助孕技术中的显微操作
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国外医学计划生育分册 1999年11月第18卷第4期
助孕技术中的显微操作
天津中心妇产科医院(300052)张云山编译 朱楣光审校
人类体外受精中成功应用显微操作已有10年，在此期间显微操作的应用范围逐渐扩大，包括单精子注射、透明带去除、极体与卵裂球活检及细胞浆和细胞核移植。目前显微操作的现代技术包括以下诸项：卵子的辅助受精、胚胎的辅助孵化、移去卵子或胚胎的一部分用作植入前诊断及细胞核的移植。本文对上述几方面作一简要论述，重点是卵子的显微受精。
关键词 辅助孵化 胞浆内精子注射 植入前遗传学诊断
一、细胞浆内精子注射(ICSI)对于不育男子的精子进行显微受精是一个非常有效的治疗措施。ICSI的精子来源可以是新鲜或电动射精子、附睾抽吸或睾丸活检分离后的精子。ICSI对精子活力不作要求。一些患者的无活力精子经处理后可显示活力。用完全无活力射精精子作ICSI，其受精率低于经处理后获得活力的精子(53%对65%)，原因可能是前者使用死精的机会更高一些。
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ICSI时，通常将精子置于含PVP(polyvinylpyrrolidone)的粘性溶液中以方便精子处理，尤其是精子活力好时，但并非绝对需要。从尾端将精子吸入注射针。但精子注入卵子前，必须制动，其方法是用注射针压住精子尾部即中段以后部分在皿底摩擦。精子尾部的猛烈制动较和制动会产生较高的受精率。用从睾丸活检获得的精子(66.7%对40.9%)较用成熟射出精子(73.4%对69.6%)这种差别更加明显。精子制动导致精子膜破坏及稳定性丧失，可促使精子进入卵子后的不凝聚。
ICSI不仅适用于治疗男性不育，也适用于治疗常规受精后不明原因的受精失败。对以前原发受精失败且无男性因素的患者，ICSI的受精及妊娠率均低于有男性因素者(82%对90%，14%对45%)，表明某些患者存在固胡的卵子缺陷，不能完全由ICSI的应用而克服。
除成熟精子外，不成熟精子甚至精细胞也用于ICSI。在非阻塞性无精症，精液或睾丸活检标本中可发现精细胞。这些患者睾丸中通常有局灶性的精子发生。圆形精子细胞是单倍体细胞，来源于精子发生的第二次减数分裂。随着发育继续，细胞变长，逐渐形成精子尾冲。这类正在变长的精子细胞较精子稍大，ICSI的操作技术必须予以调整。使用这种技术已获得45%的受精率有主20%的妊娠率。使用精细胞注射担心的是有罗大量的男方精浆被带入卵中，包括父源线粒体DNA。为克服这一问题，可将细胞核从精细胞中分离出来单独注入卵子中，这项技术就是圆形精细胞核注射。
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当常规受精失败时，可应用ICSI来“挽救”体外受精(IVF)周期。此时，可有44%的受精率及4.8%的妊娠率。如应用室温下储存一夜的精子尽早进行再受精则结果可能更好，如应用ICSI再受精失败，则不宜再次使用ICSI。用第一个精子可能已形成一个精星体(sperm aste)。第二个精星体的引入会导致分裂时多极性仿锤体的形成，因而导致子细胞间异常的染色体分布。
ICSI技术在动物模型尚未充分研究前就被用于人类临床中。必须对ICSI婴儿进行长期随访研究到其进入生育年龄以充分了解此项技术的影响力。两项包括578及904个ICSI新生儿的研究显示，先天畸形较常规IVF婴儿未见增加。但另一项研究显示，来自澳大利亚生育人群的1000454个婴儿与420个ICSI比较，ICSI婴儿主要出生缺陷是通常情况的2倍，轻度出生缺陷比通常情况高50%以上。
遗传紊乱(包括性染色体异常及丫染色体微小缺失等)是严重少精或无精症并不少见的原因。应ICSI治疗这类患者时，可能导致遗传突变或染色体异常在其子代传递。但ICSI本身并不引入遗传异常，它仅是增加受损异常配子获得受精形成胚胎的机会。故在寻求ICSI治疗时，应进行遗传学咨询并对患者进行适当筛选。
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二、辅助孵化
辅助孵化(AH)是通过使胚胎更易从透明带中出现的方式以提高种植率的一项技术，常被用于妊娠预后差的患者。一般是用酸性Tyrcode′s液在透明带上做一个孔，也可用激光粘孔。最宾发展了一种非接触激光，此时即不需要进行显微操作，这种方法较酸性Tyrcode′s液的主要优点是不用担心对临近细胞损害的可能性，局部性的热损害似不是一个显著的问题，虽然现在这种方法取代显微操作AH尚为时过早。
AH及ICSI的一个潜在危险是单羊膜囊双胎增加。美国42个IVF中心的一项研究显示，因透明带操作，单羊膜囊双胎增加。单羊膜囊双胎在产科及新生儿方面的后果都可能是严重的，但此项研究未报告有联体双胎。虽有一些报告指出使用AH后胚胎种植率显著提高，但实际情况是还没一个广泛的、对照良好的前瞻性研究对AH使用有助于何种临床情况作出结论。
三、极体及卵裂球活检
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当子代处在可遗传的异常危险中时，可应用植入前遗传学诊断(PGD)在胚胎移植前对胚胎进行筛查。在1989年PGD应用之前，主要是应用绒毛活检或羊膜穿刺进行产前筛查以尽早发现染色体遗传异常，但此时胚胎或胎儿已在母体内形成。显然植入前异常胚胎的筛查能极大地减少患者的精神压力。
用机械、化学或激光等方法除去部分透明带后即可获得活检标本，包括受精前、后卵子的第一或第二极体，各发育阶段胚胎的一个或2个卵裂球或囊胚的胚外滋养层的一组细胞。用一内经5～40um的光滑活检工具通过透明带的开孔移去活检组织PGD，方法包括聚合酶链反应(PCR)单基因分析，荧光原位杂交(FISH)染色体分析或两者结合应用。
四、细胞浆和细胞核移植
人类不孕治疗中显微操作技术的最新应用是把供卵的细胞浆移植入年龄大的、预后差的妇女的卵子中以试图改善这些配子活力。受卵接受供卵5%的细胞浆，这种方法已获得婴儿分娩。另一种方法是把卵子的细胞核移植进入去核后的捐赠卵中去，这实际也预示着100%的卵浆损赠成为临床可能。
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结 论
10年来，显微操作在人类不育治疗领域中的应用范围逐渐扩大。ICSI行辅助受精已成为常规且非常有效，但仍需探索显微操作在胚胎显微操作、卵子细胞浆及细胞核移植等方面可能应用的程度。随着越来越多的如植入前活检这种胚胎质量评价方法的应用，我们将能够在胚胎移植前对我们所应用的所有技术的正面或负面影响进行监测。
参 考 文 献
1 Wright G，Tucker MJ,MortonPC et al.Curr Opin Obstet Gynecol,1998;10:222-226
2 Johnson MD.Fertil Steril,1998;70(3):397-411
(收稿日期：1999-03-01), 百拇医药
天津中心妇产科医院(300052)张云山编译 朱楣光审校
人类体外受精中成功应用显微操作已有10年，在此期间显微操作的应用范围逐渐扩大，包括单精子注射、透明带去除、极体与卵裂球活检及细胞浆和细胞核移植。目前显微操作的现代技术包括以下诸项：卵子的辅助受精、胚胎的辅助孵化、移去卵子或胚胎的一部分用作植入前诊断及细胞核的移植。本文对上述几方面作一简要论述，重点是卵子的显微受精。
关键词 辅助孵化 胞浆内精子注射 植入前遗传学诊断
一、细胞浆内精子注射(ICSI)对于不育男子的精子进行显微受精是一个非常有效的治疗措施。ICSI的精子来源可以是新鲜或电动射精子、附睾抽吸或睾丸活检分离后的精子。ICSI对精子活力不作要求。一些患者的无活力精子经处理后可显示活力。用完全无活力射精精子作ICSI，其受精率低于经处理后获得活力的精子(53%对65%)，原因可能是前者使用死精的机会更高一些。
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ICSI时，通常将精子置于含PVP(polyvinylpyrrolidone)的粘性溶液中以方便精子处理，尤其是精子活力好时，但并非绝对需要。从尾端将精子吸入注射针。但精子注入卵子前，必须制动，其方法是用注射针压住精子尾部即中段以后部分在皿底摩擦。精子尾部的猛烈制动较和制动会产生较高的受精率。用从睾丸活检获得的精子(66.7%对40.9%)较用成熟射出精子(73.4%对69.6%)这种差别更加明显。精子制动导致精子膜破坏及稳定性丧失，可促使精子进入卵子后的不凝聚。
ICSI不仅适用于治疗男性不育，也适用于治疗常规受精后不明原因的受精失败。对以前原发受精失败且无男性因素的患者，ICSI的受精及妊娠率均低于有男性因素者(82%对90%，14%对45%)，表明某些患者存在固胡的卵子缺陷，不能完全由ICSI的应用而克服。
除成熟精子外，不成熟精子甚至精细胞也用于ICSI。在非阻塞性无精症，精液或睾丸活检标本中可发现精细胞。这些患者睾丸中通常有局灶性的精子发生。圆形精子细胞是单倍体细胞，来源于精子发生的第二次减数分裂。随着发育继续，细胞变长，逐渐形成精子尾冲。这类正在变长的精子细胞较精子稍大，ICSI的操作技术必须予以调整。使用这种技术已获得45%的受精率有主20%的妊娠率。使用精细胞注射担心的是有罗大量的男方精浆被带入卵中，包括父源线粒体DNA。为克服这一问题，可将细胞核从精细胞中分离出来单独注入卵子中，这项技术就是圆形精细胞核注射。
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当常规受精失败时，可应用ICSI来“挽救”体外受精(IVF)周期。此时，可有44%的受精率及4.8%的妊娠率。如应用室温下储存一夜的精子尽早进行再受精则结果可能更好，如应用ICSI再受精失败，则不宜再次使用ICSI。用第一个精子可能已形成一个精星体(sperm aste)。第二个精星体的引入会导致分裂时多极性仿锤体的形成，因而导致子细胞间异常的染色体分布。
ICSI技术在动物模型尚未充分研究前就被用于人类临床中。必须对ICSI婴儿进行长期随访研究到其进入生育年龄以充分了解此项技术的影响力。两项包括578及904个ICSI新生儿的研究显示，先天畸形较常规IVF婴儿未见增加。但另一项研究显示，来自澳大利亚生育人群的1000454个婴儿与420个ICSI比较，ICSI婴儿主要出生缺陷是通常情况的2倍，轻度出生缺陷比通常情况高50%以上。
遗传紊乱(包括性染色体异常及丫染色体微小缺失等)是严重少精或无精症并不少见的原因。应ICSI治疗这类患者时，可能导致遗传突变或染色体异常在其子代传递。但ICSI本身并不引入遗传异常，它仅是增加受损异常配子获得受精形成胚胎的机会。故在寻求ICSI治疗时，应进行遗传学咨询并对患者进行适当筛选。
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二、辅助孵化
辅助孵化(AH)是通过使胚胎更易从透明带中出现的方式以提高种植率的一项技术，常被用于妊娠预后差的患者。一般是用酸性Tyrcode′s液在透明带上做一个孔，也可用激光粘孔。最宾发展了一种非接触激光，此时即不需要进行显微操作，这种方法较酸性Tyrcode′s液的主要优点是不用担心对临近细胞损害的可能性，局部性的热损害似不是一个显著的问题，虽然现在这种方法取代显微操作AH尚为时过早。
AH及ICSI的一个潜在危险是单羊膜囊双胎增加。美国42个IVF中心的一项研究显示，因透明带操作，单羊膜囊双胎增加。单羊膜囊双胎在产科及新生儿方面的后果都可能是严重的，但此项研究未报告有联体双胎。虽有一些报告指出使用AH后胚胎种植率显著提高，但实际情况是还没一个广泛的、对照良好的前瞻性研究对AH使用有助于何种临床情况作出结论。
三、极体及卵裂球活检
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当子代处在可遗传的异常危险中时，可应用植入前遗传学诊断(PGD)在胚胎移植前对胚胎进行筛查。在1989年PGD应用之前，主要是应用绒毛活检或羊膜穿刺进行产前筛查以尽早发现染色体遗传异常，但此时胚胎或胎儿已在母体内形成。显然植入前异常胚胎的筛查能极大地减少患者的精神压力。
用机械、化学或激光等方法除去部分透明带后即可获得活检标本，包括受精前、后卵子的第一或第二极体，各发育阶段胚胎的一个或2个卵裂球或囊胚的胚外滋养层的一组细胞。用一内经5～40um的光滑活检工具通过透明带的开孔移去活检组织PGD，方法包括聚合酶链反应(PCR)单基因分析，荧光原位杂交(FISH)染色体分析或两者结合应用。
四、细胞浆和细胞核移植
人类不孕治疗中显微操作技术的最新应用是把供卵的细胞浆移植入年龄大的、预后差的妇女的卵子中以试图改善这些配子活力。受卵接受供卵5%的细胞浆，这种方法已获得婴儿分娩。另一种方法是把卵子的细胞核移植进入去核后的捐赠卵中去，这实际也预示着100%的卵浆损赠成为临床可能。
, http://www.100md.com
结 论
10年来，显微操作在人类不育治疗领域中的应用范围逐渐扩大。ICSI行辅助受精已成为常规且非常有效，但仍需探索显微操作在胚胎显微操作、卵子细胞浆及细胞核移植等方面可能应用的程度。随着越来越多的如植入前活检这种胚胎质量评价方法的应用，我们将能够在胚胎移植前对我们所应用的所有技术的正面或负面影响进行监测。
参 考 文 献
1 Wright G，Tucker MJ,MortonPC et al.Curr Opin Obstet Gynecol,1998;10:222-226
2 Johnson MD.Fertil Steril,1998;70(3):397-411
(收稿日期：1999-03-01), 百拇医药