乳腺癌AgNOR、DNA倍体、ER、PR及腋淋巴结状况的研究
作者：蒋国勤 张志德 刘根寿
单位：蒋国勤 刘根寿(苏州医学院附属第二医院普外科，苏州，215004)张志德(苏州医学院附属第一医院普外科)
关键词：乳腺癌；核仁组成区嗜银蛋白；DNA；SPF；腋淋巴结；雌激素受体；孕激素受体
苏州医学院学报991212 摘要 目的 探讨乳腺癌本身的生物学特性与腋淋巴结转移的关系。方法 测定32例乳腺癌石蜡标本及12例新鲜标本的核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)、DNA倍体及雌、孕激素受体(ER、PR)，结合腋淋巴结转移状况进行分析。结果 AgNOR、DNA倍体、SPF均反应了乳腺癌的增生活性，而ER、PR仅与乳腺癌的内分泌疗效有关。DNA倍体、SPF在腋淋巴结阳性组明显升高，而AgNOR及ER、PR在腋淋巴结阳性组及阴性组间无显著性差异。结论 DNA倍体、SPF对腋淋巴结状况有一定的预示价值。
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中图法分类 R737.9
To Explore the Association of AgNOR、DNA-Ploid、ER、PR
and Axillary Lymph Node in Breast Cancer
Jiang Guoqing,Zhang Zhide,Liu Genshou
(Department of General Surgery,The Second Hospital Affiliated to S uzhou Medical College,Suzhou,215004)
Abstract Objective To explore the indicator for the positive axillary ly mph node among AgNOR、DNA-Ploid、SPF、ER、PR.Methods AgNOR、DN A-Ploid、SPF、ER、PR were measured in 45 patients with primary infiltrating duc tal breast cancer (phase Ⅱ) and the association between these biological indica tor and the condition of axillary lymph node analyzed.Results A gNOR、DNA-Ploid、SPF reflect the proliferation of breast cancer.ER、PR may only have correlate with the endocrine treatment in some extent and can not reflect the proliferation of breast cancer.The aneuploid and SPF are higher in these pat ients with positive axillary lymph node than that with negative axillary lymph n ode.Between positive axillary lymph node and negative axillary lymph ode,there i s no notable difference (P>0.05) in AgNOR、ER and PR.Conclusion DAN-Ploid and SPF are possible indicator for the condition of axillary lym ph node.
, 百拇医药
Key words breast cancer; DNA-ploid； SPF; AgnNOR; ER; P R; axillary lymph node
在乳腺癌的外科治疗中，腋淋巴结是否转移起着举足轻重的作用。不但决定了手术的方式，也决定了术后的辅助治疗。目前有众多的研究着重于术前来判定腋淋巴结转移状况，而不单纯满足于术后对腋淋巴结的病理诊断。但乳腺癌本身的生物学特性与腋淋巴结转移状况的关系也是一个不容忽视的课题。我们对乳腺癌的核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)、DNA倍体、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及腋淋巴结状况进行了研究，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料：临床Ⅱ期(TNM分期)乳腺癌45例。均为女性，年龄32～70岁。绝经前19例，绝经后26例。所有患者均行乳腺癌根治术，术后腋淋巴结连续切片发现：腋淋巴结转移22例，阴性23例。
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1.2 方法：32例采用石蜡标本，13例采用新鲜标本。
1.2.1 AgNOR的检测：采用Plotom法，在室温下进行。①石蜡块连续4μm切片。②常规脱蜡，去离子水冲洗。③胶质银工作液的配制：将明胶溶于1%蚁酸，使成2%溶液，将此液按1∶2容积与50%硝酸银溶液混合。④将工作液滴于切片上，20℃室温下10～60min，用去离子水冲洗，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在油镜下计数100个细胞内AgNOR数，计算出每个细胞核内AgNOR的均数。
1.2.2 ER、PR测定：按苏州医学院病理解剖学教研室PAP法测定。如镜下阳性细胞≥30%,则ER、PR阳性。
1.2.3 单细胞悬液的制备及DNA含量的检测：①单细胞悬液的制备：新鲜标本13例，采用常规机械法；石蜡标本32例，采用改良的Heldley法。②单细胞悬液DNA染色：采用溴化乙锭和DNA液一步插入性DNA定量荧光染色法。③DNA含量检测：采用流式细胞分析技术，用FACS-440型流式细胞分析仪测定DNA含量及S期细胞百分比(SPF)，控制仪器变异系数(CV)稳定于3%～5%。每个标本检测10000个细胞，DNA含量分析由计算机系统处理，并打印出DNA直方图。新鲜标本采用人正常中、小淋巴细胞作为内插标准。石蜡块DNA含量FCM测定，我们遵循大多数学者的方法，以直方图最左侧的G0/G1峰作为二倍体细胞群。当图中仅有1个G0/G1峰，并有一个相应的G2+M峰时，便认作二倍体。当最左侧G0/G1峰右侧又出现1个以上G0/G1峰，或G2+M峰细胞比率超过20%时，则认作非整倍体。所有二倍体G0/G1峰的CV值均控制在8%以内。DNA指数(DI)=样品细胞G0/G1峰值÷正常人淋巴细胞G0/G1峰值。细胞增生指数(PI)=(G2+M+S)/(G1+M+S)。
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2 结果
2.1 AgNOR含量：正常乳腺上皮细胞核内仅有1～3个圆形散在分布的银染颗粒，而癌细胞的银染颗粒为不规则形，分布不匀或呈聚集状态。我们测定时，对银染颗粒聚集但未完全融合者分别计数。45例乳腺癌的AgNOR范围为3.2～8.36，均值为5.598±1.082。10例正常乳腺的AgNOR范围为0.718～2.102，均值为1.328±0.629，两者有显著性差异(P<0.01)。
2.2 ER、PR：45例乳腺癌中，ER阳性37例(82.22%)，PR阳性32例(71.11%)，胞核ER(ERn)阳性7例(15.56%)，胞核PR(PRn)阳性8例(17.78%)。
2.3 FCM检测：本组乳腺癌DI为0.91～2.05，PI为8.0%～65.3%，SPF为4.9%～40.9%，二倍体19例(42.2%)，异倍体26例(57.8%)，包括亚倍体、三倍体、四倍体、多倍体。提示乳腺癌细胞可能来自不同克隆的干细胞。
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2.4 胞核内各细胞增生活性指标的关系：DNA倍体、AgNOR、SPF、ERn、PRn均反应了乳腺癌细胞核内各种组分的含量并与增生活性有关。表1提示AgNOR高含量组(>5/cell)与低含量组(≤5/cell)间DNA倍体、SPF有显著性差异，而ERn、PRn无显著性差异。提示AgNOR与DNA倍体、SPF一样反应了肿瘤细胞的增生活性，而ERn、PRn不能完全反应肿瘤的恶性程度。
表1 AgNOR与DNA、SPF、ERn(+)、PRn(-)间的关系(n) AgNOR
n
DNA倍体
SPF
ERn
PRn
, http://www.100md.com 二倍体
异倍体
阳性
阴性
阳性
阴性
>5/cell
≤5/cell
25
20
8
14
17
, 百拇医药 6
9.83±4.57
18.62±4.57
2
5
23
15
2
6
23
14
P值
<0.05
, http://www.100md.com <0.01
>0.05
>0.05
2.5 AgNOR、DNA倍体、ER、PR与腋淋巴结状况的关系：见表2。从表2可见，腋淋巴结阳性组乳腺癌的异倍体率、SPF较阴性组有显著性差异，而AgNOR及ER、PR阳性率无显著性差异。
表2 AgNOR、DNA、ER、PR与腋淋巴结转移的关系 生物学指标
n
腋淋巴结
P值
阳性
阴性
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ER(+)
ER(-)
PR(+)
PR(-)
SPF
二倍体
异倍体
AgNOR
37
8
32
12
45
, 百拇医药
20
25
45
17
5
13
9
20.34±10.86
6
16
6.18±1.18
20
3
, 百拇医药
19
4
13.96±9.02
14
9
4.33±1.33
>0.05
>0.05
>0.05
>0.05
<0.05
>0.05
<0.05
, 百拇医药
>0.05
3 讨论
随着分子生物学的发展，目前许多研究着重于从分子水平来评价乳腺癌的恶性程度并指导临床工作。由于DNA是细胞遗传的载体，肿瘤细胞增生活跃，DNA含量增高，就表现为异倍体；肿瘤恶性程度越高，DAN含量越高，SPF值越大，这已成为医学界的共识。我们应用流式细胞分析仪检测乳腺癌细胞异倍体发生率为57.8%，与Horsfall[1]对欧美20份文献综合分析的结论相符，这说明我们的FCM检测达到了国际标准。从表1可见，AgNOR与DNA倍体、SPF一样均反应了乳腺癌细胞的增生活性及其恶性程度。而ER、PR不能反应出细胞的增生活性，这一结论与国外的一些学者相符。但在这点上仍有争议，另一些学者认为DNA倍体与ER水平有明显关系，而且DNA倍体结合ER、PR更能预测乳腺癌内分泌治疗的疗效。我们认为目前结论尚不明确可能与FCM检测标准不同有关。
AgNOR主要是C23、B23和RNA聚合酶I这几种蛋白。细胞内AgNOR含量增加的可能性有以下几种：①细胞增生活跃，致使细胞内核仁分解；②核仁融合缺陷，以致AgNOR分散；③细胞染色体数目增加，相应地携带NOR的染色体数目也增加；④rDNA转录活动增强，使原来不明显的AgNOR变得显著。本组资料中乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的AgNOR含量有显著性差异，这说明AgNOR反应了细胞的增生活性；从表1中可见，AgNOR高含量组与低含量组间异倍体的百分率、SPF值均有显著性差异，这与文献[2]报道相一致，同时提示AgNOR不但可用于乳腺癌良恶性疾病的鉴别，而且能准确反应乳腺癌细胞的恶性程度。表2说明，腋淋巴结阳性组与阴性组DNA倍体、SPF值有显著差异，这符合DNA倍体及SPF作为肿瘤增生活性指标的特点；而这两组间AgNOR值无显著性差异，国外Aubele等[3]也有类似报道，他们采用自动图像分析仪分析了137例浸润性乳腺癌石蜡标本的AgNOR，发现AgNOR与大部分DNA参数、肿瘤大小、TNM分期有关，而与腋淋巴结状况无关。这可能提示了AgNOR技术在乳腺癌中应用的局限性，也可能与AgNOR检测的方法、技术有缺陷有关，值得进一步探讨。但AgNOR作为一个独立的预后指标已见有报道。
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总之，DNA倍体、SPF对腋淋巴结的状况有一定的预示价值。目前来说，AgNOR对腋淋巴结的预示价值尚有疑问。但乳腺原发癌AgNOR测定结合腋淋巴结转移癌AgNOR检测再加上FCM测定DNA倍体、SPF来预测乳腺癌的预后，或许能使银染技术在乳腺癌的诊疗中得到更进一步的应用。腋淋巴结AgNOR含量与腋淋巴结转移的关系也是一个值得探讨的课题。
参考文献
1 Horsfall DJ,et al.Relationship between ploidy and steroid horm one receptors in primary invasive breast cancer.Br J Cancer,1986,53(1)∶23
2 Rzynowska J,et al.AgNOR counts and their combination with flow cytomet ric analyses and clinical parameters as a prognostic indicator in breast carcino ma.Tumori,1997,83(6)∶938
3 Aubele M,et al.Prognostic value of AgNORs in breast cancer.Zentralbl P athol,1994,140(1)∶55
(1999年6月23日收稿), 百拇医药
单位：蒋国勤 刘根寿(苏州医学院附属第二医院普外科，苏州，215004)张志德(苏州医学院附属第一医院普外科)
关键词：乳腺癌；核仁组成区嗜银蛋白；DNA；SPF；腋淋巴结；雌激素受体；孕激素受体
苏州医学院学报991212 摘要 目的 探讨乳腺癌本身的生物学特性与腋淋巴结转移的关系。方法 测定32例乳腺癌石蜡标本及12例新鲜标本的核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)、DNA倍体及雌、孕激素受体(ER、PR)，结合腋淋巴结转移状况进行分析。结果 AgNOR、DNA倍体、SPF均反应了乳腺癌的增生活性，而ER、PR仅与乳腺癌的内分泌疗效有关。DNA倍体、SPF在腋淋巴结阳性组明显升高，而AgNOR及ER、PR在腋淋巴结阳性组及阴性组间无显著性差异。结论 DNA倍体、SPF对腋淋巴结状况有一定的预示价值。
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中图法分类 R737.9
To Explore the Association of AgNOR、DNA-Ploid、ER、PR
and Axillary Lymph Node in Breast Cancer
Jiang Guoqing,Zhang Zhide,Liu Genshou
(Department of General Surgery,The Second Hospital Affiliated to S uzhou Medical College,Suzhou,215004)
Abstract Objective To explore the indicator for the positive axillary ly mph node among AgNOR、DNA-Ploid、SPF、ER、PR.Methods AgNOR、DN A-Ploid、SPF、ER、PR were measured in 45 patients with primary infiltrating duc tal breast cancer (phase Ⅱ) and the association between these biological indica tor and the condition of axillary lymph node analyzed.Results A gNOR、DNA-Ploid、SPF reflect the proliferation of breast cancer.ER、PR may only have correlate with the endocrine treatment in some extent and can not reflect the proliferation of breast cancer.The aneuploid and SPF are higher in these pat ients with positive axillary lymph node than that with negative axillary lymph n ode.Between positive axillary lymph node and negative axillary lymph ode,there i s no notable difference (P>0.05) in AgNOR、ER and PR.Conclusion DAN-Ploid and SPF are possible indicator for the condition of axillary lym ph node.
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Key words breast cancer; DNA-ploid； SPF; AgnNOR; ER; P R; axillary lymph node
在乳腺癌的外科治疗中，腋淋巴结是否转移起着举足轻重的作用。不但决定了手术的方式，也决定了术后的辅助治疗。目前有众多的研究着重于术前来判定腋淋巴结转移状况，而不单纯满足于术后对腋淋巴结的病理诊断。但乳腺癌本身的生物学特性与腋淋巴结转移状况的关系也是一个不容忽视的课题。我们对乳腺癌的核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)、DNA倍体、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及腋淋巴结状况进行了研究，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料：临床Ⅱ期(TNM分期)乳腺癌45例。均为女性，年龄32～70岁。绝经前19例，绝经后26例。所有患者均行乳腺癌根治术，术后腋淋巴结连续切片发现：腋淋巴结转移22例，阴性23例。
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1.2 方法：32例采用石蜡标本，13例采用新鲜标本。
1.2.1 AgNOR的检测：采用Plotom法，在室温下进行。①石蜡块连续4μm切片。②常规脱蜡，去离子水冲洗。③胶质银工作液的配制：将明胶溶于1%蚁酸，使成2%溶液，将此液按1∶2容积与50%硝酸银溶液混合。④将工作液滴于切片上，20℃室温下10～60min，用去离子水冲洗，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在油镜下计数100个细胞内AgNOR数，计算出每个细胞核内AgNOR的均数。
1.2.2 ER、PR测定：按苏州医学院病理解剖学教研室PAP法测定。如镜下阳性细胞≥30%,则ER、PR阳性。
1.2.3 单细胞悬液的制备及DNA含量的检测：①单细胞悬液的制备：新鲜标本13例，采用常规机械法；石蜡标本32例，采用改良的Heldley法。②单细胞悬液DNA染色：采用溴化乙锭和DNA液一步插入性DNA定量荧光染色法。③DNA含量检测：采用流式细胞分析技术，用FACS-440型流式细胞分析仪测定DNA含量及S期细胞百分比(SPF)，控制仪器变异系数(CV)稳定于3%～5%。每个标本检测10000个细胞，DNA含量分析由计算机系统处理，并打印出DNA直方图。新鲜标本采用人正常中、小淋巴细胞作为内插标准。石蜡块DNA含量FCM测定，我们遵循大多数学者的方法，以直方图最左侧的G0/G1峰作为二倍体细胞群。当图中仅有1个G0/G1峰，并有一个相应的G2+M峰时，便认作二倍体。当最左侧G0/G1峰右侧又出现1个以上G0/G1峰，或G2+M峰细胞比率超过20%时，则认作非整倍体。所有二倍体G0/G1峰的CV值均控制在8%以内。DNA指数(DI)=样品细胞G0/G1峰值÷正常人淋巴细胞G0/G1峰值。细胞增生指数(PI)=(G2+M+S)/(G1+M+S)。
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2 结果
2.1 AgNOR含量：正常乳腺上皮细胞核内仅有1～3个圆形散在分布的银染颗粒，而癌细胞的银染颗粒为不规则形，分布不匀或呈聚集状态。我们测定时，对银染颗粒聚集但未完全融合者分别计数。45例乳腺癌的AgNOR范围为3.2～8.36，均值为5.598±1.082。10例正常乳腺的AgNOR范围为0.718～2.102，均值为1.328±0.629，两者有显著性差异(P<0.01)。
2.2 ER、PR：45例乳腺癌中，ER阳性37例(82.22%)，PR阳性32例(71.11%)，胞核ER(ERn)阳性7例(15.56%)，胞核PR(PRn)阳性8例(17.78%)。
2.3 FCM检测：本组乳腺癌DI为0.91～2.05，PI为8.0%～65.3%，SPF为4.9%～40.9%，二倍体19例(42.2%)，异倍体26例(57.8%)，包括亚倍体、三倍体、四倍体、多倍体。提示乳腺癌细胞可能来自不同克隆的干细胞。
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2.4 胞核内各细胞增生活性指标的关系：DNA倍体、AgNOR、SPF、ERn、PRn均反应了乳腺癌细胞核内各种组分的含量并与增生活性有关。表1提示AgNOR高含量组(>5/cell)与低含量组(≤5/cell)间DNA倍体、SPF有显著性差异，而ERn、PRn无显著性差异。提示AgNOR与DNA倍体、SPF一样反应了肿瘤细胞的增生活性，而ERn、PRn不能完全反应肿瘤的恶性程度。
表1 AgNOR与DNA、SPF、ERn(+)、PRn(-)间的关系(n) AgNOR
n
DNA倍体
SPF
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异倍体
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2.5 AgNOR、DNA倍体、ER、PR与腋淋巴结状况的关系：见表2。从表2可见，腋淋巴结阳性组乳腺癌的异倍体率、SPF较阴性组有显著性差异，而AgNOR及ER、PR阳性率无显著性差异。
表2 AgNOR、DNA、ER、PR与腋淋巴结转移的关系 生物学指标
n
腋淋巴结
P值
阳性
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ER(+)
ER(-)
PR(+)
PR(-)
SPF
二倍体
异倍体
AgNOR
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3 讨论
随着分子生物学的发展，目前许多研究着重于从分子水平来评价乳腺癌的恶性程度并指导临床工作。由于DNA是细胞遗传的载体，肿瘤细胞增生活跃，DNA含量增高，就表现为异倍体；肿瘤恶性程度越高，DAN含量越高，SPF值越大，这已成为医学界的共识。我们应用流式细胞分析仪检测乳腺癌细胞异倍体发生率为57.8%，与Horsfall[1]对欧美20份文献综合分析的结论相符，这说明我们的FCM检测达到了国际标准。从表1可见，AgNOR与DNA倍体、SPF一样均反应了乳腺癌细胞的增生活性及其恶性程度。而ER、PR不能反应出细胞的增生活性，这一结论与国外的一些学者相符。但在这点上仍有争议，另一些学者认为DNA倍体与ER水平有明显关系，而且DNA倍体结合ER、PR更能预测乳腺癌内分泌治疗的疗效。我们认为目前结论尚不明确可能与FCM检测标准不同有关。
AgNOR主要是C23、B23和RNA聚合酶I这几种蛋白。细胞内AgNOR含量增加的可能性有以下几种：①细胞增生活跃，致使细胞内核仁分解；②核仁融合缺陷，以致AgNOR分散；③细胞染色体数目增加，相应地携带NOR的染色体数目也增加；④rDNA转录活动增强，使原来不明显的AgNOR变得显著。本组资料中乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的AgNOR含量有显著性差异，这说明AgNOR反应了细胞的增生活性；从表1中可见，AgNOR高含量组与低含量组间异倍体的百分率、SPF值均有显著性差异，这与文献[2]报道相一致，同时提示AgNOR不但可用于乳腺癌良恶性疾病的鉴别，而且能准确反应乳腺癌细胞的恶性程度。表2说明，腋淋巴结阳性组与阴性组DNA倍体、SPF值有显著差异，这符合DNA倍体及SPF作为肿瘤增生活性指标的特点；而这两组间AgNOR值无显著性差异，国外Aubele等[3]也有类似报道，他们采用自动图像分析仪分析了137例浸润性乳腺癌石蜡标本的AgNOR，发现AgNOR与大部分DNA参数、肿瘤大小、TNM分期有关，而与腋淋巴结状况无关。这可能提示了AgNOR技术在乳腺癌中应用的局限性，也可能与AgNOR检测的方法、技术有缺陷有关，值得进一步探讨。但AgNOR作为一个独立的预后指标已见有报道。
, http://www.100md.com
总之，DNA倍体、SPF对腋淋巴结的状况有一定的预示价值。目前来说，AgNOR对腋淋巴结的预示价值尚有疑问。但乳腺原发癌AgNOR测定结合腋淋巴结转移癌AgNOR检测再加上FCM测定DNA倍体、SPF来预测乳腺癌的预后，或许能使银染技术在乳腺癌的诊疗中得到更进一步的应用。腋淋巴结AgNOR含量与腋淋巴结转移的关系也是一个值得探讨的课题。
参考文献
1 Horsfall DJ,et al.Relationship between ploidy and steroid horm one receptors in primary invasive breast cancer.Br J Cancer,1986,53(1)∶23
2 Rzynowska J,et al.AgNOR counts and their combination with flow cytomet ric analyses and clinical parameters as a prognostic indicator in breast carcino ma.Tumori,1997,83(6)∶938
3 Aubele M,et al.Prognostic value of AgNORs in breast cancer.Zentralbl P athol,1994,140(1)∶55
(1999年6月23日收稿), 百拇医药