高效液相色谱法测定血浆中依米配能浓度
作者：胡培希 曹薇 肖红 王成学
单位：武汉市第三医院 武汉 430060
关键词：高效液相色谱法，依米配能，血浆浓度
中国医院药学杂志991203
摘要 目的:建立高效液相色谱分析方法测定血浆中依米配能浓度。方法:血样经甲醇沉淀蛋白，以甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)为流动相，紫外313nm处检测。结果:在1.8～60μg.ml-1浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，r=0.9992，最低检测浓度为1.8μg.ml-1，平均回收率(98.0±5.4)%。结论:该方法快速、简便、灵敏、可行。
, http://www.100md.com Determination of imipenem in plasma by HPLC
Hu Peixi Cao Wei Xiao Hong et al
Department of Pharmacy,The Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430060
ABSTRACT OBJECTIVE：To determine the concentration of imipenem in human plasma.METHODS：The imipenem was extracted with methanol.The mobile phase was methanol 0.2 mol.L-1 boric acid (pH=7.14)(3∶97).The detector was operated at 313 nm.RESULTS：Abetter linearity was obtained from 1.8 μg to 60 μg of imipenem perml for plasma with a good correlation coefficient (r=0.999 2).The limit of detection was 1.8 μg.ml-1 for plasma.CONCLUSION：This method is rapid, simple,sensitive and efficient.
, 百拇医药
KEY WORDS imipenem,HPLC,plasma concentration
泰能作为广谱的β-内酰胺抗菌药，有较好的抗酶性能。其主要成份依米配能(imipenem,Imi)的测定方法，国内尚未见报道。国外曾采用HPLC方法[1]，但实验条件要求高，操作繁琐。为了泰能临床研究的需要，我们建立了专一性好，灵敏度高，操作简便的HPLC法，用于测定人血浆中的Imi浓度。
1 材料和方法
1.1 试药 依米配能对照品(默沙东公司提供)；西司他汀对照品(默沙东公司提供)；泰能(粉针，每瓶100ml含依米配能500mg及等量西司他汀钠盐，默沙东药厂提供，批号V5025，生产期APR.97)；甲醇为色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；硼酸为分析纯，水为重蒸馏水。
1.2 仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，C-R7A数据处理机等。
, 百拇医药
1.3 色谱条件 色谱柱：Shim-packCLC-ODS(ID4.6mm×150mm,10μm)；流动相：甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)；紫外检测波长313nm；柱温室温；流速1ml.min-1；纸速：2.0mm.min-1；AuxRange=2；ATTEN=4。
1.4 Imi标准液制备 精称Imi对照品，以水为溶媒，定容，配成含Imi600，300，150，75，36，18μg.ml-1的系列溶液，置4℃保存。
1.5 样品处理 取血浆0.5ml，加甲醇0.5ml，振摇提取，置冰箱(-25℃)冷冻20min后离心(3000r.min-1)10min，取上清液20μl进样。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Imi色谱行为 色谱图中Imi与其代谢产物分离度好，内源性杂质对测定不产生干扰，基线平稳，保留时间8min。泰能中另一成份西司他汀在测定波长处没有干扰吸收(图1)。
图1 Imi色谱图
a.空白血浆色谱图；b.空白血浆加Imi15.1μg.ml-1色谱图；c.受试者注射Imi4h色谱图
(1)依米配能；(2)依米配能分解产物
2.2 Imi标准曲线 于0.5ml水中，分别精密加入Imi系列浓度的对照液各0.05ml，置旋涡混合器混合均匀，得含Imi60，30，15，7.5，3.6，1.8μg.ml-1的系列对照液，各加甲醇0.5ml，混匀。取20μl作HPLC，以测得的Imi的峰面积对Imi的浓度进行回归，得回归方程(Ⅰ)：C=0.4849+7.8799×10-5A，r=0.9997，线性范围1.8～60μg.ml-1。
, 百拇医药
2.3 Imi的血浆标准曲线 于空白血浆0.5ml中，分别精密加入Imi系列浓度的对照液各0.05ml，置旋涡混合器混合均匀，得含Imi60，30，15，7.5，3.6，1.8μg.ml-1的系列血浆液，各加甲醇0.5ml，按样品处理项下操作。以测得Imi的峰面积对Imi浓度进行回归，得回归方程(Ⅱ)：C=1.1707×10-4-0.4438,r=0.9992，线性范围为1.8～60μg.ml-1，最小检出浓度为1.8μg.ml-1(S/N=2)。
2.4 回收率试验 取已知含Imi浓度为3.6，7.5，30μg.ml-1的血浆样品管各5管，按样品处理项下操作，测定含量，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率试验结果(n=5,±s) 加入量
, 百拇医药
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
平均回收率
%
RSD
%
3.6
3.75
±
, http://www.100md.com
0.15
104.2
4.0
7.5
7.43
±
0.21
99.1
98.0±5.4
2.8
30
27.6
±
, 百拇医药
0.7
92.1
2.6
2.5 精密度试验 取已知Imi浓度为3.6，7.5，30μg.ml-1血浆样品管，同一天内进行样品处理，每管进样5次，计算日内差异。同时每一浓度于同一天内测定5次，连续3d，计算日间差异，结果见表2。表2 精密度试验结果(n=5,±s) 加入量
μg.ml-1
日内
日间
测得量
μg.ml-1
, http://www.100md.com
RSD
%
测得量
μg.ml-1
RSD
%
3.6
3.6±0.4
6.2
3.45±0.19
5.6
7.5
, 百拇医药 7.20±0.18
2.4
7.02±0.29
4.1
30
27.5±1.0
3.6
28.2±1.2
4.3
3 讨论
3.1 流动相的选择 Gravaliese[1]用硼酸(0.2mol.L-1，pH7.20)作流动相，在本试验色谱条件下Imi保留时间18min，分析时间过长。我们在流动相中加(3～10)%甲醇，通过增减甲醇的量来调整保留时间。最后选定流动相甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)，保留时间8min，比较合适。
, http://www.100md.com
3.2 提取溶剂的选择 实验中曾选用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、硫酸铝和氢氧化钡溶液等为提取溶剂。后5种溶剂提取不完全或无理想Imi峰，故选用甲醇为提取溶剂，操作简单无需专用设备，结果比低温高速离心过滤方法效果好。该方法[1]血浆回收率为50%，我们用甲醇提取法血浆回收率>90%。
3.3 甲醇提取量的选择 血浆加甲醇提取，我们做了0.5ml∶0.5ml，0.5ml∶0.8ml，0.5ml∶1.0ml系列提取试验。其中0.5ml∶1.0ml提取物回收率稍高，但考虑样品在纯甲醇中不稳定，Imi峰位置和峰强度都有明显变化，故仍选用1∶1量提取。
3.4 Imi的稳定性 Imi具β-内酰胺化学结构，在溶液中、酸碱介质中均不稳定，宜在中性溶液中短期保存。我们用水(pH6.5)、甲醇、磷酸盐缓冲液(pH7.05和pH7.26)、吗啡啉溶液(pH6.0)、磷酸盐缓冲液∶乙二醇(1∶1)溶液等为溶剂配Imi标准液，72h后水中Imi浓度损失10%；磷酸盐缓冲液中损失30%；磷酸盐乙二醇液中损失70%；吗啡啉液中损失90%。结果认为，以水为溶剂较稳定，所配标准液宜在3d内使用。
, 百拇医药
血浆标准液以甲醇提取(1∶1)处理完毕后，宜在1h内进样，损失<10%。
加Imi血浆-25℃存放后，经甲醇提取处理，做HPLC分析。存放24h后Imi含量为原来的85%，存放72h后为原来的80.4%，建议在24h内测定，血浆Imi量损失<15%。
3.5 方法应用 临床测试，受试者实验用药500mg，于100ml液体中静脉输入。输液4h取血，离心取血浆，按样品测定方法处理，20μl作HPLC。其Imi色谱图峰型，峰位置均示有干扰变化(图C)，将测定结果代入回归方程I计算，Imi含量为6.61μg.ml-1。有临床参考价值。
参考文献
1 Gravaliese DA,Musson DG.Determination of imipenem (N-formimidoyl thienamycin) in human plasma and urine by high performance liquid chromatography.Comparison with microbiological methodology and stability.J Chromatography, 1984,310:71
收稿日期：1999年2月10日, 百拇医药
单位：武汉市第三医院 武汉 430060
关键词：高效液相色谱法，依米配能，血浆浓度
中国医院药学杂志991203
摘要 目的:建立高效液相色谱分析方法测定血浆中依米配能浓度。方法:血样经甲醇沉淀蛋白，以甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)为流动相，紫外313nm处检测。结果:在1.8～60μg.ml-1浓度范围内，峰面积与浓度呈良好线性关系，r=0.9992，最低检测浓度为1.8μg.ml-1，平均回收率(98.0±5.4)%。结论:该方法快速、简便、灵敏、可行。
, http://www.100md.com Determination of imipenem in plasma by HPLC
Hu Peixi Cao Wei Xiao Hong et al
Department of Pharmacy,The Third Hospital of Wuhan,Wuhan 430060
ABSTRACT OBJECTIVE：To determine the concentration of imipenem in human plasma.METHODS：The imipenem was extracted with methanol.The mobile phase was methanol 0.2 mol.L-1 boric acid (pH=7.14)(3∶97).The detector was operated at 313 nm.RESULTS：Abetter linearity was obtained from 1.8 μg to 60 μg of imipenem perml for plasma with a good correlation coefficient (r=0.999 2).The limit of detection was 1.8 μg.ml-1 for plasma.CONCLUSION：This method is rapid, simple,sensitive and efficient.
, 百拇医药
KEY WORDS imipenem,HPLC,plasma concentration
泰能作为广谱的β-内酰胺抗菌药，有较好的抗酶性能。其主要成份依米配能(imipenem,Imi)的测定方法，国内尚未见报道。国外曾采用HPLC方法[1]，但实验条件要求高，操作繁琐。为了泰能临床研究的需要，我们建立了专一性好，灵敏度高，操作简便的HPLC法，用于测定人血浆中的Imi浓度。
1 材料和方法
1.1 试药 依米配能对照品(默沙东公司提供)；西司他汀对照品(默沙东公司提供)；泰能(粉针，每瓶100ml含依米配能500mg及等量西司他汀钠盐，默沙东药厂提供，批号V5025，生产期APR.97)；甲醇为色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)；硼酸为分析纯，水为重蒸馏水。
1.2 仪器 岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，C-R7A数据处理机等。
, 百拇医药
1.3 色谱条件 色谱柱：Shim-packCLC-ODS(ID4.6mm×150mm,10μm)；流动相：甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)；紫外检测波长313nm；柱温室温；流速1ml.min-1；纸速：2.0mm.min-1；AuxRange=2；ATTEN=4。
1.4 Imi标准液制备 精称Imi对照品，以水为溶媒，定容，配成含Imi600，300，150，75，36，18μg.ml-1的系列溶液，置4℃保存。
1.5 样品处理 取血浆0.5ml，加甲醇0.5ml，振摇提取，置冰箱(-25℃)冷冻20min后离心(3000r.min-1)10min，取上清液20μl进样。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Imi色谱行为 色谱图中Imi与其代谢产物分离度好，内源性杂质对测定不产生干扰，基线平稳，保留时间8min。泰能中另一成份西司他汀在测定波长处没有干扰吸收(图1)。
图1 Imi色谱图
a.空白血浆色谱图；b.空白血浆加Imi15.1μg.ml-1色谱图；c.受试者注射Imi4h色谱图
(1)依米配能；(2)依米配能分解产物
2.2 Imi标准曲线 于0.5ml水中，分别精密加入Imi系列浓度的对照液各0.05ml，置旋涡混合器混合均匀，得含Imi60，30，15，7.5，3.6，1.8μg.ml-1的系列对照液，各加甲醇0.5ml，混匀。取20μl作HPLC，以测得的Imi的峰面积对Imi的浓度进行回归，得回归方程(Ⅰ)：C=0.4849+7.8799×10-5A，r=0.9997，线性范围1.8～60μg.ml-1。
, 百拇医药
2.3 Imi的血浆标准曲线 于空白血浆0.5ml中，分别精密加入Imi系列浓度的对照液各0.05ml，置旋涡混合器混合均匀，得含Imi60，30，15，7.5，3.6，1.8μg.ml-1的系列血浆液，各加甲醇0.5ml，按样品处理项下操作。以测得Imi的峰面积对Imi浓度进行回归，得回归方程(Ⅱ)：C=1.1707×10-4-0.4438,r=0.9992，线性范围为1.8～60μg.ml-1，最小检出浓度为1.8μg.ml-1(S/N=2)。
2.4 回收率试验 取已知含Imi浓度为3.6，7.5，30μg.ml-1的血浆样品管各5管，按样品处理项下操作，测定含量，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率试验结果(n=5,±s) 加入量
, 百拇医药
μg.ml-1
测得量
μg.ml-1
回收率
%
平均回收率
%
RSD
%
3.6
3.75
±
, http://www.100md.com
0.15
104.2
4.0
7.5
7.43
±
0.21
99.1
98.0±5.4
2.8
30
27.6
±
, 百拇医药
0.7
92.1
2.6
2.5 精密度试验 取已知Imi浓度为3.6，7.5，30μg.ml-1血浆样品管，同一天内进行样品处理，每管进样5次，计算日内差异。同时每一浓度于同一天内测定5次，连续3d，计算日间差异，结果见表2。表2 精密度试验结果(n=5,±s) 加入量
μg.ml-1
日内
日间
测得量
μg.ml-1
, http://www.100md.com
RSD
%
测得量
μg.ml-1
RSD
%
3.6
3.6±0.4
6.2
3.45±0.19
5.6
7.5
, 百拇医药 7.20±0.18
2.4
7.02±0.29
4.1
30
27.5±1.0
3.6
28.2±1.2
4.3
3 讨论
3.1 流动相的选择 Gravaliese[1]用硼酸(0.2mol.L-1，pH7.20)作流动相，在本试验色谱条件下Imi保留时间18min，分析时间过长。我们在流动相中加(3～10)%甲醇，通过增减甲醇的量来调整保留时间。最后选定流动相甲醇-硼酸(0.2mol.L-1，pH7.14)(3∶97)，保留时间8min，比较合适。
, http://www.100md.com
3.2 提取溶剂的选择 实验中曾选用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、硫酸铝和氢氧化钡溶液等为提取溶剂。后5种溶剂提取不完全或无理想Imi峰，故选用甲醇为提取溶剂，操作简单无需专用设备，结果比低温高速离心过滤方法效果好。该方法[1]血浆回收率为50%，我们用甲醇提取法血浆回收率>90%。
3.3 甲醇提取量的选择 血浆加甲醇提取，我们做了0.5ml∶0.5ml，0.5ml∶0.8ml，0.5ml∶1.0ml系列提取试验。其中0.5ml∶1.0ml提取物回收率稍高，但考虑样品在纯甲醇中不稳定，Imi峰位置和峰强度都有明显变化，故仍选用1∶1量提取。
3.4 Imi的稳定性 Imi具β-内酰胺化学结构，在溶液中、酸碱介质中均不稳定，宜在中性溶液中短期保存。我们用水(pH6.5)、甲醇、磷酸盐缓冲液(pH7.05和pH7.26)、吗啡啉溶液(pH6.0)、磷酸盐缓冲液∶乙二醇(1∶1)溶液等为溶剂配Imi标准液，72h后水中Imi浓度损失10%；磷酸盐缓冲液中损失30%；磷酸盐乙二醇液中损失70%；吗啡啉液中损失90%。结果认为，以水为溶剂较稳定，所配标准液宜在3d内使用。
, 百拇医药
血浆标准液以甲醇提取(1∶1)处理完毕后，宜在1h内进样，损失<10%。
加Imi血浆-25℃存放后，经甲醇提取处理，做HPLC分析。存放24h后Imi含量为原来的85%，存放72h后为原来的80.4%，建议在24h内测定，血浆Imi量损失<15%。
3.5 方法应用 临床测试，受试者实验用药500mg，于100ml液体中静脉输入。输液4h取血，离心取血浆，按样品测定方法处理，20μl作HPLC。其Imi色谱图峰型，峰位置均示有干扰变化(图C)，将测定结果代入回归方程I计算，Imi含量为6.61μg.ml-1。有临床参考价值。
参考文献
1 Gravaliese DA,Musson DG.Determination of imipenem (N-formimidoyl thienamycin) in human plasma and urine by high performance liquid chromatography.Comparison with microbiological methodology and stability.J Chromatography, 1984,310:71
收稿日期：1999年2月10日, 百拇医药