挤压伤脊髓腹角神经元NT-3表达的变化
作者：路华 王廷华 冯忠堂 马以骝 杨志敏
单位：路华(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 马以骝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 杨志敏(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：挤压伤；脊髓腹角；NT-3；表达
昆明医学院学学报000116 摘 要：运用免疫组化ABC法探讨了脊髓挤压伤后不同时间腹角NT-3表达的变化. 结果：对照组可见NT-3免疫反应阳性细胞分布于腹角的大神经元和少量小神经元，胞核、胞浆均染色. 此外，亦见少量阳性胶质细胞. 脊髓挤压伤后24 h，神经元内NT-3免疫反应强度较正常时为深(P<0.05). 挤压后7 d，NT-3免疫反应强度及阳性细胞数目均较正常及24 h组者有显著增加(P<0.05). 提示，NT-3不仅可能参与了正常脊髓腹角神经元的生理过程，而且可能在脊髓损伤修复中发挥作用.
, 百拇医药
分类号：R 651.3 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0060-03
The Changes of Expression for NT-3 in Ventral Horn after Crushed Spinal Cord Injury
LU Hua，FENG Zhong-tang，MA Yi-liou，YANG Zhi-ming
(Dep. of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650032)WANG Ting-hua
(The Center for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
, 百拇医药
Abstract：WTBZ In this study，ABC method of immunohistochemistry was used to explore the changes of expression for NT-3 in neurons of ventral horn in different time after crushed spinal cord injury(cSCI). The results showed that NT-3 positive neurons were distributed in neurons of ventral horn in intact group and NT-3 immunorecative degree increase greatly than that of contral group at 24 h following injury(P<0.05).Comperetively，in 7 d group，not only NT-3 immunoreactive degree，but also NT-3 positive neuronal numbers apperently increase than that of contral group and 24 h group following injury (P<0.05).The results indicated that the expression of NT-3 involves in the physiological function of spinal cord in adult rat and may play an important role in the repair of nerves following cSCI.
, 百拇医药
Key words：NT-3；Expression；Crushed SCI；Ventral horn▲
大量的研究证实损伤的脊髓具有可塑性，这为损伤脊髓的修复带来了希望. 神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)是神经营养因子家族的重要一员. 近年，不少文献已报道其对神经细胞的存活、分化、增殖及在保护神经元受损的退行改变中起重要作用[1]. 最近的实验已揭示，NT-3可促进脊髓运动神经元存活. 而介导NT-3发挥生物学作用的是其高亲和性受体trkC[2].本文探讨NT-3在脊髓腹角正常分布的基础上，观察了挤压伤后NT-3的表达变化，籍以初步探讨NT-3在挤压性脊髓损伤与修复中的作用.
1 材料与方法
1.1 动物模型及标本获取
成年SD大鼠15只(对照组、损伤24 h组、损伤7 d组各5只)，体重180～320 g. 用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，在椎板切开后挤压大鼠T13脊髓节段. 分笼饲养. 术后24 h，7 d处死动物，取脊髓T13 节段制做20 μm厚的冰冻切片.
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1.2 免疫组化染色程序
切片按常规ABC 法进行免疫组织化学染色(NT-3抗血清浓度为1：1 000). DAB 呈色反应棕色. 裱片，脱水，树胶封片. 对照实验，用PBS代替第一抗体，结果为阴性.
1.4 结果观察与统计
在Olympus显微镜下，观察NT-3样免疫反应阳性细胞在成年大鼠脊髓腹角的分布并记录反应强度. 各组NT-3免疫阳性细胞数用q检验，反应强度用秩和检验.
2 结果
2.1 NT-3在正常大鼠脊髓腹角的分布
在正常大鼠脊髓腹角，NT-3样免疫反应阳性物分布于腹角的大神经元和少量的小神经元. 阳性产物的亚细胞定位主要分布于细胞核，胞浆及神经元突起染色相对较浅. 此外，还可见一些核染色的胶质细胞.
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2.2 SCI后NT-3在腹角的分布及变化
SCI后24 h，NT-3样免疫反应阳性细胞染色程度较正常时为深(见附图)(P<0.05)，但阳性神经元数无明显变化(P>0.05). NT-3在细胞中定位仍主要位于胞核. 损伤7 d后，NT-3免疫阳性细胞数及免疫反应染色程度均较正常及24 h有显著增加(P<0.05). 此外，还见较多NT-3阳性反应的胶质细胞. 本研究主要对各组腹角NT-3阳性神经元的数量及反应强度作定量分析，结果见附表.
附图 NT-3在正常(a)及伤后24 h(b)脊髓腹角神经元×200
附表 各组脊髓腹角NT-3阳性神经元数目及反应强度比较(
±s) 项目
, 百拇医药
对照组
挤压伤后
24 h
7 d
阳性神经元数
4.3±0.14
5.0±0.07
9.9±0.23
项目
对照组
挤压伤后
24 h
7 d
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阳性神经元数
4.3±0.14
5.0±0.07
9.9±0.23
反应强度
+～++
++～+++
++++
反应强度
+～++
++～+++
++++
除对照组与挤压伤后24 h组阳性神经元数目无统计学意义(P<0.05)外，余阳性神经元数目及反应强度各组两两之间均有显著差异(P<0.05).3 讨 论
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3.1 NT-3在成体大鼠腹角神经元表达的功能意义
本文发现，NT-3样免疫反应阳性物分布在正常大鼠脊髓腹角的大神经元和少量的小神经元. 阳性产物的亚细胞定位主要分布于胞核，而胞浆及神经元突起染色相对较浅. 提示，NT-3可能在正常脊髓腹角的神经元生理过程发挥作用. 之前，本室的研究已提供NT-3在发育中腹角神经元的免疫组织化学证据. 提示NT-3的作用与运动神经元发育有关. 本文进一步提供了NT-3在成体神经元分布的免疫组织化学证据，且发现阳性反应物主要位于核内，提示NT-3不仅涉及成体神经元的生理过程，且NT-3可能是进入核内发挥作用.
3.2 挤压伤后NT-3表达变化的功能意义
挤压伤后24 h，NT-3免疫阳性细胞数目无明显变化，但免疫反应强度明显增加，表明挤压伤可致脊髓腹角神经元NT-3表达增加，提示NT-3可能在神经元损伤早期反应中发挥作用.本文推测，损伤早期(24 h)NT-3免疫反应强度的增加可能是正常NT-3免疫阳性细胞对损伤刺激产生应答自分泌的结果，另一可能是与靶组织分泌通过轴突末端运输至胞体的NT-3增多有关.今后，进一步探明脊髓内NT-3来源的工作仍有待深入.
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此外，本实验还观察到，损伤后7 d的NT-3阳性细胞数目及反应强度较正常及24 h组均有进一步增加，提示NT-3在脊髓损伤中并非是一过性表达，而是持续参与神经损伤修复. 在腹角，Bradbury等实验发现，NT-3高亲和性受体trkC在大鼠脊髓半切后表达，且局部应用NT-3可逆转萎缩细胞，存活细胞数目也明显增加[3，4]. Goto利用NT-3抗体，调查了大鼠脊髓横切伤后NT-3样免疫反应分布，证实NT-3样免疫反应物都定位于灰质，尤其是腹角运动神经元和一些胶质细胞. 并且发现脊髓横切损伤后3周，运动神经元显示抗NT-3抗体强阳性[5]. 但未提供NT-3 样免疫反应物在脊髓损伤后早期变化的动态变化过程，而这一时期被认为是神经系统损伤修复最重要的时期. 故本文的结果进一步探讨挤压伤后24 h，7 d的NT-3样免疫反应物在脊髓腹角表达的变化情况，为NT-3参与脊髓损伤修复又提供了一些具体资料. 本文的结果提供了挤压性脊髓受损后早期NT-3表达变化的形态学依据. 结果提示NT-3对脊髓损伤修复起重要作用，但其参与神经修复的具体机制还有待进一步研究.■
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基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：路华，男(1974～)，江苏淮阴人，硕士研究生. 研究方向：脊髓损伤与修复.
参考文献：
[1] ISONPIERE P C，BELLUSCIO L. Neurotrophin-3: A neurotrophic factor related to NGF and BDNF [J]. Science，1990， 247: 1446
[2] SOPPET D，ESCANDON E，MARAGOS J，et al. The neurotrophic factors brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 are ligands for the trkB tyrosine kinase receptor [J]. Cell，1991，85: 895
, 百拇医药
[3] 周长满，杨青峰，鄂玲玲，等. 神经营养因子和受体trkA，trkB，trkC在正常大鼠脊髓和胎鼠脊髓移植体的免疫组织化学研究[J].神经解剖杂志，1999，15(1)：27
[4] BRADBURY E J. NT-3，but not BDNF，prevents atrophy and death of axotomied spinal cord projection neurons[J].Eur J Neurosci，1998，10(10):3058
[5] 邓少丽，廖维宏. 神经营养因子治疗脊髓损伤的研究进展 [J]. 中国脊髓脊柱杂志，1998，8(2)：106
收稿日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：路华(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 马以骝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 杨志敏(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：挤压伤；脊髓腹角；NT-3；表达
昆明医学院学学报000116 摘 要：运用免疫组化ABC法探讨了脊髓挤压伤后不同时间腹角NT-3表达的变化. 结果：对照组可见NT-3免疫反应阳性细胞分布于腹角的大神经元和少量小神经元，胞核、胞浆均染色. 此外，亦见少量阳性胶质细胞. 脊髓挤压伤后24 h，神经元内NT-3免疫反应强度较正常时为深(P<0.05). 挤压后7 d，NT-3免疫反应强度及阳性细胞数目均较正常及24 h组者有显著增加(P<0.05). 提示，NT-3不仅可能参与了正常脊髓腹角神经元的生理过程，而且可能在脊髓损伤修复中发挥作用.
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分类号：R 651.3 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0060-03
The Changes of Expression for NT-3 in Ventral Horn after Crushed Spinal Cord Injury
LU Hua，FENG Zhong-tang，MA Yi-liou，YANG Zhi-ming
(Dep. of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650032)WANG Ting-hua
(The Center for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
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Abstract：WTBZ In this study，ABC method of immunohistochemistry was used to explore the changes of expression for NT-3 in neurons of ventral horn in different time after crushed spinal cord injury(cSCI). The results showed that NT-3 positive neurons were distributed in neurons of ventral horn in intact group and NT-3 immunorecative degree increase greatly than that of contral group at 24 h following injury(P<0.05).Comperetively，in 7 d group，not only NT-3 immunoreactive degree，but also NT-3 positive neuronal numbers apperently increase than that of contral group and 24 h group following injury (P<0.05).The results indicated that the expression of NT-3 involves in the physiological function of spinal cord in adult rat and may play an important role in the repair of nerves following cSCI.
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Key words：NT-3；Expression；Crushed SCI；Ventral horn▲
大量的研究证实损伤的脊髓具有可塑性，这为损伤脊髓的修复带来了希望. 神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)是神经营养因子家族的重要一员. 近年，不少文献已报道其对神经细胞的存活、分化、增殖及在保护神经元受损的退行改变中起重要作用[1]. 最近的实验已揭示，NT-3可促进脊髓运动神经元存活. 而介导NT-3发挥生物学作用的是其高亲和性受体trkC[2].本文探讨NT-3在脊髓腹角正常分布的基础上，观察了挤压伤后NT-3的表达变化，籍以初步探讨NT-3在挤压性脊髓损伤与修复中的作用.
1 材料与方法
1.1 动物模型及标本获取
成年SD大鼠15只(对照组、损伤24 h组、损伤7 d组各5只)，体重180～320 g. 用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，在椎板切开后挤压大鼠T13脊髓节段. 分笼饲养. 术后24 h，7 d处死动物，取脊髓T13 节段制做20 μm厚的冰冻切片.
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1.2 免疫组化染色程序
切片按常规ABC 法进行免疫组织化学染色(NT-3抗血清浓度为1：1 000). DAB 呈色反应棕色. 裱片，脱水，树胶封片. 对照实验，用PBS代替第一抗体，结果为阴性.
1.4 结果观察与统计
在Olympus显微镜下，观察NT-3样免疫反应阳性细胞在成年大鼠脊髓腹角的分布并记录反应强度. 各组NT-3免疫阳性细胞数用q检验，反应强度用秩和检验.
2 结果
2.1 NT-3在正常大鼠脊髓腹角的分布
在正常大鼠脊髓腹角，NT-3样免疫反应阳性物分布于腹角的大神经元和少量的小神经元. 阳性产物的亚细胞定位主要分布于细胞核，胞浆及神经元突起染色相对较浅. 此外，还可见一些核染色的胶质细胞.
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2.2 SCI后NT-3在腹角的分布及变化
SCI后24 h，NT-3样免疫反应阳性细胞染色程度较正常时为深(见附图)(P<0.05)，但阳性神经元数无明显变化(P>0.05). NT-3在细胞中定位仍主要位于胞核. 损伤7 d后，NT-3免疫阳性细胞数及免疫反应染色程度均较正常及24 h有显著增加(P<0.05). 此外，还见较多NT-3阳性反应的胶质细胞. 本研究主要对各组腹角NT-3阳性神经元的数量及反应强度作定量分析，结果见附表.
附图 NT-3在正常(a)及伤后24 h(b)脊髓腹角神经元×200
附表 各组脊髓腹角NT-3阳性神经元数目及反应强度比较(
±s) 项目, 百拇医药
对照组
挤压伤后
24 h
7 d
阳性神经元数
4.3±0.14
5.0±0.07
9.9±0.23
项目
对照组
挤压伤后
24 h
7 d
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阳性神经元数
4.3±0.14
5.0±0.07
9.9±0.23
反应强度
+～++
++～+++
++++
反应强度
+～++
++～+++
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除对照组与挤压伤后24 h组阳性神经元数目无统计学意义(P<0.05)外，余阳性神经元数目及反应强度各组两两之间均有显著差异(P<0.05).3 讨 论
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3.1 NT-3在成体大鼠腹角神经元表达的功能意义
本文发现，NT-3样免疫反应阳性物分布在正常大鼠脊髓腹角的大神经元和少量的小神经元. 阳性产物的亚细胞定位主要分布于胞核，而胞浆及神经元突起染色相对较浅. 提示，NT-3可能在正常脊髓腹角的神经元生理过程发挥作用. 之前，本室的研究已提供NT-3在发育中腹角神经元的免疫组织化学证据. 提示NT-3的作用与运动神经元发育有关. 本文进一步提供了NT-3在成体神经元分布的免疫组织化学证据，且发现阳性反应物主要位于核内，提示NT-3不仅涉及成体神经元的生理过程，且NT-3可能是进入核内发挥作用.
3.2 挤压伤后NT-3表达变化的功能意义
挤压伤后24 h，NT-3免疫阳性细胞数目无明显变化，但免疫反应强度明显增加，表明挤压伤可致脊髓腹角神经元NT-3表达增加，提示NT-3可能在神经元损伤早期反应中发挥作用.本文推测，损伤早期(24 h)NT-3免疫反应强度的增加可能是正常NT-3免疫阳性细胞对损伤刺激产生应答自分泌的结果，另一可能是与靶组织分泌通过轴突末端运输至胞体的NT-3增多有关.今后，进一步探明脊髓内NT-3来源的工作仍有待深入.
, 百拇医药
此外，本实验还观察到，损伤后7 d的NT-3阳性细胞数目及反应强度较正常及24 h组均有进一步增加，提示NT-3在脊髓损伤中并非是一过性表达，而是持续参与神经损伤修复. 在腹角，Bradbury等实验发现，NT-3高亲和性受体trkC在大鼠脊髓半切后表达，且局部应用NT-3可逆转萎缩细胞，存活细胞数目也明显增加[3，4]. Goto利用NT-3抗体，调查了大鼠脊髓横切伤后NT-3样免疫反应分布，证实NT-3样免疫反应物都定位于灰质，尤其是腹角运动神经元和一些胶质细胞. 并且发现脊髓横切损伤后3周，运动神经元显示抗NT-3抗体强阳性[5]. 但未提供NT-3 样免疫反应物在脊髓损伤后早期变化的动态变化过程，而这一时期被认为是神经系统损伤修复最重要的时期. 故本文的结果进一步探讨挤压伤后24 h，7 d的NT-3样免疫反应物在脊髓腹角表达的变化情况，为NT-3参与脊髓损伤修复又提供了一些具体资料. 本文的结果提供了挤压性脊髓受损后早期NT-3表达变化的形态学依据. 结果提示NT-3对脊髓损伤修复起重要作用，但其参与神经修复的具体机制还有待进一步研究.■
, http://www.100md.com
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：路华，男(1974～)，江苏淮阴人，硕士研究生. 研究方向：脊髓损伤与修复.
参考文献：
[1] ISONPIERE P C，BELLUSCIO L. Neurotrophin-3: A neurotrophic factor related to NGF and BDNF [J]. Science，1990， 247: 1446
[2] SOPPET D，ESCANDON E，MARAGOS J，et al. The neurotrophic factors brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 are ligands for the trkB tyrosine kinase receptor [J]. Cell，1991，85: 895
, 百拇医药
[3] 周长满，杨青峰，鄂玲玲，等. 神经营养因子和受体trkA，trkB，trkC在正常大鼠脊髓和胎鼠脊髓移植体的免疫组织化学研究[J].神经解剖杂志，1999，15(1)：27
[4] BRADBURY E J. NT-3，but not BDNF，prevents atrophy and death of axotomied spinal cord projection neurons[J].Eur J Neurosci，1998，10(10):3058
[5] 邓少丽，廖维宏. 神经营养因子治疗脊髓损伤的研究进展 [J]. 中国脊髓脊柱杂志，1998，8(2)：106
收稿日期：1999-12-22, 百拇医药