二阶导数差示脉冲极谱法用于血浆中氯氮及其主要代谢物的定量研究
作者：赵声明 李梦 梁云爱 臧华
单位：(赵声明)卫生部北京医院 北京 100730；(李梦 梁云爱)山东省日照市药品检验所；(臧华)中国人民解放军第302医院
关键词：二阶导数差示脉冲极谱法，血浆，氯氮，代谢物
中国医院药学杂志991207
摘要 目的:测定血浆中氯氮及其主要代谢物的含量。方法:血浆用乙醚提取，经薄层层析分离，分别洗脱，残渣溶于50mmol.L-1H2SO4水溶液中，用二阶导数差示脉冲极谱法测定。结果:氯氮及其代谢物(Ⅰ、Ⅱ)的二阶导数差示脉冲极谱峰电位分别为：-0.600V、-0.590V、-0.645V，检测限分别为：0.27，0.11，0.22ng.ml-1。结论:该法简便、快速、灵敏，结果准确。
, 百拇医药
关键词 氯氮
Study on quantitative determination of
chlordiazepoxide and its metabolite in blood by
secondary derivative differential pulse polarography
Zhao Shengming Li Meng Liang Yunai et al
Beijing Hospital of the Ministry of the Public Health,Beijing 100730
ABSTRACT OBJECTIVE：To determine the content of chlordiazepoxide and its metbolite in blood.METHODS：The blood sample was first purified by ethey,then separated by thin-layer chromatography, residue was dissoled in 50 mmol.L-1 sulfuric acid-water solution, and then determined by secondary derivative differential pulse polarography.RESULTS：Secondary derivative differential pulse polarogram peak of chlordiazepoxide and its metabolite (Ⅰ、Ⅱ) was -0.600V,-0.590V and -0.645V.The detection limit was 0.27，0.11 and 0.22 ng.ml-1.CONCLUSION：This method is simple,rapid and sensitive.The result is accurate.
, 百拇医药
KEY WORDS secondary derivative differential pulse polarography,plasma,chlordiazepoxids, metabolite
氯氮是临床上常用的抗焦虑、抗惊厥药。但该药可导致依赖性，并且毒性较强，若服用过量，可导致急性中毒，重者可导致昏迷甚至死亡。由于氯氮服用量较小，体液中浓度较低，其代谢物与原药化学结构相似，大多仍具有药理活性，要求检测方法必须灵敏度较高，并且原药品及其代谢物均能测出，故其体内药物检测具有一定难度。本文采用二阶导数差示脉冲极谱法(SDPP)[1]对人体血浆中氯氮及其主要代谢物进行了定量研究，操作简便、快速、灵敏、结果准确，对本品的血药浓度监控及其毒理学、药物动力学的研究具有实用价值。
1 方法
1.1 仪器 DP-A型微分脉冲极谱仪(山东日照市药品检验所与中科院大气物理研究所联合研制，1995年获得联合国TIPS发明创新科技之星奖)。
, 百拇医药
1.2 药品与试剂 氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定标准品(中国药品生物制品检定所)；薄层层析用硅胶(青岛海洋化工厂)；试剂均为分析纯；实验用水为去离子双蒸馏水。1mol.L-1磷酸盐缓冲液(pH9.0)：称取磷酸氢二钾174.17g、磷酸二氢钾2.00g，置1000ml量瓶中，加水溶解，定容。50mmol.L-1硫酸液：精密量取硫酸3.00ml，移入装有约600ml水的1000ml量瓶中，冷至室温，加水定容。
1.3 血样处理 取血浆样品2ml，置15ml的具塞玻璃离心管中，加水1ml、磷酸盐缓冲液(pH9.0)2ml、乙醚7ml，于旋涡混合器上混合10min，置离心机上以2000r.min-1离心5min，将乙醚吸出，于45℃水浴中蒸干。
1.4 极谱条件 将仪器功能置SDPP处，选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为28s,Ag/AgCl电极为参比电极，内装1mol.L-1KCl参比溶液，微铂电极为辅助电极，预置电压为-0.400V，扫描范围为-0.400～-0.800V，脉冲振幅为40mV，扫描速度为150mV.s-1，电流灵敏度为5μA.V-1。
, 百拇医药
1.5 测定方法 用乙醚100μl溶解残渣，点样于20cm×20cm硅胶薄层板上。用氯仿∶丙酮(6∶4)展开剂展开至溶液前沿约15cm时为止。将板置紫外灯下观察，可见3个斑点：氯氮卓(Rf=0.20)，去甲基氯氮(Rf=0.05)，去甲氧安定(Rf=0.33)。将3个斑点(连同硅胶吸附剂)分别刮下，置3支15ml离心管中，加甲醇5ml，置旋涡混合器上混合30s，以2000r.min-1的速度离心5min，取上清液移入15ml具塞玻璃离心管中，在65℃水浴上蒸干，加50mmol.L-1盐酸液8.00ml，混匀，加入极谱池中，富集5min，分别在上述极谱条件下，自-0.400～-0.800V以150mV.s-1的速度进行阴极扫描。精密称取氯氮(A)、去甲基氯氮(B)、去甲氧安定(C)标准品适量，用氯仿制成含A为200μg.ml-1、B为150μg.ml-1、C为10μg.ml-1的溶液。按1.3和1.5项处理和扫描，得A、B、C标准品的SDPP图，见图1。取空白血浆2ml，按1.3项处理，加50mmol.L-1盐酸溶液8.00ml，混匀，加入极谱池中，富集5min，在1.4项极谱条件下扫描，得空白血浆的SDPP图。取空白血浆2ml，精密加入A、B、C标准品适量，制成含A为200μg.ml-1、B为150μg.ml-1、C为12μg.ml-1的血浆混合液，按1.3和1.5项处理后，在1.4极谱条件下扫描，得A、B、C的SDPP图。
, 百拇医药
图1 氯氮(A)、去甲基氯氮(B)和去甲氧安定(C)的SDPP图
2 结果
2.1 线性试验 分别精密称取3种对照品适量，用氯仿制成含氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定分别为：0.01，0.05，0.5，5.0，50.0，100，150，200，250，300μg.ml-1；0.01，0.40，4.0，20，40，60，80，100，150，200μg.ml-1；0.01，0.025，0.05，0.10，1.00，2.5，5.0，7.5，10.0，20.0μg.ml-1的系列标准溶液。取空白血浆33份(其中3份做每种标准品的空白对照)，每份2ml分别加入上述3种标准品的溶液2ml，按1.3项下处理、测定。实验结果表明，在此范围内，氯氮及其代谢物的浓度C与其SDPP峰幅值d2i/dE2(mm)呈线性关系(P<0.01)。根据实验结果，求出回归方程为：
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氯氮：C=5.0731d2i/dE2-19.1188(r=0.9999,n=10,P<0.01)
去甲基氯氮：C=4.5308d2i/dE2-1.5095(r=0.9985,n=10,P<0.01)
去甲氧安定：C=5.1076d2e/dE2-0.0333(r=0.9999,n=10,P<0.01)
氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定的标准曲线范围分别为：0.01～300，0.01～200，0.01～20μg.ml-1。
2.2 样品测定 用上述方法测定了口服单剂量(20mg)的氯氮于72h内血浆中氯氮及其主要代谢物(去甲基氯氮、去甲氧安定)的含量，结果见表1。
, 百拇医药
表1 氯氮及其主要代谢物的血药浓度(μg.ml-1，±s,n=6) 时间/h
氯氮
去甲基氯氮
去甲氧安定
1
1.04±0.06
0.05±0.05
0.02±0.06
2
1.42±0.06
0.19±0.06
, 百拇医药
0.03±0.06
3
1.22±0.06
0.20±0.05
0.04±0.06
4
0.85±0.06
0.23±0.06
0.04±0.06
6
0.76±0.06
0.26±0.06
, 百拇医药
0.05±0.06
8
0.65±0.06
0.38±0.05
0.06±0.05
12
0.50±0.06
0.27±0.06
0.06±0.06
24
0.11±0.05
0.25±0.06
, 百拇医药
0.05±0.06
30
0.08±0.06
0.22±0.05
0.04±0.06
48
0.04±0.06
0.20±0.06
0.03±0.05
72
<0.03
<0.04
, 百拇医药
<0.02
2.3 检测限的测定 精密称取氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定适量，分别制成含量为0.27，0.11，0.22ng.ml-1标准溶液。各取2.00ml加入空白血浆(2ml)中，按上述方法进行处理、测定(除电流灵敏度调为0.1μA.V-1外，其他条件不变)。结果分别在-0.600V、-0.590V、-0.645V处仍能出现SDPP峰，表明氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定的检测限分别可达0.27，0.11，0.22ng.ml-1。3 讨论
在本实验条件下，氯氮及其两种代谢物的SDPP峰电位及薄层层析中的Rf可做它们的定性参考。本法用于血浆中氯氮及其代谢物(去甲基氯氮、去甲氧安定)的检测限分别为：0.27，0.11，0.22ng.ml-1故可用于其痕量分析。
, 百拇医药
样品残渣用50mmol.L-1硫酸溶解，是因为氯氮及其二种代谢物均可与硫酸形成可溶性盐而溶于水中，而且硫酸起到提供酸性环境和支持电解质的作用，均有利于SDPP测定。
本法是在一阶导数差示脉冲极谱法[2]基础上研究建立的一种新的测试的分析新技术[1]，除用于本品及其代谢物的测定外，还可用于氟尿嘧啶、红霉素、地塞米松磷酸钠、西咪替丁、咖啡因、醋酸氟氢可的松、抗生素类及中草药有效成分[3.4]的定量分析。
参考文献
1 梁云爱，张天民.二阶导数差示脉冲极谱法的建立及在药物分析中的应用.药学学报，1992，27(2)：157
2 梁云爱，张天民.一阶导数差示脉冲极谱法的建立及在药物分析中的应用.药学学报，1992，27(2)：135
, http://www.100md.com
3 Liang Yunai，Wang Jie.Studies on quantiative determination of antibiotics by the derivative differential pulse polarography.J Chin Pharm Sci, 1999,8(2):86
4 Liang Yunai.Studies on quantitative determination of active principles in Chinese herbal medicine by second derivative differential pulse polarography.J Chin Pharm Sci,1997,6(4):154
收稿日期：1998年11月10日, 百拇医药
单位：(赵声明)卫生部北京医院 北京 100730；(李梦 梁云爱)山东省日照市药品检验所；(臧华)中国人民解放军第302医院
关键词：二阶导数差示脉冲极谱法，血浆，氯氮，代谢物
中国医院药学杂志991207
摘要 目的:测定血浆中氯氮及其主要代谢物的含量。方法:血浆用乙醚提取，经薄层层析分离，分别洗脱，残渣溶于50mmol.L-1H2SO4水溶液中，用二阶导数差示脉冲极谱法测定。结果:氯氮及其代谢物(Ⅰ、Ⅱ)的二阶导数差示脉冲极谱峰电位分别为：-0.600V、-0.590V、-0.645V，检测限分别为：0.27，0.11，0.22ng.ml-1。结论:该法简便、快速、灵敏，结果准确。
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关键词 氯氮
Study on quantitative determination of
chlordiazepoxide and its metabolite in blood by
secondary derivative differential pulse polarography
Zhao Shengming Li Meng Liang Yunai et al
Beijing Hospital of the Ministry of the Public Health,Beijing 100730
ABSTRACT OBJECTIVE：To determine the content of chlordiazepoxide and its metbolite in blood.METHODS：The blood sample was first purified by ethey,then separated by thin-layer chromatography, residue was dissoled in 50 mmol.L-1 sulfuric acid-water solution, and then determined by secondary derivative differential pulse polarography.RESULTS：Secondary derivative differential pulse polarogram peak of chlordiazepoxide and its metabolite (Ⅰ、Ⅱ) was -0.600V,-0.590V and -0.645V.The detection limit was 0.27，0.11 and 0.22 ng.ml-1.CONCLUSION：This method is simple,rapid and sensitive.The result is accurate.
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KEY WORDS secondary derivative differential pulse polarography,plasma,chlordiazepoxids, metabolite
氯氮是临床上常用的抗焦虑、抗惊厥药。但该药可导致依赖性，并且毒性较强，若服用过量，可导致急性中毒，重者可导致昏迷甚至死亡。由于氯氮服用量较小，体液中浓度较低，其代谢物与原药化学结构相似，大多仍具有药理活性，要求检测方法必须灵敏度较高，并且原药品及其代谢物均能测出，故其体内药物检测具有一定难度。本文采用二阶导数差示脉冲极谱法(SDPP)[1]对人体血浆中氯氮及其主要代谢物进行了定量研究，操作简便、快速、灵敏、结果准确，对本品的血药浓度监控及其毒理学、药物动力学的研究具有实用价值。
1 方法
1.1 仪器 DP-A型微分脉冲极谱仪(山东日照市药品检验所与中科院大气物理研究所联合研制，1995年获得联合国TIPS发明创新科技之星奖)。
, 百拇医药
1.2 药品与试剂 氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定标准品(中国药品生物制品检定所)；薄层层析用硅胶(青岛海洋化工厂)；试剂均为分析纯；实验用水为去离子双蒸馏水。1mol.L-1磷酸盐缓冲液(pH9.0)：称取磷酸氢二钾174.17g、磷酸二氢钾2.00g，置1000ml量瓶中，加水溶解，定容。50mmol.L-1硫酸液：精密量取硫酸3.00ml，移入装有约600ml水的1000ml量瓶中，冷至室温，加水定容。
1.3 血样处理 取血浆样品2ml，置15ml的具塞玻璃离心管中，加水1ml、磷酸盐缓冲液(pH9.0)2ml、乙醚7ml，于旋涡混合器上混合10min，置离心机上以2000r.min-1离心5min，将乙醚吸出，于45℃水浴中蒸干。
1.4 极谱条件 将仪器功能置SDPP处，选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为28s,Ag/AgCl电极为参比电极，内装1mol.L-1KCl参比溶液，微铂电极为辅助电极，预置电压为-0.400V，扫描范围为-0.400～-0.800V，脉冲振幅为40mV，扫描速度为150mV.s-1，电流灵敏度为5μA.V-1。
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1.5 测定方法 用乙醚100μl溶解残渣，点样于20cm×20cm硅胶薄层板上。用氯仿∶丙酮(6∶4)展开剂展开至溶液前沿约15cm时为止。将板置紫外灯下观察，可见3个斑点：氯氮卓(Rf=0.20)，去甲基氯氮(Rf=0.05)，去甲氧安定(Rf=0.33)。将3个斑点(连同硅胶吸附剂)分别刮下，置3支15ml离心管中，加甲醇5ml，置旋涡混合器上混合30s，以2000r.min-1的速度离心5min，取上清液移入15ml具塞玻璃离心管中，在65℃水浴上蒸干，加50mmol.L-1盐酸液8.00ml，混匀，加入极谱池中，富集5min，分别在上述极谱条件下，自-0.400～-0.800V以150mV.s-1的速度进行阴极扫描。精密称取氯氮(A)、去甲基氯氮(B)、去甲氧安定(C)标准品适量，用氯仿制成含A为200μg.ml-1、B为150μg.ml-1、C为10μg.ml-1的溶液。按1.3和1.5项处理和扫描，得A、B、C标准品的SDPP图，见图1。取空白血浆2ml，按1.3项处理，加50mmol.L-1盐酸溶液8.00ml，混匀，加入极谱池中，富集5min，在1.4项极谱条件下扫描，得空白血浆的SDPP图。取空白血浆2ml，精密加入A、B、C标准品适量，制成含A为200μg.ml-1、B为150μg.ml-1、C为12μg.ml-1的血浆混合液，按1.3和1.5项处理后，在1.4极谱条件下扫描，得A、B、C的SDPP图。
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图1 氯氮(A)、去甲基氯氮(B)和去甲氧安定(C)的SDPP图
2 结果
2.1 线性试验 分别精密称取3种对照品适量，用氯仿制成含氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定分别为：0.01，0.05，0.5，5.0，50.0，100，150，200，250，300μg.ml-1；0.01，0.40，4.0，20，40，60，80，100，150，200μg.ml-1；0.01，0.025，0.05，0.10，1.00，2.5，5.0，7.5，10.0，20.0μg.ml-1的系列标准溶液。取空白血浆33份(其中3份做每种标准品的空白对照)，每份2ml分别加入上述3种标准品的溶液2ml，按1.3项下处理、测定。实验结果表明，在此范围内，氯氮及其代谢物的浓度C与其SDPP峰幅值d2i/dE2(mm)呈线性关系(P<0.01)。根据实验结果，求出回归方程为：
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氯氮：C=5.0731d2i/dE2-19.1188(r=0.9999,n=10,P<0.01)
去甲基氯氮：C=4.5308d2i/dE2-1.5095(r=0.9985,n=10,P<0.01)
去甲氧安定：C=5.1076d2e/dE2-0.0333(r=0.9999,n=10,P<0.01)
氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定的标准曲线范围分别为：0.01～300，0.01～200，0.01～20μg.ml-1。
2.2 样品测定 用上述方法测定了口服单剂量(20mg)的氯氮于72h内血浆中氯氮及其主要代谢物(去甲基氯氮、去甲氧安定)的含量，结果见表1。
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表1 氯氮及其主要代谢物的血药浓度(μg.ml-1，±s,n=6) 时间/h
氯氮
去甲基氯氮
去甲氧安定
1
1.04±0.06
0.05±0.05
0.02±0.06
2
1.42±0.06
0.19±0.06
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1.22±0.06
0.20±0.05
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0.26±0.06
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0.06±0.05
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0.27±0.06
0.06±0.06
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0.20±0.06
0.03±0.05
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2.3 检测限的测定 精密称取氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定适量，分别制成含量为0.27，0.11，0.22ng.ml-1标准溶液。各取2.00ml加入空白血浆(2ml)中，按上述方法进行处理、测定(除电流灵敏度调为0.1μA.V-1外，其他条件不变)。结果分别在-0.600V、-0.590V、-0.645V处仍能出现SDPP峰，表明氯氮、去甲基氯氮、去甲氧安定的检测限分别可达0.27，0.11，0.22ng.ml-1。3 讨论
在本实验条件下，氯氮及其两种代谢物的SDPP峰电位及薄层层析中的Rf可做它们的定性参考。本法用于血浆中氯氮及其代谢物(去甲基氯氮、去甲氧安定)的检测限分别为：0.27，0.11，0.22ng.ml-1故可用于其痕量分析。
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样品残渣用50mmol.L-1硫酸溶解，是因为氯氮及其二种代谢物均可与硫酸形成可溶性盐而溶于水中，而且硫酸起到提供酸性环境和支持电解质的作用，均有利于SDPP测定。
本法是在一阶导数差示脉冲极谱法[2]基础上研究建立的一种新的测试的分析新技术[1]，除用于本品及其代谢物的测定外，还可用于氟尿嘧啶、红霉素、地塞米松磷酸钠、西咪替丁、咖啡因、醋酸氟氢可的松、抗生素类及中草药有效成分[3.4]的定量分析。
参考文献
1 梁云爱，张天民.二阶导数差示脉冲极谱法的建立及在药物分析中的应用.药学学报，1992，27(2)：157
2 梁云爱，张天民.一阶导数差示脉冲极谱法的建立及在药物分析中的应用.药学学报，1992，27(2)：135
, http://www.100md.com
3 Liang Yunai，Wang Jie.Studies on quantiative determination of antibiotics by the derivative differential pulse polarography.J Chin Pharm Sci, 1999,8(2):86
4 Liang Yunai.Studies on quantitative determination of active principles in Chinese herbal medicine by second derivative differential pulse polarography.J Chin Pharm Sci,1997,6(4):154
收稿日期：1998年11月10日, 百拇医药