人外周血致敏型γδ＋T细胞在体外的扩增
作者：陈松华 大野忠夫 刘伟 戴慧敏 车裕芳 王珏 葛锡锐
单位：陈松华 刘伟 戴慧敏 车裕芳 王珏 葛锡锐(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海200031)；大野忠夫(日本理化研究所细胞银行)
关键词：γδ+T细胞；体外扩增；致敏状态；TCRVδ2基因片段；
细胞与分子免疫学杂志000110
摘要:目的建立一种人外周血γδ+T细胞体外选择性扩增的模式：即在IL2的作用下，不需要γδ+TCR特异性配体(或抗原)的刺激，可使一类个体体外培养的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδ+T细胞发生优先增殖，逐渐成为培养细胞的主要群体。方法将10个γδ+TCR的个体的PBMC分别在含3×105U/LIL2培养液中培养1～2wk后，其中的γδ+T细胞的比率可达38%～78%。结果对3个这样的个体的扩增细胞做RTPCR分析表明，扩增出的γδ+T细胞表达TCRVδ2基因片段。这种γδ+T细胞体外优先扩增的性质类似于记忆性αβT细胞的体外生长特征，可能反映了γδ+T细胞在体内的致敏状态。结论该现象将有利于进一步了解γδ+T细胞在免疫系统中的地位和进化上的意义。
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中图号：R371.22 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0031-34
Preferential expansion of primed human γδ+T cells in culture
CHEN Song-hua LIU Wei DAI Hui-ming CHE Yu-fang WANG Jue GE Xi-rui
(Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)
Tadao OHNO
(Riken Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research(Riken) Tsukuba Science City, Japan )
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Abstract:Aim To establish one pattern of human peripheral γδ+ T cells growth in vitro. Methods Without the stimulation of specific γδ+ TCR ligands, the γδ+T cells in the cultured peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of 10 selected donors preferentially proliferated in a dose-dependent manner to IL-2. After 6-14 days of culture in the medium containing 3× 105U/L IL-2, the percentages of γδ+T cells rose to 38% -78% with the increase of cumulative cell numbers. Results RT-PCR analysis of the expanded γδ + T cells from 3 typical donors showed that they expressed TCR Vδ2 gene fragments. This kind of γδ + T cell expansion was similar to the memory αβT cell growth in vitro, which might represent the primed state of γδ + T cells in vitro. Conclusion This phenomenon will be beneficial for the understanding of γδ + T cells positions in immune system and significance in evolution.
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Keywords: γ δ + T cell;expansion in vitro; primed state; TCR Vδ2 gene fragment
虽然大量的实验结果已经表明，γδ+ T细胞在机体抗感染、抗病毒和抗肿瘤的免疫应答过程中，以及在某些自身免疫疾病的发生过程中具有重要的作用〔1〕，但人们对γδ+T细胞独特的生理功能和其在免疫进化上的意义，仍然没有获得明确的认识〔2〕。早期的研究报道，正常人外周血和淋巴器官中，γδ+ T细胞虽只占CD3+T细胞数量的约5%〔3〕，但研究γδ+T细胞增殖活化的条件，对了解γδ+T细胞的功能和地位具有关键的作用〔4〕。在前期工作中，我们采用γδ+TCR特异性配体磷酸单乙酯(monoethylphosphate,MEP)〔5〕和IL-2共刺激的方法，成功地建立了一种从人PBMC中，选择性扩增γδ+T细胞的培养系统：即不同个体的PBMC中的γδ+T细胞，对MEP和IL-2的共刺激表现出不同程度的增殖反应，表明这种γδ+ T细胞的选择性扩增依赖于MEP和IL-2的共同作用〔6〕。在本实验中我们观察到，有一类个体的外周血γδ+T细胞具有一种不同的体外选择性扩增模式：即在含有IL2的培养条件下，不需要MEP的作用。这类个体PBMC中的γδ+T细胞就可明显地优先增殖，并逐渐成为培养细胞中的主要群体。我们将这类个体称之为γδ+T细胞致敏(primed)型个体，将这种反应称为致敏型γδ+T细胞扩增。我们进一步对所扩增出的几个个体的γδ+T细胞的亚型做了一些研究，并对这种现象的免疫生物学意义做了一些初步的分析和讨论。
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1 材料和方法
1.1 材料 重组IL-2购自上海华新生物高科技公司。聚蔗糖-泛影葡胺(FicollHypaque)淋巴细胞分离液(比重1.077)为上海试剂二厂产品。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品。PE标记的小鼠抗人TCR γ/δ-1单克隆抗体(mAb)为Becton Dectio Dickinson公司产品。RNA抽提试剂由本实验室根据Chomczynski等〔7〕的方法配制。mRNA逆转录引物(Random Hexamer Primer)，购自Pharmacia公司。M-Mu-LV转录酶及其反应缓冲液，为Gibco公司产品。Taq酶及其反应缓冲液，购自Promega公司。0.1 mol/L DTT，2.5 mmol/L dNTPs及PCR DNA marker，均为华美生物工程公司的产品。用于PCR扩增的6个分别针对不同亚类的TCR Vδ区引物(forward)和一个共同的TCR Cδ区引物(reverse)，均由细胞所DNA合成组根据Falk等〔8〕报道的序列合成。
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1.2 方法
1.2.1 PBMC的分离培养和FACScan分析 用肝素抗凝，无菌取人PBMC，置于24孔培养板(Gibco)中，在37℃，50 mL/L CO2的饱和湿度条件下培养(细胞密度为5×108/L)。培养液为含100 mL/L自体血浆(autoplasma)及分别含不同浓度IL-2的RPMI 1640培养基。培养3 d时，换1/2培养液。在随后的培养时期，每2～3 d常规传代培养。传代培养液与原代培养液相同，传代细胞的浓度为5×108/L。在一定的培养时期，用血球细胞计数器测定培养细胞的浓度，计算出累积细胞总数。根据标准染色方法(Becton Dickison Monoclonal Antibody Source Book)，用PEanti TCRγ/δ-1 mAb将培养细胞染色，用流式细胞仪(FACScan)分析γδ+T细胞的比率。
1.2.2 RT-PCR分析γδ-TCRVδ RNA抽提采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法，从约3×106个培养细胞中抽提获得总RNA〔7〕。经真空干燥后，用25 μL DEPC水溶解总RNA。cDNA合成：取7 μL总RNA(约10 μg)和1 μL(25 pmol)Random Primer加入0.5 mL EP管中，混匀，65℃水浴5 min后，放入冰中冷却。然后，再加入2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，5×反转录缓冲液4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，M-MuLv反转录酶(200U)1 μL及ddH2O 1 μL，混匀。于37℃水浴1 h后，置-20℃备用。分别用6对引物做PCR扩增γδ+TCR的Vδ-Vδ6基因片段〔8〕：即在0.5 mL EP管中，加入cDNA 1 μL，1个Vδ区引物和共用的Cγ区引物各1 μL(25 pmol)，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCL2 3 μL及Taq酶5 μL，用ddH2O补充至 50 μL。然后，在DNA扩增仪上进行PCR扩增。反应温度为94℃ 1～2 min，50℃ 45 s和72℃ 1 min。35个循环之后，保温于72℃ 5 min。经20 g/L琼脂糖潜水电泳、EB染色后，拍照。
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2 结 果
2.1 致敏型γδ+T细胞的体外增殖 通过对50个个体的PBMC所做的实验，我们筛选了10个γδ+ T细胞致敏型个体(Lu YG,Chen SH, Tao G, Huang YM, Wang W, Shi WP, Wang ZY，Chen.Y，Hung TY, Hao GC)。当这类个体的PBMC分别在含3×105 U/L IL-2和100 mL/L自体血浆的RPMI 1640培养液中培养1～2 wk后，培养细胞的总数可增加1～10倍，γδ+T细胞的比率可达到38%～78%。γδ+T细胞的比率是在培养过程中逐渐增加的。图1显示的为典型致敏个体Lu YG的外周血γδ+T细胞对不同剂量IL-2的体外增殖反应过程。从图1可看出，培养8 d，γδ+T细胞增殖的总数与IL-2的浓度呈剂量依赖关系。
图1 致敏个体Lu YG的外周血γδ+T细胞对不同剂量
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IL-2的体外生长曲线
Fig 1 Growth curves of γδ+ T cells from primed donor Lu YG
in RPMI 1640 medium containing different contents of
IL-2 and 100 mL/L autoplasma
2.2 致敏型γδ+T细胞的TCRVδ亚型分析 我们采用RT-PCR方法，分析了几个致敏个体Chen SH，Lu YG和Wang ZY的体外扩增的致敏型γδ+T细胞的TCR Vδ基因片段。结果表明，致敏型γδ+T细胞表达Vδ2片段。图2A显示，体外培养细胞中的γδ+T细胞的比率已达84%。图2B显示，由Vδ2-Cδ这一对引物所扩增出的DNA带约为400 bp(大小与设计相符合)。阴性对照(加相对应的RNA，不加模板cDNA)表明，PCR实验无外源性污染，扩增的Vδ2基因片段是特异性的。用另外5对分别针对其它亚类的TCR Vδ区域的引物所做的实验，均没有扩增出特异性条带。
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图2 TCR Vδ2基因片段在扩增细胞中的表达
Fig 2 Expression of TCR Vδ2 gene fragments in expanded cells
PBMC cultured for 14 days in RPMI 1640 containing 50 mL/L
autoplasma and 3×105U/L IL-2
A: γδ+T cells percentage measured by FACS; B: TCR Vδ2 mR-NA detected by RT-PCR. 1: Negative control; 2. RT-PCR product of Vδ 2 gene;3:DNA marker.
, http://www.100md.com 3 讨 论
我们在研究γδ+T细胞体外扩增的工作中，观察到上述γδ+T细胞的致敏现象。对其中有些个体的PBMC，进行了时间间隔很长(有的达3 a)的多次实验，得到了可重复的结果(数据未显示)。现已证实，外周血γδ+T细胞致敏现象在人群中的存在具有普遍性，以及在个体体内维持的长期性。Zocchi等〔9〕曾报道过类似的现象：他们从某些人肺腺癌中分离出肿瘤浸润(TIL)的γδ+T细胞，当这些TIL细胞在只含IL-2而不含任何其它刺激剂的体外条件下培养时，可产生明显的扩增，并认为这反映了γδ+T细胞在体内肿瘤部位的预激活(prior activation in vivo)状态。此外，Testa等〔10〕在研究由IL-2诱导的LAK细胞的表型时观察到，尽管从大部分个体的PBMC中诱导出的LAK细胞由高度异质性细胞群体组成，但是从少数个体的PBMC中诱导出的LAK细胞含有很高比例的γδ+T细胞。通过比较，我们注意到，Testa等的培养液中，含有正常人的混合AB型血清，而不是自体血浆。然而，我们的实验结果显示，不同批号的混合AB型血清对γδ+T细胞的选择性体外扩增可产生不同程度的负作用；自体血浆对于保证成功地扩增的重复性是必需的(数据未显示)。
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因为我们所用的抗人TCRγ/δ-1 mAb能识别所有亚类的γδ+TCR〔11〕，所以，我们随后采用RT-PCR，对典型个体的致敏型γδ+T细胞的亚型进行了初步分析。结果表明，扩增出的γδ+T细胞可表达Vδ2基因片段(图2)。另外，Borst等〔12〕表明，在人外周γδ+TCR中，存在着Vγ9和Vδ2配对的绝对优势。因此，我们推测，从致敏个体PBMC所扩增出的γδ+T细胞为Vγ9Vδ2亚型。
这种γδ+T细胞的体外扩增现象，使人们联想起记忆性αβT细胞体外生长的某些特性。有工作表明，由于IL-2受体亚基在CD45RO+αβT细胞表面可优势表达，所以在体外培养时，它们对IL-2的反应加快、增殖加速〔13〕。此外，有研究报道，人外周血Vγ9Vδ2型T细胞表面可表达CD45RO分子〔14〕。综合以上情况我们推测，本实验所观察到的这种γδ+T细胞的体外选择性扩增，反映了体内γδ+T细胞的免疫记忆特性，即某些个体在生活史的某一阶段，曾受到过γδ+T细胞抗原的刺激，从而在体内产生记忆性γδ+T细胞。近年来，有关γδ+T细胞的研究进展，揭示了γδ+T细胞具有一些类似于NK细胞、巨噬细胞及B细胞的免疫应答特点〔15，16〕。然而，本结果表明，γδ+T细胞具有记忆性αβ T细胞的一些体外增殖反应的特征。对于这一现象的进一步探索，将有助于我们全面地认识γδ+T细胞的免疫学地位。
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基金项目：世界实验室MCD-1B计划(No.1-IV)资助项目
作者简介：陈松华，男，37岁，助理研究员，博士
上海市岳阳路320号.Tel.(021)64315030
参考文献：
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收稿日期：1999-01-28
修回日期：1999-04-09, 百拇医药
单位：陈松华 刘伟 戴慧敏 车裕芳 王珏 葛锡锐(中国科学院上海细胞生物学研究所，上海200031)；大野忠夫(日本理化研究所细胞银行)
关键词：γδ+T细胞；体外扩增；致敏状态；TCRVδ2基因片段；
细胞与分子免疫学杂志000110
摘要:目的建立一种人外周血γδ+T细胞体外选择性扩增的模式：即在IL2的作用下，不需要γδ+TCR特异性配体(或抗原)的刺激，可使一类个体体外培养的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδ+T细胞发生优先增殖，逐渐成为培养细胞的主要群体。方法将10个γδ+TCR的个体的PBMC分别在含3×105U/LIL2培养液中培养1～2wk后，其中的γδ+T细胞的比率可达38%～78%。结果对3个这样的个体的扩增细胞做RTPCR分析表明，扩增出的γδ+T细胞表达TCRVδ2基因片段。这种γδ+T细胞体外优先扩增的性质类似于记忆性αβT细胞的体外生长特征，可能反映了γδ+T细胞在体内的致敏状态。结论该现象将有利于进一步了解γδ+T细胞在免疫系统中的地位和进化上的意义。
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中图号：R371.22 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0031-34
Preferential expansion of primed human γδ+T cells in culture
CHEN Song-hua LIU Wei DAI Hui-ming CHE Yu-fang WANG Jue GE Xi-rui
(Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)
Tadao OHNO
(Riken Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research(Riken) Tsukuba Science City, Japan )
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Abstract:Aim To establish one pattern of human peripheral γδ+ T cells growth in vitro. Methods Without the stimulation of specific γδ+ TCR ligands, the γδ+T cells in the cultured peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of 10 selected donors preferentially proliferated in a dose-dependent manner to IL-2. After 6-14 days of culture in the medium containing 3× 105U/L IL-2, the percentages of γδ+T cells rose to 38% -78% with the increase of cumulative cell numbers. Results RT-PCR analysis of the expanded γδ + T cells from 3 typical donors showed that they expressed TCR Vδ2 gene fragments. This kind of γδ + T cell expansion was similar to the memory αβT cell growth in vitro, which might represent the primed state of γδ + T cells in vitro. Conclusion This phenomenon will be beneficial for the understanding of γδ + T cells positions in immune system and significance in evolution.
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Keywords: γ δ + T cell;expansion in vitro; primed state; TCR Vδ2 gene fragment
虽然大量的实验结果已经表明，γδ+ T细胞在机体抗感染、抗病毒和抗肿瘤的免疫应答过程中，以及在某些自身免疫疾病的发生过程中具有重要的作用〔1〕，但人们对γδ+T细胞独特的生理功能和其在免疫进化上的意义，仍然没有获得明确的认识〔2〕。早期的研究报道，正常人外周血和淋巴器官中，γδ+ T细胞虽只占CD3+T细胞数量的约5%〔3〕，但研究γδ+T细胞增殖活化的条件，对了解γδ+T细胞的功能和地位具有关键的作用〔4〕。在前期工作中，我们采用γδ+TCR特异性配体磷酸单乙酯(monoethylphosphate,MEP)〔5〕和IL-2共刺激的方法，成功地建立了一种从人PBMC中，选择性扩增γδ+T细胞的培养系统：即不同个体的PBMC中的γδ+T细胞，对MEP和IL-2的共刺激表现出不同程度的增殖反应，表明这种γδ+ T细胞的选择性扩增依赖于MEP和IL-2的共同作用〔6〕。在本实验中我们观察到，有一类个体的外周血γδ+T细胞具有一种不同的体外选择性扩增模式：即在含有IL2的培养条件下，不需要MEP的作用。这类个体PBMC中的γδ+T细胞就可明显地优先增殖，并逐渐成为培养细胞中的主要群体。我们将这类个体称之为γδ+T细胞致敏(primed)型个体，将这种反应称为致敏型γδ+T细胞扩增。我们进一步对所扩增出的几个个体的γδ+T细胞的亚型做了一些研究，并对这种现象的免疫生物学意义做了一些初步的分析和讨论。
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1 材料和方法
1.1 材料 重组IL-2购自上海华新生物高科技公司。聚蔗糖-泛影葡胺(FicollHypaque)淋巴细胞分离液(比重1.077)为上海试剂二厂产品。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品。PE标记的小鼠抗人TCR γ/δ-1单克隆抗体(mAb)为Becton Dectio Dickinson公司产品。RNA抽提试剂由本实验室根据Chomczynski等〔7〕的方法配制。mRNA逆转录引物(Random Hexamer Primer)，购自Pharmacia公司。M-Mu-LV转录酶及其反应缓冲液，为Gibco公司产品。Taq酶及其反应缓冲液，购自Promega公司。0.1 mol/L DTT，2.5 mmol/L dNTPs及PCR DNA marker，均为华美生物工程公司的产品。用于PCR扩增的6个分别针对不同亚类的TCR Vδ区引物(forward)和一个共同的TCR Cδ区引物(reverse)，均由细胞所DNA合成组根据Falk等〔8〕报道的序列合成。
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1.2 方法
1.2.1 PBMC的分离培养和FACScan分析 用肝素抗凝，无菌取人PBMC，置于24孔培养板(Gibco)中，在37℃，50 mL/L CO2的饱和湿度条件下培养(细胞密度为5×108/L)。培养液为含100 mL/L自体血浆(autoplasma)及分别含不同浓度IL-2的RPMI 1640培养基。培养3 d时，换1/2培养液。在随后的培养时期，每2～3 d常规传代培养。传代培养液与原代培养液相同，传代细胞的浓度为5×108/L。在一定的培养时期，用血球细胞计数器测定培养细胞的浓度，计算出累积细胞总数。根据标准染色方法(Becton Dickison Monoclonal Antibody Source Book)，用PEanti TCRγ/δ-1 mAb将培养细胞染色，用流式细胞仪(FACScan)分析γδ+T细胞的比率。
1.2.2 RT-PCR分析γδ-TCRVδ RNA抽提采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法，从约3×106个培养细胞中抽提获得总RNA〔7〕。经真空干燥后，用25 μL DEPC水溶解总RNA。cDNA合成：取7 μL总RNA(约10 μg)和1 μL(25 pmol)Random Primer加入0.5 mL EP管中，混匀，65℃水浴5 min后，放入冰中冷却。然后，再加入2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，5×反转录缓冲液4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，M-MuLv反转录酶(200U)1 μL及ddH2O 1 μL，混匀。于37℃水浴1 h后，置-20℃备用。分别用6对引物做PCR扩增γδ+TCR的Vδ-Vδ6基因片段〔8〕：即在0.5 mL EP管中，加入cDNA 1 μL，1个Vδ区引物和共用的Cγ区引物各1 μL(25 pmol)，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCL2 3 μL及Taq酶5 μL，用ddH2O补充至 50 μL。然后，在DNA扩增仪上进行PCR扩增。反应温度为94℃ 1～2 min，50℃ 45 s和72℃ 1 min。35个循环之后，保温于72℃ 5 min。经20 g/L琼脂糖潜水电泳、EB染色后，拍照。
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2 结 果
2.1 致敏型γδ+T细胞的体外增殖 通过对50个个体的PBMC所做的实验，我们筛选了10个γδ+ T细胞致敏型个体(Lu YG,Chen SH, Tao G, Huang YM, Wang W, Shi WP, Wang ZY，Chen.Y，Hung TY, Hao GC)。当这类个体的PBMC分别在含3×105 U/L IL-2和100 mL/L自体血浆的RPMI 1640培养液中培养1～2 wk后，培养细胞的总数可增加1～10倍，γδ+T细胞的比率可达到38%～78%。γδ+T细胞的比率是在培养过程中逐渐增加的。图1显示的为典型致敏个体Lu YG的外周血γδ+T细胞对不同剂量IL-2的体外增殖反应过程。从图1可看出，培养8 d，γδ+T细胞增殖的总数与IL-2的浓度呈剂量依赖关系。
图1 致敏个体Lu YG的外周血γδ+T细胞对不同剂量
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IL-2的体外生长曲线
Fig 1 Growth curves of γδ+ T cells from primed donor Lu YG
in RPMI 1640 medium containing different contents of
IL-2 and 100 mL/L autoplasma
2.2 致敏型γδ+T细胞的TCRVδ亚型分析 我们采用RT-PCR方法，分析了几个致敏个体Chen SH，Lu YG和Wang ZY的体外扩增的致敏型γδ+T细胞的TCR Vδ基因片段。结果表明，致敏型γδ+T细胞表达Vδ2片段。图2A显示，体外培养细胞中的γδ+T细胞的比率已达84%。图2B显示，由Vδ2-Cδ这一对引物所扩增出的DNA带约为400 bp(大小与设计相符合)。阴性对照(加相对应的RNA，不加模板cDNA)表明，PCR实验无外源性污染，扩增的Vδ2基因片段是特异性的。用另外5对分别针对其它亚类的TCR Vδ区域的引物所做的实验，均没有扩增出特异性条带。
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图2 TCR Vδ2基因片段在扩增细胞中的表达
Fig 2 Expression of TCR Vδ2 gene fragments in expanded cells
PBMC cultured for 14 days in RPMI 1640 containing 50 mL/L
autoplasma and 3×105U/L IL-2
A: γδ+T cells percentage measured by FACS; B: TCR Vδ2 mR-NA detected by RT-PCR. 1: Negative control; 2. RT-PCR product of Vδ 2 gene;3:DNA marker.
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我们在研究γδ+T细胞体外扩增的工作中，观察到上述γδ+T细胞的致敏现象。对其中有些个体的PBMC，进行了时间间隔很长(有的达3 a)的多次实验，得到了可重复的结果(数据未显示)。现已证实，外周血γδ+T细胞致敏现象在人群中的存在具有普遍性，以及在个体体内维持的长期性。Zocchi等〔9〕曾报道过类似的现象：他们从某些人肺腺癌中分离出肿瘤浸润(TIL)的γδ+T细胞，当这些TIL细胞在只含IL-2而不含任何其它刺激剂的体外条件下培养时，可产生明显的扩增，并认为这反映了γδ+T细胞在体内肿瘤部位的预激活(prior activation in vivo)状态。此外，Testa等〔10〕在研究由IL-2诱导的LAK细胞的表型时观察到，尽管从大部分个体的PBMC中诱导出的LAK细胞由高度异质性细胞群体组成，但是从少数个体的PBMC中诱导出的LAK细胞含有很高比例的γδ+T细胞。通过比较，我们注意到，Testa等的培养液中，含有正常人的混合AB型血清，而不是自体血浆。然而，我们的实验结果显示，不同批号的混合AB型血清对γδ+T细胞的选择性体外扩增可产生不同程度的负作用；自体血浆对于保证成功地扩增的重复性是必需的(数据未显示)。
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因为我们所用的抗人TCRγ/δ-1 mAb能识别所有亚类的γδ+TCR〔11〕，所以，我们随后采用RT-PCR，对典型个体的致敏型γδ+T细胞的亚型进行了初步分析。结果表明，扩增出的γδ+T细胞可表达Vδ2基因片段(图2)。另外，Borst等〔12〕表明，在人外周γδ+TCR中，存在着Vγ9和Vδ2配对的绝对优势。因此，我们推测，从致敏个体PBMC所扩增出的γδ+T细胞为Vγ9Vδ2亚型。
这种γδ+T细胞的体外扩增现象，使人们联想起记忆性αβT细胞体外生长的某些特性。有工作表明，由于IL-2受体亚基在CD45RO+αβT细胞表面可优势表达，所以在体外培养时，它们对IL-2的反应加快、增殖加速〔13〕。此外，有研究报道，人外周血Vγ9Vδ2型T细胞表面可表达CD45RO分子〔14〕。综合以上情况我们推测，本实验所观察到的这种γδ+T细胞的体外选择性扩增，反映了体内γδ+T细胞的免疫记忆特性，即某些个体在生活史的某一阶段，曾受到过γδ+T细胞抗原的刺激，从而在体内产生记忆性γδ+T细胞。近年来，有关γδ+T细胞的研究进展，揭示了γδ+T细胞具有一些类似于NK细胞、巨噬细胞及B细胞的免疫应答特点〔15，16〕。然而，本结果表明，γδ+T细胞具有记忆性αβ T细胞的一些体外增殖反应的特征。对于这一现象的进一步探索，将有助于我们全面地认识γδ+T细胞的免疫学地位。
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基金项目：世界实验室MCD-1B计划(No.1-IV)资助项目
作者简介：陈松华，男，37岁，助理研究员，博士
上海市岳阳路320号.Tel.(021)64315030
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收稿日期：1999-01-28
修回日期：1999-04-09, 百拇医药