凋亡基因Bax，Bcl-2，Fasl 在成年猫脊髓中的表达
作者：顾玲 高玉陪 唐太昆 李斌 陈彦红 王廷华
单位：顾玲(昆明市延安医院神经科，昆明650032)；高玉陪(昆明市延安医院神经科，昆明650032)； 唐太昆(昆明市延安医院神经科，昆明650032)； 李斌(昆明市延安医院 神经科，昆明650032)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：成年猫脊髓；免疫组化；Bax；Bcl-2；Fasl
昆明医学院学学报000109 摘 要：采用免疫组化ABC法，观察凋亡基因Bax，Bcl-2，Fasl在成年猫脊髓的分布. 结果：在脊髓腹角、中间带及后角深部均见Bax，Bcl-2，Fasl阳性神经元. 反应物定位于细胞浆. 相对之，后角浅层除Bcl-2阳性神经元尚多外，Bax，Fasl阳性神经元较少. 提示Bax，Bcl-2，Fasl可能与成年猫脊髓神经元的生理功能有关. 且Bcl-2在脊髓的分布与Bax，Fasl略有差异.
, http://www.100md.com
分类号：Q 426；R 651.2 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0037-03
The Expression of Bax，Bcl-2 and Fasl in The Spinal Cord of Adult Cat
GU Ling，GAO Yu-pei，TANG Tai-kun，LI Bin，( Dept. of Neuroscience，Yanan Hospital，Kunming 650032)
CHEN Yan-hong，WANG Ting-hua
(Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
, http://www.100md.com
Abstract：Investigating the expression of Bax，Bcl-2 and Fasl in spinal cord of adult cat by immunohistochemistry ABC method. Results: The positive products of Bax，Bcl-2 and Fasl were located in many neurons of ventrolateral horn，intermidius zone and deep of dorsal horn. The subcellular localization of positive products is in cytoplasm. Comperatively，there is almost few positive neuron of Bax and Fasl in superficial of dorsal horn while a few Bcl-2 positive neurons were observed. The results indicated that the role of Bax，Bcl-2 and Fasl is related to the physiologyical function of some neurons in spinal cord. And the distribution between Bax，Fasl and Bcl-2 has a little difference.
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Key words：The spinal cord of adult cat;Immunohistochemistry;Bax； Bcl-2;Fasl▲
1951年，Glucksman首次提出在正常生物发育过程中存在大量的细胞死亡，即程序性细胞死亡[1]. 作为一种生理现象，其对维持发育中细胞数目的稳定而不致因细胞增殖过量具有重要的功能意义. 20 a后，Kerr等将程序细胞死亡正式命名为细胞凋亡(apoptosis)[2]. 现已清楚，细胞凋亡是在内源性基因调控下细胞的主动自杀过程[3]. 其凋亡的形态特征是染色质浓缩、边集(染色质浓缩后聚集于核膜下)，最后至凋亡小体形成(细胞破裂后细胞膜包裹染色质及细胞碎片形成)[4]. 而在这一系列过程中，凋亡基因表达蛋白水平的改变对细胞凋亡起到关键作用.
至今，已发现的凋亡基因相关蛋白中，Bax，Bcl-2，Fasl 是近年认为与细胞凋亡关系极为密切的3种凋亡基因相关蛋白. 了解其在组织中的分布，有利于认识其生理功能.本文用免疫组化ABC法观察成体猫脊髓Bax，Bcl-2，Fasl的分布.
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1 材料方法
1.1 标本获取
成年雄猫5只(体重3～3.5 kg)，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉. 4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L3节段脊髓后固定6 h，入20%蔗糖PBS下沉过夜. 制作20 μm厚的冰冻切片. 间断取片备用.
1.2 免疫组织化学染色
用Bax，Bcl-2，Fasl抗血清(滴度为1∶1 000，Santa Cruz)对切片行ABC免疫组织化学染色，DAB棕色反应呈色. 裱片，脱水，树胶封片.
1. 3 结果观察
在Olympus 显微镜下，观察Bax，Bcl-2，Fasl样免疫阳性产物在脊髓的分布.
, 百拇医药
1. 4 阴性对照实验
用PBS代替Bax，Bcl-2和Fasl抗血清，其余程序同上.
2 结果
脊髓前角、中间带及后角深部均有Bax，Bcl-2，Fasl阳性反应神经元分布. 阳性反应物定位于细胞浆(附图). 相比之下，后角浅层除Bcl-2 阳性神经元稍多外，Bax和Fasl阳性神经元均较少(附图).
附图 脊髓免疫阳性神经元(400×)
a：Bax(腹角)；b：Fals(腹角)；
c：Bcl-2(腹角)；d：Bcl-2(背角).
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3 讨论
本研究发现，脊髓灰质各层均有多少不等，反应强度不一的Bcl-2免疫阳性反应神经元，而Bax和Fasl阳性神经元则主要集中在腹角及后角深部，表明在正常情况下猫脊髓的一些神经元内已含有Bcl-2，Bax 和Fasl. 但三者在脊髓的配布有差异. 该结果为Bcl-2，Bax 和Fasl蛋白在脊髓分布提供了重要的形态学证据. 本文推测，Bcl-2，Bax，Fasl在脊髓神经元的表达可能与脊髓神经元的某些生理过程有关.
从传统的观念来看，当谈及凋亡基因及其表达蛋白时，大多便和凋亡联系在一起. 事实上，细胞凋亡作为一种生理现象虽在胚胎期细胞广泛存在，但成体后并不是每种细胞都要发生凋亡. 例如，在中枢神经系统脊髓神经元的生理过程中，神经元就很少发生凋亡和增殖. 而我们观察到脊髓神经元仍有Bcl-2，Bax和FasL表达，提示，一定量的凋亡基因相关蛋白仍可能为正常神经元的生理过程所必需. 本文推测，神经元表达这些蛋白可能与神经元的某些生理功能有关. 虽然仍不能定论Bcl-2，Bax，FasL与神经元的功能的具体关系，但结合其它研究如Bcl-2营救发育中的神经元存活和Bax及FasL促进神经元死亡的事实[5]推测，这些物质在成体神经元表达，可能参与调控正常神经元的存活或某些功能的调控. 其在某种程度上可能构成了神经元生理功能或病理过程的基础. 如一些文献提示Bcl-2可抑制细胞凋亡，而Bax，Fas则促进凋亡.
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比较Bcl-2,Bax,FasL在脊髓的分布还发现，Bax，FasL仅分布于脊髓腹角及后角深部， 而在后角浅层亦有不少Bcl-2的阳性细胞.这种配布特征或许提示促进凋亡的物质更多配布于脊髓腹角. 我们分析这可能与脊髓前角神经元受损后比后角神经元更易死亡有关. 研究发现，当去除脊髓与外周的联系后，前角神经元死亡50%，而后角仅25%. 因此，当脊髓神经元受损后，当通过Bcl-2和Bax的平衡调控不能因Bcl-2表达的升高而促进神经元存活时，损伤的前角运动细胞更有机会通过Bax，FasL的表达而得以清除. 总的看来，Bcl-2，Bax 和Fasl在成年脊髓表达提示其与脊髓神经元的生理过程有关. 由于目前对凋亡基因在正常脊髓神经元的生理过程中的调控作用仍了解甚少，因此，Bcl-2，Bax，FasL在脊髓神经元中表达的功能意义仍不十分清楚. 本文提供的Bcl-2，Bax，FasL在脊髓神经元表达的形态学证据，为进一步探讨这些物质在脊髓神经元生理过程中的作用及其在损伤修复后的变化提供了初步线索. ■
参考文献：
, 百拇医药
[1] GLUCKAMA A. Cell deaths in normal vertebrate ontogeny[J]. Biol Rev Cambridge Phils Soc，1951，26:59
[2] KERR J F R. Apoptosis: a basic phenomenon wirh wide ranging implication in tisse kinetics[J]. Br J Cancer，1972，26:293
[3] BRUSCH W. The biochemistry of cell death by apoptosis[J]. Biochem Cell Biol，1990，88:1071
[4] KYPRIANOU N. Activation of programmed cell death in the rat ventral prostate[J]. Endocrinology，1998，122:552
[5] DAVIES A M. The Bcl-2 family of protein and the regulation of neuronal survival[J]. TINS，1995，18(8):355
收稿日期：1999-10-26, 百拇医药
单位：顾玲(昆明市延安医院神经科，昆明650032)；高玉陪(昆明市延安医院神经科，昆明650032)； 唐太昆(昆明市延安医院神经科，昆明650032)； 李斌(昆明市延安医院 神经科，昆明650032)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：成年猫脊髓；免疫组化；Bax；Bcl-2；Fasl
昆明医学院学学报000109 摘 要：采用免疫组化ABC法，观察凋亡基因Bax，Bcl-2，Fasl在成年猫脊髓的分布. 结果：在脊髓腹角、中间带及后角深部均见Bax，Bcl-2，Fasl阳性神经元. 反应物定位于细胞浆. 相对之，后角浅层除Bcl-2阳性神经元尚多外，Bax，Fasl阳性神经元较少. 提示Bax，Bcl-2，Fasl可能与成年猫脊髓神经元的生理功能有关. 且Bcl-2在脊髓的分布与Bax，Fasl略有差异.
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分类号：Q 426；R 651.2 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0037-03
The Expression of Bax，Bcl-2 and Fasl in The Spinal Cord of Adult Cat
GU Ling，GAO Yu-pei，TANG Tai-kun，LI Bin，( Dept. of Neuroscience，Yanan Hospital，Kunming 650032)
CHEN Yan-hong，WANG Ting-hua
(Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
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Abstract：Investigating the expression of Bax，Bcl-2 and Fasl in spinal cord of adult cat by immunohistochemistry ABC method. Results: The positive products of Bax，Bcl-2 and Fasl were located in many neurons of ventrolateral horn，intermidius zone and deep of dorsal horn. The subcellular localization of positive products is in cytoplasm. Comperatively，there is almost few positive neuron of Bax and Fasl in superficial of dorsal horn while a few Bcl-2 positive neurons were observed. The results indicated that the role of Bax，Bcl-2 and Fasl is related to the physiologyical function of some neurons in spinal cord. And the distribution between Bax，Fasl and Bcl-2 has a little difference.
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Key words：The spinal cord of adult cat;Immunohistochemistry;Bax； Bcl-2;Fasl▲
1951年，Glucksman首次提出在正常生物发育过程中存在大量的细胞死亡，即程序性细胞死亡[1]. 作为一种生理现象，其对维持发育中细胞数目的稳定而不致因细胞增殖过量具有重要的功能意义. 20 a后，Kerr等将程序细胞死亡正式命名为细胞凋亡(apoptosis)[2]. 现已清楚，细胞凋亡是在内源性基因调控下细胞的主动自杀过程[3]. 其凋亡的形态特征是染色质浓缩、边集(染色质浓缩后聚集于核膜下)，最后至凋亡小体形成(细胞破裂后细胞膜包裹染色质及细胞碎片形成)[4]. 而在这一系列过程中，凋亡基因表达蛋白水平的改变对细胞凋亡起到关键作用.
至今，已发现的凋亡基因相关蛋白中，Bax，Bcl-2，Fasl 是近年认为与细胞凋亡关系极为密切的3种凋亡基因相关蛋白. 了解其在组织中的分布，有利于认识其生理功能.本文用免疫组化ABC法观察成体猫脊髓Bax，Bcl-2，Fasl的分布.
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1 材料方法
1.1 标本获取
成年雄猫5只(体重3～3.5 kg)，用3.5%戊巴比妥钠(1.3 mL/kg)腹腔注射麻醉. 4%多聚甲醛心内灌注固定2 h，取L3节段脊髓后固定6 h，入20%蔗糖PBS下沉过夜. 制作20 μm厚的冰冻切片. 间断取片备用.
1.2 免疫组织化学染色
用Bax，Bcl-2，Fasl抗血清(滴度为1∶1 000，Santa Cruz)对切片行ABC免疫组织化学染色，DAB棕色反应呈色. 裱片，脱水，树胶封片.
1. 3 结果观察
在Olympus 显微镜下，观察Bax，Bcl-2，Fasl样免疫阳性产物在脊髓的分布.
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1. 4 阴性对照实验
用PBS代替Bax，Bcl-2和Fasl抗血清，其余程序同上.
2 结果
脊髓前角、中间带及后角深部均有Bax，Bcl-2，Fasl阳性反应神经元分布. 阳性反应物定位于细胞浆(附图). 相比之下，后角浅层除Bcl-2 阳性神经元稍多外，Bax和Fasl阳性神经元均较少(附图).
附图 脊髓免疫阳性神经元(400×)
a：Bax(腹角)；b：Fals(腹角)；
c：Bcl-2(腹角)；d：Bcl-2(背角).
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3 讨论
本研究发现，脊髓灰质各层均有多少不等，反应强度不一的Bcl-2免疫阳性反应神经元，而Bax和Fasl阳性神经元则主要集中在腹角及后角深部，表明在正常情况下猫脊髓的一些神经元内已含有Bcl-2，Bax 和Fasl. 但三者在脊髓的配布有差异. 该结果为Bcl-2，Bax 和Fasl蛋白在脊髓分布提供了重要的形态学证据. 本文推测，Bcl-2，Bax，Fasl在脊髓神经元的表达可能与脊髓神经元的某些生理过程有关.
从传统的观念来看，当谈及凋亡基因及其表达蛋白时，大多便和凋亡联系在一起. 事实上，细胞凋亡作为一种生理现象虽在胚胎期细胞广泛存在，但成体后并不是每种细胞都要发生凋亡. 例如，在中枢神经系统脊髓神经元的生理过程中，神经元就很少发生凋亡和增殖. 而我们观察到脊髓神经元仍有Bcl-2，Bax和FasL表达，提示，一定量的凋亡基因相关蛋白仍可能为正常神经元的生理过程所必需. 本文推测，神经元表达这些蛋白可能与神经元的某些生理功能有关. 虽然仍不能定论Bcl-2，Bax，FasL与神经元的功能的具体关系，但结合其它研究如Bcl-2营救发育中的神经元存活和Bax及FasL促进神经元死亡的事实[5]推测，这些物质在成体神经元表达，可能参与调控正常神经元的存活或某些功能的调控. 其在某种程度上可能构成了神经元生理功能或病理过程的基础. 如一些文献提示Bcl-2可抑制细胞凋亡，而Bax，Fas则促进凋亡.
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比较Bcl-2,Bax,FasL在脊髓的分布还发现，Bax，FasL仅分布于脊髓腹角及后角深部， 而在后角浅层亦有不少Bcl-2的阳性细胞.这种配布特征或许提示促进凋亡的物质更多配布于脊髓腹角. 我们分析这可能与脊髓前角神经元受损后比后角神经元更易死亡有关. 研究发现，当去除脊髓与外周的联系后，前角神经元死亡50%，而后角仅25%. 因此，当脊髓神经元受损后，当通过Bcl-2和Bax的平衡调控不能因Bcl-2表达的升高而促进神经元存活时，损伤的前角运动细胞更有机会通过Bax，FasL的表达而得以清除. 总的看来，Bcl-2，Bax 和Fasl在成年脊髓表达提示其与脊髓神经元的生理过程有关. 由于目前对凋亡基因在正常脊髓神经元的生理过程中的调控作用仍了解甚少，因此，Bcl-2，Bax，FasL在脊髓神经元中表达的功能意义仍不十分清楚. 本文提供的Bcl-2，Bax，FasL在脊髓神经元表达的形态学证据，为进一步探讨这些物质在脊髓神经元生理过程中的作用及其在损伤修复后的变化提供了初步线索. ■
参考文献：
, 百拇医药
[1] GLUCKAMA A. Cell deaths in normal vertebrate ontogeny[J]. Biol Rev Cambridge Phils Soc，1951，26:59
[2] KERR J F R. Apoptosis: a basic phenomenon wirh wide ranging implication in tisse kinetics[J]. Br J Cancer，1972，26:293
[3] BRUSCH W. The biochemistry of cell death by apoptosis[J]. Biochem Cell Biol，1990，88:1071
[4] KYPRIANOU N. Activation of programmed cell death in the rat ventral prostate[J]. Endocrinology，1998，122:552
[5] DAVIES A M. The Bcl-2 family of protein and the regulation of neuronal survival[J]. TINS，1995，18(8):355
收稿日期：1999-10-26, 百拇医药