抗人尿激酶受体单克隆抗体的制备与鉴定
作者：白霞 奚晓东 徐杰 阮长耿
单位：苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：尿激酶；受体；单克隆抗体
苏州医学院学报991208 摘要 目的 制备抗人尿激酶受体单克隆抗体，为今后uPAR病理生理作用及临床意义的研究提供新的手段。方法 利用杂交瘤技术，用经PMA刺激的U937细胞与可溶性尿激酶受体(suPAR)免疫Balb/c小鼠，与SP2/0细胞融合。结果 获得国内第1组4株抗人尿激酶受体(uPAR)单抗，分别命名为SZ-98、SZ-99、SZ-100、SZ-101。结论 4株单抗均能与uPAR特异性结合，能与U937细胞及经PMA作用的K562细胞反应。SZ-101与国外抗uPAR单抗3936有相同的uPAR结合位点；而SZ-98、SZ-99与SZ-100在uPAR上有不同的结合位点。
, 百拇医药 中图法分类 R73-354
Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies
Against Human Urokinase Receptor
Bai Xia, Xi Xiaodong, Xu Jie，et al
(Jiangsu Institute of Hematology，The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College，Suzhou，215006)
Abstract Objective To prepare monoclonal antibodies(Mab) again st human urokinase type plasminogen activator receptor(uPAR). Methods PMA-treated U937 cells and soluble uPAR were used to immunize Balb/c mic e. Their spleen cells were hybridazed with SP2/0 cells. Results Four antibodies against uPAR, named SZ-98, SZ-99, SZ-100 and SZ-101, were rais ed. Conclusion All four Mabs could specifically bind to uP AR,U937 cells as well as K562 cells treated with PMA,recognizing different sites of uPAR molecule.They could serve as a new tool for the study of uPAR and its p hysiopathological and clinical significance.
, 百拇医药
Key words uPA； receptor； monoclonal antibody
尿激酶是机体纤溶系统的一个重要的激活因子，有促进纤溶与组织修复的作用。尿激酶受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)存在于粒-单核细胞及某些细胞表面，是一个多功能的受体蛋白[1]，其基因与蛋白结构已经阐明[2]。尿激酶与细胞膜表面的uPAR结合，使细胞表面出现纤溶酶活性，除降解纤维蛋白外，对多种细胞外基质如纤维连接蛋白、层素、胶原及玻璃连接蛋白等也有降解作用。这一特性在生理上参与细胞的发育、分化与组织重建；在病理上可能与肿瘤的浸润转移过程有关；在动物实验上，uPAR拮抗剂和抗uPAR单抗可通过抑制尿激酶与uPAR的结合表现出明显的抑制肿瘤浸润与抗转移的作用[3]。uPAR是一新近发现的受体成分，很多功能尚未被认识。单克隆抗体具有高度的特异性，已成为研究生物活性物质的活性位置、病理生理作用及临床意义的重要手段。因此，我们应用杂交瘤技术研制了抗uPAR单克隆抗体，为进一步开展uPAR的基础研究与临床应用打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料:尿激酶由南京大学生化制药厂提供；CNB-Sephrose4B为Pharmacia公司产品；苯甲基黄酰氟、碘乙酰胺、亮抑制肽、氟波酯(PMA)为Sigma产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Immunotech公司；基因重组uPAR由丹麦Behrendt博士提供；uPAR单抗3936(AmericandiagnoticInc产品)由法国St.Louis医院陆核博士惠赠；荧光标记的羊抗鼠IgG、Ig亚类抗血清购于北京邦定公司；髓系白血病细胞株K562、U937细胞由本所陈子兴教授提供。Babl/c小鼠购于上海-必凯动物中心。
1.2 方法：
1.2.1 可溶性尿激酶受体(suPAR)的制备：按BehrendtN的方法[4]制备亲和层析柱,尿激酶20mg经苯甲基黄酰氟(终浓度为2mmol/L)灭活后偶联于CNB-Sephrose4B。卵巢癌患者的腹水照Pedersen的方法经10000g离心30min去沉淀，上清约2000ml加入苯甲基黄酰氟、EDTA-Na2、Aprotin、亮抑制肽和碘乙酰胺(终浓度分别为1mmol/L、5mmol/L、5μmol/L和2.5mmol/L)，以0.3ml/min流过亲和层析柱，然后将柱置于FPLC上，平衡后用0.1mol/L甘氨酸/盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
, 百拇医药
1.2.2 动物免疫：8周龄的雌性Balb/c小鼠腹腔注射经PMA(终浓度为90μg/L)作用48h后的U937细胞1×107，同时背部多点注射以完全福氏佐剂乳化的suPAR。28天后取基因重组uPAR与不完全福氏佐剂乳化30min后，行第2次免疫。融合前3天，每只小鼠尾静脉加强免疫。
1.2.3 细胞融合和单克隆化：按本室方法[5]，将免疫小鼠的脾脏制成单细胞悬液，计数后与小鼠骨髓瘤细胞用聚乙二醇介导细胞融合。按有限稀释法进行细胞的克隆化。
1.2.4 单抗筛选:①取基因重组uPAR(0.3mg/ml)包被酶标板，置4℃过夜。次日用0.05%吐温-PBS洗涤，20%小牛血清封闭后，加杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG并同上温育1h，邻苯二胺显色,3mol/L硫酸终止反应，测AD490值。②经过PMA(90μg/L)刺激2天的U937细胞按100μl(2×105)加入微孔，0.25%戊二醛固定15min，其余步骤同①法。以上两个结果呈阳性的杂交瘤细胞经3次以上单克隆化后注入Balb/c小鼠腹腔，以产生富含uPAR单抗的腹水。
, 百拇医药
1.2.5 双抗体夹心法：经饱和硫酸铵沉淀法提纯的单抗按50mg/L包被微孔，加入suPAR(2.5mg/L)之后再加入125I标记的抗uPAR单抗3936，37℃孵育1h，洗涤后γ记数仪计数cpm。
1.2.6 单抗竞争抑制试验：采用放射免疫法，以suPAR包被微孔，将适当稀释的单抗与125I-3936一起加入微孔，37℃孵育1h，洗涤后测放射活性。以抗血小板GMP-140单抗SZ-51为阴性对照。
1.2.7单抗的细胞特异性测定：将经过和未经过PMA作用的K562、U937细胞分置试管中，依次加入uPAR单抗，FITC-羊抗鼠IgG，用荧光显微镜观察结果。
2 结果
2.1 细胞融合经多次单克隆化后获得4株能持续分泌抗人uPAR单抗的杂交瘤细胞，分别命名为SZ-98、SZ-99、SZ-100、SZ-101。杂交瘤细胞接种小鼠腹腔后产生腹水，单抗对抗原的反应性见附表。
, 百拇医药
附表 ELISA法检测抗人uPAR单抗
单 克 隆 抗 体
SZ-98
SZ-99
SZ-100
SZ-101
3936
suPAR
U937细胞
1.66
0.66
1.34
, 百拇医药
1.02
1.70
0.45
1.37
1.43
1.79
0.75
2.2 经免疫双扩散鉴定，4株单抗均为IgG1。
2.3 SZ-98、SZ-99、SZ-100能与3936通过夹心法识别uPAR。
2.4 单抗竞争抑制试验表明SZ-101明显抑制3936与uPAR的结合(抑制率为92%)，而SZ-98、SZ-99、SZ-100对3936与uPAR的结合无竞争抑制作用。
, http://www.100md.com
2.5 免疫荧光试验显示4株单抗均不与K562细胞反应，而与U937和经PMA作用的K562细胞反应。
3 讨论
髓系白血病细胞株U937表面有丰富的uPAR，经PMA刺激后其表达量显著增加[6]。因此我们选用经PMA刺激的U937细胞与基因重组的可溶性uPAR免疫Balb/c小鼠，将免疫小鼠脾脏的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后筛选出国内第1组4株抗人uPAR单抗。这4株单抗均可与可溶性uPAR结合，表明为特异性抗uPAR抗体，K562细胞在受PMA刺激后也可表达uPAR[6]。4株单抗能与U937细胞及被PMA刺激的K562细胞结合，也符合单抗的抗uPAR特性。在我们研制的单抗中SZ-98、SZ-99与SZ-1003株单抗可与国外的抗uPAR单抗3936用双抗体夹心法检测uPAR，而SZ-101对单抗3936有竞争抑制作用。这表明，SZ-101与单抗3936识别uPAR的同一或邻近位点，而SZ-98、SZ-99与SZ-100识别的位点与单抗3936不同。这为研究uPAR的活性位点与功能提供了新的手段。uPAR除调节尿激酶的纤溶活性外，还参与了细胞的增生、信号传导与细胞粘附，并可能与肿瘤的浸润与转移有关。人们发现，很多抑制细胞粘附的单克隆抗体都有抑制肿瘤转移的作用。因此，抗uPAR单抗的研制不仅对阐明uPAR的生理病理作用有重要意义，还可能成为研究肿瘤转移防治的一个新的途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Vassalli J D, et al. The Plasiminogen activation/plasmin sy stem. J Clin Invest, 1991, 88∶1067
2 Roldan A L, et al.Cloning and expression of the receptor for human uro kinase plasminogen activator, a central molecule in cell surface, plasmin depend ent proteolysis. EMBO J, 1990,9∶467
3 Mohanam S,et al. Modulation of in vitro invasion of human glioblastoma receptor antibody. Cancer Res， 1993,53∶4143
, http://www.100md.com
4 Behrendt N，et al. The human receptor for urokinase plasminogen activa tor. NH2-terminnal amino acid sequence and glycosylation variants. J Biol Chem, 1990,265∶6453
5 阮长耿，等.抗人血小板单克隆抗体的研究I：一组分泌抗人血小板单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞.中华血液学杂志,1985,6∶130
6 徐 杰，等.急性髓系白血病细胞尿激酶受体表达及其意义.中华血液学杂志， 1999，20(1)∶40.
(1999年9月8日收稿), 百拇医药
单位：苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所，苏州，215006
关键词：尿激酶；受体；单克隆抗体
苏州医学院学报991208 摘要 目的 制备抗人尿激酶受体单克隆抗体，为今后uPAR病理生理作用及临床意义的研究提供新的手段。方法 利用杂交瘤技术，用经PMA刺激的U937细胞与可溶性尿激酶受体(suPAR)免疫Balb/c小鼠，与SP2/0细胞融合。结果 获得国内第1组4株抗人尿激酶受体(uPAR)单抗，分别命名为SZ-98、SZ-99、SZ-100、SZ-101。结论 4株单抗均能与uPAR特异性结合，能与U937细胞及经PMA作用的K562细胞反应。SZ-101与国外抗uPAR单抗3936有相同的uPAR结合位点；而SZ-98、SZ-99与SZ-100在uPAR上有不同的结合位点。
, 百拇医药 中图法分类 R73-354
Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies
Against Human Urokinase Receptor
Bai Xia, Xi Xiaodong, Xu Jie，et al
(Jiangsu Institute of Hematology，The First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College，Suzhou，215006)
Abstract Objective To prepare monoclonal antibodies(Mab) again st human urokinase type plasminogen activator receptor(uPAR). Methods PMA-treated U937 cells and soluble uPAR were used to immunize Balb/c mic e. Their spleen cells were hybridazed with SP2/0 cells. Results Four antibodies against uPAR, named SZ-98, SZ-99, SZ-100 and SZ-101, were rais ed. Conclusion All four Mabs could specifically bind to uP AR,U937 cells as well as K562 cells treated with PMA,recognizing different sites of uPAR molecule.They could serve as a new tool for the study of uPAR and its p hysiopathological and clinical significance.
, 百拇医药
Key words uPA； receptor； monoclonal antibody
尿激酶是机体纤溶系统的一个重要的激活因子，有促进纤溶与组织修复的作用。尿激酶受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)存在于粒-单核细胞及某些细胞表面，是一个多功能的受体蛋白[1]，其基因与蛋白结构已经阐明[2]。尿激酶与细胞膜表面的uPAR结合，使细胞表面出现纤溶酶活性，除降解纤维蛋白外，对多种细胞外基质如纤维连接蛋白、层素、胶原及玻璃连接蛋白等也有降解作用。这一特性在生理上参与细胞的发育、分化与组织重建；在病理上可能与肿瘤的浸润转移过程有关；在动物实验上，uPAR拮抗剂和抗uPAR单抗可通过抑制尿激酶与uPAR的结合表现出明显的抑制肿瘤浸润与抗转移的作用[3]。uPAR是一新近发现的受体成分，很多功能尚未被认识。单克隆抗体具有高度的特异性，已成为研究生物活性物质的活性位置、病理生理作用及临床意义的重要手段。因此，我们应用杂交瘤技术研制了抗uPAR单克隆抗体，为进一步开展uPAR的基础研究与临床应用打下基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂及材料:尿激酶由南京大学生化制药厂提供；CNB-Sephrose4B为Pharmacia公司产品；苯甲基黄酰氟、碘乙酰胺、亮抑制肽、氟波酯(PMA)为Sigma产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自Immunotech公司；基因重组uPAR由丹麦Behrendt博士提供；uPAR单抗3936(AmericandiagnoticInc产品)由法国St.Louis医院陆核博士惠赠；荧光标记的羊抗鼠IgG、Ig亚类抗血清购于北京邦定公司；髓系白血病细胞株K562、U937细胞由本所陈子兴教授提供。Babl/c小鼠购于上海-必凯动物中心。
1.2 方法：
1.2.1 可溶性尿激酶受体(suPAR)的制备：按BehrendtN的方法[4]制备亲和层析柱,尿激酶20mg经苯甲基黄酰氟(终浓度为2mmol/L)灭活后偶联于CNB-Sephrose4B。卵巢癌患者的腹水照Pedersen的方法经10000g离心30min去沉淀，上清约2000ml加入苯甲基黄酰氟、EDTA-Na2、Aprotin、亮抑制肽和碘乙酰胺(终浓度分别为1mmol/L、5mmol/L、5μmol/L和2.5mmol/L)，以0.3ml/min流过亲和层析柱，然后将柱置于FPLC上，平衡后用0.1mol/L甘氨酸/盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
, 百拇医药
1.2.2 动物免疫：8周龄的雌性Balb/c小鼠腹腔注射经PMA(终浓度为90μg/L)作用48h后的U937细胞1×107，同时背部多点注射以完全福氏佐剂乳化的suPAR。28天后取基因重组uPAR与不完全福氏佐剂乳化30min后，行第2次免疫。融合前3天，每只小鼠尾静脉加强免疫。
1.2.3 细胞融合和单克隆化：按本室方法[5]，将免疫小鼠的脾脏制成单细胞悬液，计数后与小鼠骨髓瘤细胞用聚乙二醇介导细胞融合。按有限稀释法进行细胞的克隆化。
1.2.4 单抗筛选:①取基因重组uPAR(0.3mg/ml)包被酶标板，置4℃过夜。次日用0.05%吐温-PBS洗涤，20%小牛血清封闭后，加杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h，洗涤后加入HRP-羊抗鼠IgG并同上温育1h，邻苯二胺显色,3mol/L硫酸终止反应，测AD490值。②经过PMA(90μg/L)刺激2天的U937细胞按100μl(2×105)加入微孔，0.25%戊二醛固定15min，其余步骤同①法。以上两个结果呈阳性的杂交瘤细胞经3次以上单克隆化后注入Balb/c小鼠腹腔，以产生富含uPAR单抗的腹水。
, 百拇医药
1.2.5 双抗体夹心法：经饱和硫酸铵沉淀法提纯的单抗按50mg/L包被微孔，加入suPAR(2.5mg/L)之后再加入125I标记的抗uPAR单抗3936，37℃孵育1h，洗涤后γ记数仪计数cpm。
1.2.6 单抗竞争抑制试验：采用放射免疫法，以suPAR包被微孔，将适当稀释的单抗与125I-3936一起加入微孔，37℃孵育1h，洗涤后测放射活性。以抗血小板GMP-140单抗SZ-51为阴性对照。
1.2.7单抗的细胞特异性测定：将经过和未经过PMA作用的K562、U937细胞分置试管中，依次加入uPAR单抗，FITC-羊抗鼠IgG，用荧光显微镜观察结果。
2 结果
2.1 细胞融合经多次单克隆化后获得4株能持续分泌抗人uPAR单抗的杂交瘤细胞，分别命名为SZ-98、SZ-99、SZ-100、SZ-101。杂交瘤细胞接种小鼠腹腔后产生腹水，单抗对抗原的反应性见附表。
, 百拇医药
附表 ELISA法检测抗人uPAR单抗
单 克 隆 抗 体
SZ-98
SZ-99
SZ-100
SZ-101
3936
suPAR
U937细胞
1.66
0.66
1.34
, 百拇医药
1.02
1.70
0.45
1.37
1.43
1.79
0.75
2.2 经免疫双扩散鉴定，4株单抗均为IgG1。
2.3 SZ-98、SZ-99、SZ-100能与3936通过夹心法识别uPAR。
2.4 单抗竞争抑制试验表明SZ-101明显抑制3936与uPAR的结合(抑制率为92%)，而SZ-98、SZ-99、SZ-100对3936与uPAR的结合无竞争抑制作用。
, http://www.100md.com
2.5 免疫荧光试验显示4株单抗均不与K562细胞反应，而与U937和经PMA作用的K562细胞反应。
3 讨论
髓系白血病细胞株U937表面有丰富的uPAR，经PMA刺激后其表达量显著增加[6]。因此我们选用经PMA刺激的U937细胞与基因重组的可溶性uPAR免疫Balb/c小鼠，将免疫小鼠脾脏的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后筛选出国内第1组4株抗人uPAR单抗。这4株单抗均可与可溶性uPAR结合，表明为特异性抗uPAR抗体，K562细胞在受PMA刺激后也可表达uPAR[6]。4株单抗能与U937细胞及被PMA刺激的K562细胞结合，也符合单抗的抗uPAR特性。在我们研制的单抗中SZ-98、SZ-99与SZ-1003株单抗可与国外的抗uPAR单抗3936用双抗体夹心法检测uPAR，而SZ-101对单抗3936有竞争抑制作用。这表明，SZ-101与单抗3936识别uPAR的同一或邻近位点，而SZ-98、SZ-99与SZ-100识别的位点与单抗3936不同。这为研究uPAR的活性位点与功能提供了新的手段。uPAR除调节尿激酶的纤溶活性外，还参与了细胞的增生、信号传导与细胞粘附，并可能与肿瘤的浸润与转移有关。人们发现，很多抑制细胞粘附的单克隆抗体都有抑制肿瘤转移的作用。因此，抗uPAR单抗的研制不仅对阐明uPAR的生理病理作用有重要意义，还可能成为研究肿瘤转移防治的一个新的途径。
, 百拇医药
参考文献
1 Vassalli J D, et al. The Plasiminogen activation/plasmin sy stem. J Clin Invest, 1991, 88∶1067
2 Roldan A L, et al.Cloning and expression of the receptor for human uro kinase plasminogen activator, a central molecule in cell surface, plasmin depend ent proteolysis. EMBO J, 1990,9∶467
3 Mohanam S,et al. Modulation of in vitro invasion of human glioblastoma receptor antibody. Cancer Res， 1993,53∶4143
, http://www.100md.com
4 Behrendt N，et al. The human receptor for urokinase plasminogen activa tor. NH2-terminnal amino acid sequence and glycosylation variants. J Biol Chem, 1990,265∶6453
5 阮长耿，等.抗人血小板单克隆抗体的研究I：一组分泌抗人血小板单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞.中华血液学杂志,1985,6∶130
6 徐 杰，等.急性髓系白血病细胞尿激酶受体表达及其意义.中华血液学杂志， 1999，20(1)∶40.
(1999年9月8日收稿), 百拇医药