高效液相色谱法测定昆明山海棠搽剂的体外透皮吸收
作者：颉江敏 蒲家志 马文玺 刘贤荣
单位：
(颉江敏蒲家志)遵义医学院化学教研室 遵义 563003；(马文玺刘贤荣)遵义医学院第一附属医院
关键词：高效液相色谱法，昆明山海棠搽剂，透皮吸收，雷公滕内酯醇，月桂氮酮
中国医院药学杂志991215
摘要 目的:建立高效液相色谱法(HPLC法)测定昆明山海棠搽剂体外透皮吸收方法并研究制剂中月桂氮酮的最佳用量。方法:以HPLC法测定雷公藤内酯醇(以下简称甲素)含量。结果:回归方程为Y=0.3265X+0.0266(r=0.9986，n=5)。日内RSD为0.5%(n=5)；日间RSD为1.2%(n=5)；方法的平均回收率为(92～98)%，RSD≤1.4%(n=5)。月桂氮酮的最佳用量为2.0%，稳态透皮速率J=0.46μg.cm-1.h-1。结论:HPLC法简单易行，可用于甲素含量测定和透皮吸收研究。
, 百拇医药
关键词 月桂氮酮
HPLC assay for permeability in vitro through excised
rat skin of the liniment of T.hypoglacum (Levl.) Hutch
Jie Jiangmin Pu Jiazhi Ma Wenxi et al
Department of Chemistry,Zunyi Medical College,Zunyi 563003
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish HPLC method to assay for permeability in vitro through excised rat skin of triptolide in the Liniment of T.hypoglacum (Lev1.)Hutch,and to decide an amount of azone.METHODS：The concentration of triptolide was determined by HPLC method. RESULTS：The results showed that the linear relationship was obtained between the concentration of triptolide and the peak area ration in the range of (10.0～100.0) μg.ml-1(r=0.998 6，n=5).The RSD of within-day were 0.5% (n=5)，and between-day 1.2%(n=5).The mean recovery were (92～98)%,RSD≤1.4%(n=5).The experiment showed that the quantity of azone were 2.0% in the best,J=0.46 μg.cm-2.ml-1.CONCLUSION：The HPLC method is simple,it was suitable to detect the concentration of triptolide and to study the permeability of the Liniment in vitro.
, 百拇医药
KEY WORDS HPLC,Liniment of T.hypoglacum (Lev1.)Hutch,permeability,triptolide,azone
昆明山海棠[tripterygium hypoglacum (Leve.) Hutch]在临床上用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、多种免疫性疾病等[1]。前文[2]报道了昆明山海棠搽剂的研制及质量控制，保证了批量生产时主要有效成分差异在允许范围之内。为了研究主要有效成分之一的二萜内酯(diterpenoids)的含量，控制用量，避免首过效应，减少毒副反应，同时探索透皮吸收促进剂月桂氮酮(以下简称氮酮)的最佳用量[3.4]，我们建立了HPLC法测定体外透皮吸收量，研究了不同含量氮酮的体外透皮吸收率。现将方法及结果报道如下。
1 仪器和试剂
1.1 仪器和材料 高效液相色谱仪为LC-10A型，配SPD-6AV紫外检测器和C-R4V数据处理器(日本岛津公司)；Franz扩散池(自制)；SD大白鼠(本院医学动物实验中心提供)。
, http://www.100md.com
1.2 药品和试剂 昆明山海棠采自贵州省独山县，经省中医研究所鉴定。原料雷公藤内酯醇(以下简称甲素)按文献[2]报道方法提取并提纯，含量≥98%。搽剂由我院药厂试生产，甲素标准品由福建省医学科学研究所惠赠。水溶性氮酮(新乡高金化学有限公司)。甲醇为光谱纯，水为三重蒸馏水；其它试剂均为国产分析纯。
2 方法和结果
2.1 HPLC法的建立
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Nucleosil球形硅胶键合-C18，150mm×4.6mm，5μm(大连化学物理研究所)；流动相：甲醇-水-磷酸(25∶75∶0.2)；流速：0.8ml.min-1；内标物为松香酸乙酯；检测波长：254nm；测定温度：室温。
2.1.2 色谱行动评价 按搽剂处方精密称取分离提纯的有效成分，加入流动相溶解，加入内标物使其浓度为5.0μg.ml-1。进样后测得松香酸乙酯的保留时间为6.8min，甲素的保留时间为8.4min，两峰的分离度为2.0，分析峰无任何干扰，分离时间短，分离效果好。
, http://www.100md.com
2.1.3 标准曲线和线性范围 用甲素标准品配制储备液，使其浓度为10.0μg.ml-1，内标物精密称重，配制成浓度为50.0μg.ml-1的内标液。分别准确量取1.0，2.0，3.0，4.0和5.0ml储备液于10.0ml容量瓶中，各加入内标液1.0ml，用流动相稀释，磷酸调节pH为7.2后定容。取10.0μl进样，以甲素的浓度为横坐标，甲素和内标物的峰面积比为纵坐标，两者线性相关，回归方程为：Y=0.3265X+0.0266，r=0.9986(n=5)。线性范围为1.0～100.0μg.ml-1，最低检出浓度为5.0×102μg.ml-1。
2.1.4 方法精密度试验 分别准确量取储备液5.0，10.0和20.0ml于50.0ml容量瓶中，加入内标液各1.0ml，按2.1.3步骤测定峰面积比，日内每隔2h测5次，取平均值，共测5批。日间同法测定5次，连续测5d，结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 方法精密度试验结果(n=5) 批号
日内测得值
μg.ml-1
RSD
%
日内测得值
μg.ml-1
RSD
%
1
0.98±0.03
, 百拇医药 1.6
1.02±0.04
1.1
2
2.06±0.08
0.2
1.95±0.12
0.8
3
3.87±0.22
1.4
4.12±0.33
1.5
, 百拇医药
2.1.5 方法回收率试验 精密称取一定量的甲素，按比例添加搽剂处方中的其余部分。按2.1.3步骤处理，进样测定峰面积比，结果见表2。表2 方法回收率试验结果(n=3) 批号
加入量
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
RSD
%
1
, http://www.100md.com
20.0
19.6
98.0
1.6
2
25.0
24.4
97.6
0.8
3
30.0
28.6
95.3
, http://www.100md.com
1.2
4
35.0
32.4
92.6
1.5
5
40.0
38.6
96.5
0.8
2.2 体外透皮释药量测定
2.2.1 离体皮肤制备 SD种大白鼠，♀♂不拘，鼠龄5～7周。用脱毛霜除去腹部毛后处死，立即剥离皮肤，去净皮下脂肪，生理盐水洗净备用。
, 百拇医药
2.2.2 接收液选择 分别选用生理盐水、甲醇、甲醇-水(1∶1)和流动相作为接收液，测定12h累积透皮释药量。考虑到主要有效成分的溶解度和在接收液中的稳定性，选定甲醇-水(1∶1)作为接收液。
2.2.3 体外透皮试验 用超级恒温水浴锅改制成Franz扩散池。内锅(自制)中放入磁力搅拌器，其上放接收器，内装接收液65.0ml。取鼠皮固定在接收器上，水浴恒温37℃。于皮肤角质层面加入搽剂(含2%azone)20.0ml。每隔2h取样1次，每次取样2.0ml。及时补充接收液，共测6次。接收液加入内标液1.0ml，用流动相稀释，磷酸调节pH为7.2后定容。取10.0μl进样测定，按下列校正公式计算累积透皮吸收百分率：Q%=CV/QT×100%
Q为t时间的累积透皮吸收量；C为接收液中甲素的浓度；V为接收液的总体积；QT为搽剂中甲素的含量。测定结果见表3。
表3 体外透皮吸收测定结果(n=3) t/h
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Q/%
RSD/%
t/h
Q/%
RSD/%
2
18.4
0.4
8
45.0
1.1
4
30.2
, 百拇医药
1.2
10
52.3
1.0
6
38.6
0.8
12
58.6
0.6
实验表明，单位面积累积透皮吸收量Qs与渗透时间有较好的线性关系(2h≤t≤24h)，线性方程为：Q=13.15-3.91t(r=0.9930)。
2.2.4 体外透皮回收率实验 搽剂中加入精密称重的甲素，按2.2.3步骤测定累积透皮吸收量Q，结果见表4。表4 体外透皮吸收回收率试验结果(n=3) 批号
, 百拇医药
加入量
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
RSD
%
1
30.0
28.6
95.3
, 百拇医药
1.2
2
40.0
37.4
93.5
1.4
3
50.0
48.3
96.6
0.9
4
60.0
, 百拇医药
55.7
92.8
0.7
5
80.0
68.8
98.5
1.1
2.3 氮酮用量试验 分别配制含氮酮0%，1%，2%，4%，5%和8%的搽剂，其余成分不变。按2.2.3步骤测定单位面积透皮吸收Qs，结果见表5。表5 不同用量氮酮促渗作用比较结果 azone/%
Qs/μg.cm-2
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J/μg.cm-2.h-1
0
6.72
0.45
1
15.4
1.26
2
41.3
3.53
4
36.0
, 百拇医药
3.02
5
39.2
3.26
8
35.8
2.98
3 讨论
文献报道，甲素的含量测定方法有紫外可见分光光度法、薄层扫描法等。本文建立了HPLC法，选用松香酸乙酯作为内标物，甲醇-水-磷酸(25∶75∶0.2)为流动相。实验表明，搽剂和透皮接收液的色谱行为非常相似，两峰分离完全，无明显杂质干扰峰，保留时间短，测定结果准确度高，适宜于甲素的含量测定和透皮吸收研究。
, 百拇医药 实验结果表明，在开始2h内透皮释药速率较快，2h后稳定，提示应控制制剂中甲素的含量。单位面积累积透皮吸收量Qs与时间t呈线性关系，搽剂的渗透符合零级动力学过程，该直线的斜率即为稳态透皮速率J(单位时间透过单位面积的药物量)。
氮酮对甲素有明显的促渗透作用。实验表明，含2%的氮酮时促渗作用最强。与不含氮酮的搽剂相比，累积透皮吸收量增大了9倍多，J由0.45增大到3.53，增大了近8倍。文献报道[5]，1，2-丙二醇与氮酮的二组分体系有很好的协同作用。为此，我们进行了正交试验以研究搽剂的最佳配方，其结果另文报道。
参考文献
1 王翠娣，郭玉璞.雷公藤的有效成分、药理及临床应用.中国中西医结合杂志，1993，13(8)：507
2 马文玺，颉江敏.昆明山海棠搽剂的研制和质量控制.中国药学杂志，1998，33(8)：476
, 百拇医药
3 梁秉文主编.经皮给药制剂.北京：中国医药科技出版社，1992：21
4 Xie RJ,Zhang SN.Effect of azone on penetration of rhizoma corydalis extraction through Rat skin.中国药科大学学报，1995，26(2)：78
5 Zhang EJ,Fu KH.The effect of azone and 1,2-propanediol on enternal percutanous permeability of metronidazole solution.华西药学杂志，1995，10(2)：73
收稿日期：1999年1月9日, http://www.100md.com
单位：
(颉江敏蒲家志)遵义医学院化学教研室 遵义 563003；(马文玺刘贤荣)遵义医学院第一附属医院
关键词：高效液相色谱法，昆明山海棠搽剂，透皮吸收，雷公滕内酯醇，月桂氮酮
中国医院药学杂志991215
摘要 目的:建立高效液相色谱法(HPLC法)测定昆明山海棠搽剂体外透皮吸收方法并研究制剂中月桂氮酮的最佳用量。方法:以HPLC法测定雷公藤内酯醇(以下简称甲素)含量。结果:回归方程为Y=0.3265X+0.0266(r=0.9986，n=5)。日内RSD为0.5%(n=5)；日间RSD为1.2%(n=5)；方法的平均回收率为(92～98)%，RSD≤1.4%(n=5)。月桂氮酮的最佳用量为2.0%，稳态透皮速率J=0.46μg.cm-1.h-1。结论:HPLC法简单易行，可用于甲素含量测定和透皮吸收研究。
, 百拇医药
关键词 月桂氮酮
HPLC assay for permeability in vitro through excised
rat skin of the liniment of T.hypoglacum (Levl.) Hutch
Jie Jiangmin Pu Jiazhi Ma Wenxi et al
Department of Chemistry,Zunyi Medical College,Zunyi 563003
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish HPLC method to assay for permeability in vitro through excised rat skin of triptolide in the Liniment of T.hypoglacum (Lev1.)Hutch,and to decide an amount of azone.METHODS：The concentration of triptolide was determined by HPLC method. RESULTS：The results showed that the linear relationship was obtained between the concentration of triptolide and the peak area ration in the range of (10.0～100.0) μg.ml-1(r=0.998 6，n=5).The RSD of within-day were 0.5% (n=5)，and between-day 1.2%(n=5).The mean recovery were (92～98)%,RSD≤1.4%(n=5).The experiment showed that the quantity of azone were 2.0% in the best,J=0.46 μg.cm-2.ml-1.CONCLUSION：The HPLC method is simple,it was suitable to detect the concentration of triptolide and to study the permeability of the Liniment in vitro.
, 百拇医药
KEY WORDS HPLC,Liniment of T.hypoglacum (Lev1.)Hutch,permeability,triptolide,azone
昆明山海棠[tripterygium hypoglacum (Leve.) Hutch]在临床上用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、多种免疫性疾病等[1]。前文[2]报道了昆明山海棠搽剂的研制及质量控制，保证了批量生产时主要有效成分差异在允许范围之内。为了研究主要有效成分之一的二萜内酯(diterpenoids)的含量，控制用量，避免首过效应，减少毒副反应，同时探索透皮吸收促进剂月桂氮酮(以下简称氮酮)的最佳用量[3.4]，我们建立了HPLC法测定体外透皮吸收量，研究了不同含量氮酮的体外透皮吸收率。现将方法及结果报道如下。
1 仪器和试剂
1.1 仪器和材料 高效液相色谱仪为LC-10A型，配SPD-6AV紫外检测器和C-R4V数据处理器(日本岛津公司)；Franz扩散池(自制)；SD大白鼠(本院医学动物实验中心提供)。
, http://www.100md.com
1.2 药品和试剂 昆明山海棠采自贵州省独山县，经省中医研究所鉴定。原料雷公藤内酯醇(以下简称甲素)按文献[2]报道方法提取并提纯，含量≥98%。搽剂由我院药厂试生产，甲素标准品由福建省医学科学研究所惠赠。水溶性氮酮(新乡高金化学有限公司)。甲醇为光谱纯，水为三重蒸馏水；其它试剂均为国产分析纯。
2 方法和结果
2.1 HPLC法的建立
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Nucleosil球形硅胶键合-C18，150mm×4.6mm，5μm(大连化学物理研究所)；流动相：甲醇-水-磷酸(25∶75∶0.2)；流速：0.8ml.min-1；内标物为松香酸乙酯；检测波长：254nm；测定温度：室温。
2.1.2 色谱行动评价 按搽剂处方精密称取分离提纯的有效成分，加入流动相溶解，加入内标物使其浓度为5.0μg.ml-1。进样后测得松香酸乙酯的保留时间为6.8min，甲素的保留时间为8.4min，两峰的分离度为2.0，分析峰无任何干扰，分离时间短，分离效果好。
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2.1.3 标准曲线和线性范围 用甲素标准品配制储备液，使其浓度为10.0μg.ml-1，内标物精密称重，配制成浓度为50.0μg.ml-1的内标液。分别准确量取1.0，2.0，3.0，4.0和5.0ml储备液于10.0ml容量瓶中，各加入内标液1.0ml，用流动相稀释，磷酸调节pH为7.2后定容。取10.0μl进样，以甲素的浓度为横坐标，甲素和内标物的峰面积比为纵坐标，两者线性相关，回归方程为：Y=0.3265X+0.0266，r=0.9986(n=5)。线性范围为1.0～100.0μg.ml-1，最低检出浓度为5.0×102μg.ml-1。
2.1.4 方法精密度试验 分别准确量取储备液5.0，10.0和20.0ml于50.0ml容量瓶中，加入内标液各1.0ml，按2.1.3步骤测定峰面积比，日内每隔2h测5次，取平均值，共测5批。日间同法测定5次，连续测5d，结果见表1。
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表1 方法精密度试验结果(n=5) 批号
日内测得值
μg.ml-1
RSD
%
日内测得值
μg.ml-1
RSD
%
1
0.98±0.03
, 百拇医药 1.6
1.02±0.04
1.1
2
2.06±0.08
0.2
1.95±0.12
0.8
3
3.87±0.22
1.4
4.12±0.33
1.5
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2.1.5 方法回收率试验 精密称取一定量的甲素，按比例添加搽剂处方中的其余部分。按2.1.3步骤处理，进样测定峰面积比，结果见表2。表2 方法回收率试验结果(n=3) 批号
加入量
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
RSD
%
1
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20.0
19.6
98.0
1.6
2
25.0
24.4
97.6
0.8
3
30.0
28.6
95.3
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1.2
4
35.0
32.4
92.6
1.5
5
40.0
38.6
96.5
0.8
2.2 体外透皮释药量测定
2.2.1 离体皮肤制备 SD种大白鼠，♀♂不拘，鼠龄5～7周。用脱毛霜除去腹部毛后处死，立即剥离皮肤，去净皮下脂肪，生理盐水洗净备用。
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2.2.2 接收液选择 分别选用生理盐水、甲醇、甲醇-水(1∶1)和流动相作为接收液，测定12h累积透皮释药量。考虑到主要有效成分的溶解度和在接收液中的稳定性，选定甲醇-水(1∶1)作为接收液。
2.2.3 体外透皮试验 用超级恒温水浴锅改制成Franz扩散池。内锅(自制)中放入磁力搅拌器，其上放接收器，内装接收液65.0ml。取鼠皮固定在接收器上，水浴恒温37℃。于皮肤角质层面加入搽剂(含2%azone)20.0ml。每隔2h取样1次，每次取样2.0ml。及时补充接收液，共测6次。接收液加入内标液1.0ml，用流动相稀释，磷酸调节pH为7.2后定容。取10.0μl进样测定，按下列校正公式计算累积透皮吸收百分率：Q%=CV/QT×100%
Q为t时间的累积透皮吸收量；C为接收液中甲素的浓度；V为接收液的总体积；QT为搽剂中甲素的含量。测定结果见表3。
表3 体外透皮吸收测定结果(n=3) t/h
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Q/%
RSD/%
t/h
Q/%
RSD/%
2
18.4
0.4
8
45.0
1.1
4
30.2
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1.2
10
52.3
1.0
6
38.6
0.8
12
58.6
0.6
实验表明，单位面积累积透皮吸收量Qs与渗透时间有较好的线性关系(2h≤t≤24h)，线性方程为：Q=13.15-3.91t(r=0.9930)。
2.2.4 体外透皮回收率实验 搽剂中加入精密称重的甲素，按2.2.3步骤测定累积透皮吸收量Q，结果见表4。表4 体外透皮吸收回收率试验结果(n=3) 批号
, 百拇医药
加入量
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
RSD
%
1
30.0
28.6
95.3
, 百拇医药
1.2
2
40.0
37.4
93.5
1.4
3
50.0
48.3
96.6
0.9
4
60.0
, 百拇医药
55.7
92.8
0.7
5
80.0
68.8
98.5
1.1
2.3 氮酮用量试验 分别配制含氮酮0%，1%，2%，4%，5%和8%的搽剂，其余成分不变。按2.2.3步骤测定单位面积透皮吸收Qs，结果见表5。表5 不同用量氮酮促渗作用比较结果 azone/%
Qs/μg.cm-2
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J/μg.cm-2.h-1
0
6.72
0.45
1
15.4
1.26
2
41.3
3.53
4
36.0
, 百拇医药
3.02
5
39.2
3.26
8
35.8
2.98
3 讨论
文献报道，甲素的含量测定方法有紫外可见分光光度法、薄层扫描法等。本文建立了HPLC法，选用松香酸乙酯作为内标物，甲醇-水-磷酸(25∶75∶0.2)为流动相。实验表明，搽剂和透皮接收液的色谱行为非常相似，两峰分离完全，无明显杂质干扰峰，保留时间短，测定结果准确度高，适宜于甲素的含量测定和透皮吸收研究。
, 百拇医药 实验结果表明，在开始2h内透皮释药速率较快，2h后稳定，提示应控制制剂中甲素的含量。单位面积累积透皮吸收量Qs与时间t呈线性关系，搽剂的渗透符合零级动力学过程，该直线的斜率即为稳态透皮速率J(单位时间透过单位面积的药物量)。
氮酮对甲素有明显的促渗透作用。实验表明，含2%的氮酮时促渗作用最强。与不含氮酮的搽剂相比，累积透皮吸收量增大了9倍多，J由0.45增大到3.53，增大了近8倍。文献报道[5]，1，2-丙二醇与氮酮的二组分体系有很好的协同作用。为此，我们进行了正交试验以研究搽剂的最佳配方，其结果另文报道。
参考文献
1 王翠娣，郭玉璞.雷公藤的有效成分、药理及临床应用.中国中西医结合杂志，1993，13(8)：507
2 马文玺，颉江敏.昆明山海棠搽剂的研制和质量控制.中国药学杂志，1998，33(8)：476
, 百拇医药
3 梁秉文主编.经皮给药制剂.北京：中国医药科技出版社，1992：21
4 Xie RJ,Zhang SN.Effect of azone on penetration of rhizoma corydalis extraction through Rat skin.中国药科大学学报，1995，26(2)：78
5 Zhang EJ,Fu KH.The effect of azone and 1,2-propanediol on enternal percutanous permeability of metronidazole solution.华西药学杂志，1995，10(2)：73
收稿日期：1999年1月9日, http://www.100md.com