在缺血再灌注后MDA含量降低，抗自由基酶(SOD和GSHpx)活性升高，形态学上的损伤较小，此结果提示IP具有类似自由基清除剂的作用。由于IP本身造成肺缺血，这是否构成对肺的损伤是值得探讨的问题，本研究观察到单纯IP组(缺血10 min再灌注135 min)MDA含量未升高，组织学改变不明显，提示IP本身对肺组织无明显损害作用。
IP的作用机制有多种学说、包括腺苷学说，能量代谢学说等[1]。本文显示IP组肺组织SOD和GSHpx活性明显升高，分别超过正常肺组织(S组)的80%和55%，表明IP提高了内源性抗自由基酶类的活性[10]，作者认为这可能是IP保护效应的机制之一。
参考文献
1 Lawson CS,Downey JM.Preconditioning:State of the rat myocardial protection.Cardiovasc Res,1993,27:542.
, 百拇医药
2 Celeland JC,Meldrum DR,Rowland TR,et al.Optimal myocardial preservation:cooling,cardioplegia,and conditioning.Ann Thorac Surg,1996,61:760.
3 陈胜喜，胡佳心，罗万俊，等.缺血预处理对在体兔肺缺血再灌注损伤的保护作用.湖南医科大学学报，1996，21：390.
4 Sekido N,Mukaida A,Harada A,et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8.Nature,1993,365:654.
5 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.Anal Biochem,1979,95:351.
, http://www.100md.com
6 夏奕明，朱莲珍.血和组织谷胱甘肽过氧化物酶的活性测定方法I.DTNB直接法.卫生研究，1987，16：29.
7 李健平，吴再彬，刘歧山.超氧化物歧化酶超微量快速测定法.南京铁道医学院学报，1991，10：27.
8 Murata T.Nakazawa H,Mori I,et al.Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis.Am Rev Respir Dis,1992,146:1048.
9 朱述阳，何冰，穆魁敏，等.氧自由基在兔肺缺血再灌注损伤发生中的作用.中华医学杂志，1992，72：370.
10 董念国，蓝鸿钧，傅新平.超前缺血对培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1995，11：174.
(1998年3月23日收稿，1998年10月7日修回), 百拇医药
单位：湖南医科大学附属湘雅医院心胸外科(长沙 410008)
关键词：局部缺血；肺；再灌注损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化酶
中国病理生理杂志990922
摘 要 目的：观察缺血预处理对在体兔肺常温缺血再灌注损伤脂质过氧化的影响。方法：采用阻断左肺门的肺缺血再灌注损伤模型。硫代巴比妥酸法及DTNB直接法测肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)及肺组织光镜观察。结果：缺血再灌组左肺MDA较假手术组和缺血组为高，而SOD和GSHpx活性较低(P<0.01)，肺组织损伤较重。与缺血再灌组比较，缺血预处理+缺血再灌组有较低的MDA含量和较高的SOD与GSHpx活性(P<0.05),肺损伤亦较轻。结论：缺血预处理可减轻兔肺常温缺血再灌注诱导的脂质过氧化反应。
, 百拇医药
近10年来，缺血预处理已被较多的研究证明对心肌有明显保护作用[1，2]。低温、心脏停跳液和缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)被认为可能是较理想的心肌保护方法[2]。但迄今为止，IP是否对肺有保护作用尚未见报道。我科曾报道了IP可改善兔肺常温(37℃)缺血再灌注后的氧合功能，减轻毛细血管通透性增加[3]。本实验探讨IP对肺再灌注损伤脂质过氧化的影响，了解IP可能的作用机制。
Effect of ischemic preconditioning on lipid peroxidation of lung reperfusion injury
LUO Wan-Jun,CHENG Sheng-Xi,HU Jia-Xin,JIANG Hai-He
Department of Cardiothoracic Surgery,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha (410008)
, 百拇医药
Abstract AIM: To evaluate the effect of ischemic preconditioning(IP)on lipid peroxidation of lung reperfusion injury in situ of rabbits.METHODS：Left lung ischemia was created by occluding left hilum.At the end of experiment,lung tissue was excised for measurement of superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase (GSHpx) activities by direct method of DTNB,and malondialdehyde(MDA)content by the barbituric acid method.Histologic change of lung injury was assessed by quantitative method.RESULTS：The MDA content of left lung was increased and SOD,GSHpx activities decreased significantly in ischemia/reperfusion group (I/R group) compared with sham group and ischemia alone group (P<0.01,respectively);Severe histologic injury also occurred in I/R group.There are lower MDA content and higher SOD and GSHpx activities with less lung injury in IP+I/R group than in I/R group (P<0.05).CONCLUSION：Ischemic preconditioning attenuate lipid peroxidation induced by normothermic ischemia reperfusion injury in rabbit lung.
, 百拇医药
MeSH Ischemia;Lung;Reperfusion injury;Malondialdehyde;Superoxide dismutase;Glutathione peroxidase
材料与方法
健康日本大白耳兔25只，体重2.5～3.0kg,由本院动物室提供。静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，气管切开插管接动物呼吸机，吸氧浓度100%，通气频率40～50次/min。潮气量为双侧肺通气15～20 mL/kg，单侧肺通气8～10 mL/kg，吸呼比为1：1.25。实验中连续监测股动脉压及肛温，维持静脉输注Ringers液(10 mL/kg*h-1)，电热器调节体温。经左胸第4或第5肋间开胸，左肺门游离后过阻断带，静脉注射肝素(1 mg/kg)抗疑。按Sekido等报道的方法复制在体兔肺缺血再灌注损伤模型[4]，即阻断左肺门的血管和支气管，中止左肺的血液供应和通气造成左肺缺血，达预定时间后，将阻断带松开恢复左肺血液供应和通气即左肺再灌注。
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实验随机分为5组。假手术组(sham, S组，n=5)：开胸后左肺门只过带，不阻断，观察145 min。缺血组(ischemia, Ⅰ组，n=4)：阻断左肺门60 min，即左全肺缺血。缺血再灌注组(ischemia/reperfusion, I/R组，n=6)：阻断左肺门60 min后开放阻断带再灌注60 min。预处理+缺血再灌注组(IP+I/R组，n=6)：左肺门阻断60 min前阻断左肺门10 min再灌注15 min(即缺血预处理)，余同I/R组。单纯预处理组(IP组，n=4)：左肺门阻断10 min，开放135 min，其后无第二次缺血再灌注。
指标及检测：(1)肺组织丙二醛(malondialdehyde MDA)含量根据硫代巴比妥酸法测定[5]。(2)肺组织谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHpx)活性用DTNB直接法测定[6]。(3)肺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性用黄嘌呤氧化酶法测定[7]。(4)肺组织光镜检查。肺组织福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。每个标本4张切片，抽取其中一张，在光镜下连续观察10个视野(200倍)的肺泡总数。肺泡中细胞总数(红细胞和/或白细胞)超过2个以上视为有肺泡损伤[8]。以损伤的肺泡数与总的肺泡计数的比值作为肺损伤程度的定量评价指标。
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数据以均数±标准差(±s)表示。采用方差分析和χ2检验。
结果
(一)各组动物均维持至实验结束。肛温维持在36.5～37.8℃。平均动脉压维持在9～11kPa之间，未用任何血管活性药物。组间均衡性良好。
(二)各组动物左肺组织(实验侧肺)MDA含量，GSHpx和SOD活性变化见表1。右肺组织上述指标变化见表2。Ⅰ组左肺MDA较S组为高，但无显著差异(P>0.05，与S组比)。而再灌注60 min后(I/R组)左肺MDA含量显著高于Ⅰ组和S组，SOD和GSHpx活性明显低于Ⅰ组和S组(P<0.01)。缺血组(Ⅰ组)左肺SOD和GSHpx活性与S组比较无显著差异(P>0.05)。IP+I/R组(即肺长时间缺血前进行短时缺血再灌注处理)左肺组织MDA含量显著低于I/R组，SOD和GSHpx活性高于I/R组(P<0.05)。在单纯IP组(即短时间缺血再灌注后)，左肺组织SOD活性GSHpx活性显著高于其它各组(P<0.05)，MDA含量与S组比较差异无显著(P>0.05)。右肺组织MDA含量、SOD和GSHpx活性各组间无显著差异(P>0.05)。
, 百拇医药
表1 左肺SOD、GSHpx活性和MDA含量变化
Tab 1 SOD,GSHpx activity and MDA content of left lung tissue(±s)
SOD
GHSpx
MDA
Treatment
n
(U/mg protein)
(U/mg protein)
(nmol/mg protein)
, 百拇医药
S
5
4.9±1.5
0.77±0.10
5.1±0.7
I
4
3.6±0.2
0.62±0.16
5.7±0.8
I/R
6
2.3±0.6
, 百拇医药
0.44±0.11
9.0±2.1
IP+I/R
6
4.4±1.1
0.68±0.17
6.5±1.5
IP
4
8.8±1.3Δ
1.20±0.31Δ
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5.3±1.2
*P<0.01，vs S and I group; P<0.05，vs I/R group;
ΔP<0.05，vs other groups表2 右肺SOD、GSHpx活性和MDA含量变化
Tab 2 SOD,GSHpx activity and MDA content of right lung tissue(±s)
SOD
GHSpx
MDA
Treatment
n
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(U/mg protein)
(U/mg protein)
(nmol/mg protein)
S
5
4.7±0.9
0.81±0.12
5.6±0.8
I
4
5.1±0.8
0.74±0.18
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6.1±1.1
I/R
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4.9±1.1
0.79±0.14
6.8±2.1
IP+I/R
6
4.6±0.7
0.72±0.13
6.7±1.8
IP
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5.8±1.2
0.89±0.21
5.8±1.4
(三)肺组织学损伤评价。见表3。缺血60 min后即有肺损伤，再灌注60 min后(I/R组)肺泡损伤数进一步加重(与Ⅰ组比，P<0.05)。IP+I/R组肺损伤计数较I/R组减轻(P<0.05)，但与S组比较仍有显著差异(P<0.05)。假手术组(S组)、单纯预处理组以及各组右肺组织均未见明显损伤。表3 各组肺组织学损伤定量评价
Tab 3 Quantitative assessment of histologic lung injury(±s，%) Treatment
n
Left lung
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Right lung
S
5
3.2±0.7
2.8±0.6
I
4
18.7±4.2
3.4±1.1
I/R
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52.6±10.8
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5.2±1.4
IP+I/R
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31.4±6.3Δ
4.8±1.3
IP
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3.1±0.8
2.9±0.9
P<0.05，vs S group;P<0.05， vs I group; ΔP<0.05 vs I/R group讨 论
本研究观察到肺组织缺血再灌注期MDA含量升高，抗自由基酶类SOD和GSHpx活性显著下降，说明再灌注期肺组织脂质过氧化反应增强，抗氧化能力降低，这与文献报道一致[9]。缺血再灌注期肺组织可通过黄嘌呤氧化酶系统，白细胞的“呼吸爆发”等途径产生大量氧自由基。同时，内源性抗自由基酶类如SOD和GSHpx等被消耗以及自由基所致的酶活性降低，导致内源性抗氧化能力降低，从而引发了肺组织的脂质过氧化损伤。
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本研究发现，IP可减轻在体兔肺热缺血再灌注损伤所致的脂质过氧化反应，表现在缺血再灌注后MDA含量降低，抗自由基酶(SOD和GSHpx)活性升高，形态学上的损伤较小，此结果提示IP具有类似自由基清除剂的作用。由于IP本身造成肺缺血，这是否构成对肺的损伤是值得探讨的问题，本研究观察到单纯IP组(缺血10 min再灌注135 min)MDA含量未升高，组织学改变不明显，提示IP本身对肺组织无明显损害作用。
IP的作用机制有多种学说、包括腺苷学说，能量代谢学说等[1]。本文显示IP组肺组织SOD和GSHpx活性明显升高，分别超过正常肺组织(S组)的80%和55%，表明IP提高了内源性抗自由基酶类的活性[10]，作者认为这可能是IP保护效应的机制之一。
参考文献
1 Lawson CS,Downey JM.Preconditioning:State of the rat myocardial protection.Cardiovasc Res,1993,27:542.
, 百拇医药
2 Celeland JC,Meldrum DR,Rowland TR,et al.Optimal myocardial preservation:cooling,cardioplegia,and conditioning.Ann Thorac Surg,1996,61:760.
3 陈胜喜，胡佳心，罗万俊，等.缺血预处理对在体兔肺缺血再灌注损伤的保护作用.湖南医科大学学报，1996，21：390.
4 Sekido N,Mukaida A,Harada A,et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8.Nature,1993,365:654.
5 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K.Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction.Anal Biochem,1979,95:351.
, http://www.100md.com
6 夏奕明，朱莲珍.血和组织谷胱甘肽过氧化物酶的活性测定方法I.DTNB直接法.卫生研究，1987，16：29.
7 李健平，吴再彬，刘歧山.超氧化物歧化酶超微量快速测定法.南京铁道医学院学报，1991，10：27.
8 Murata T.Nakazawa H,Mori I,et al.Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis.Am Rev Respir Dis,1992,146:1048.
9 朱述阳，何冰，穆魁敏，等.氧自由基在兔肺缺血再灌注损伤发生中的作用.中华医学杂志，1992，72：370.
10 董念国，蓝鸿钧，傅新平.超前缺血对培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1995，11：174.
(1998年3月23日收稿，1998年10月7日修回), 百拇医药