人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体的构建及鉴定
作者：吴兴安 徐志凯 姜绍谆 阎岩 罗雯 白文涛 张芳琳 刘勇 王海涛
单位：吴兴安 徐志凯 姜绍谆 阎岩 罗雯 白文涛 张芳琳 刘勇 王海(第四军医大学微生物学教研室，陕西西安710032)
关键词：肾综合征出血热病毒；人源性抗体；真核表达；载体
细胞与分子免疫学杂志000106摘要:目的构建人源性抗HFRS病毒基因工程抗体基因的表达载体，为其进一步在真核细胞中表达奠定基础。方法：经多次克隆将人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体恒定区基因和抗生素筛选标记基因相连接，构建抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt及轻链真核表达载体VκEpSV-neo。结果重组质粒酶切鉴定表明，人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因已与载体pSV-gpt和pSV-neo正确连接。结论利用基因工程技术成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体。
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中图号:Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0020-22
Construction and identification of eukaryotic expression vectors bearing the gene of human antibody against HFRS virus
Wu Xingan, XU Zhikai, JIANG Shaozhun, YAN Yan, LUO Wen, BAI Wentao, ZHANG Fanglin, LIU Yong, WANG Haitao
Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Abstract:Aim To construct anti-HFRS virus human engineering antibody expression vectors and then to express it in eukaryotic cells. Methods The variable region genes of human anti-HFRS virus antibody were connected with human antibody constant region genes,antibiotic resistant gene and elements of eukaryotic expression regulation including promotor,leader sequence,enhancer and splice signal via several times cloning. Thus human antibody eukaryotic expression vectors VHEpSV-gpt and Vκ EpSV neo were constructed respectively. Results Variable region genes of human anti-HFRS virus antibody were connected with the vectors pSV-gpt and pSV-neo by enzyme digestion. Conclusion Eukaryotic expression vectors of human anti-HFRS virus antibody are constructed successfully by using engineering technoigue.
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Keywords: HFRS virus;human antibody;eukaryotic expression vector
肾综合征出血热(HFRS)在我国是危害最严重的急性病毒性传染病之一，目前尚无特异的有效疗法。80年代中期以来，我室相继制备了多株鼠源性抗HFRS病毒的单克隆抗体(mAb)〔1〕，并用于HFRS的病原学研究、实验室诊断、血清流行病学调查及感染动物的实验治疗等方面，取得较好的效果〔2，3〕。但由于鼠源性mAb对于人体为异种蛋白，用于临床治疗时受到很大的限制，故促使人们采用基因工程技术探讨研制人源性mAb〔4-6〕。我们将人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体恒定区基因相连接，成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体。
1 材料和方法
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1.1 材料大肠杆菌JM110(不修饰BclI位点)及大肠杆菌XLI-Blue四环素(Tet.)抗性，由中国预防医学科学院病毒学研究所梁米芳研究员惠赠。载体M13VHPCR1和M13VKPCR1由英国剑桥大学Winter教授馈赠，含有表达抗体所需的启动子、前导肽序列和剪接信号等真核表达元件。载体pSV-gpt和pSV-neo，由中国医学科学院肿瘤研究所李以莞教授惠赠，前者为13.4kb，含有人Igγ恒定区基因及筛选标记基因gpt；后者为10.4kb，含有人Igkappa恒定区基因和筛选标记基因neo。载体pGEM3zfE(含有增强子)由本室祝道成博士构建。pUCVHPCR1由本室阎岩讲师从M13VHPCR1和pUC18质粒而构建。重组质粒VH1A8sfi和Vκ1A8Xho分别含人源性抗HFRS病毒抗体VH基因及Vκ基因由作者构建。
1.2 方法将含人源性抗HFRS病毒抗体VH基因的重组质粒VH1A8sfi用PstⅠ和BstEⅡ酶切后，经15g/L琼脂糖凝胶电泳，回收360bp左右的HuVH带。再经多次克隆后，与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体γ重链恒定区基因和抗生素筛选标记基因gpt连接，构建抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt。将含Vκ基因的重组质粒Vκ1A8Xho用BglII和XbaⅠ酶切后，回收约330bp左右的HuVκ带；再用PvuⅡ酶切后，回收330bp左右的HuVκ带。与构建重链基因表达载体类似的方法，将人源性抗HFRS病毒抗体Vκ基因经多次克隆后，与各真核表达元件及人抗体κ轻链恒定区基因和抗生素筛选标记基因neo连接，构建轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo，流程见图2。
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2 结果
2.1 重链基因真核表达载体的构建将人源性抗HFRS病毒抗体VH基因经多次克隆以后，构建重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt，流程见图1。挑取4个单菌落提取质粒，用EcoRⅠ酶切，结果有2个克隆可切出1.5kb左右的片段，说明有目的片段插入，将其命名为VHEpSVgpt，2个为载体自连(图2)。再将2个阳性克隆用HindⅢ酶切鉴定插入方向，其中有1个为正向插入，1个为反向插入(图3)。
图1 人抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt的构建
Fig 1 Construction of eukaryotic expression vectorVHEpSV-gpt
heavy chain genes of human antibody
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图2 重组质粒VHEpSV-gpt的酶切鉴定(EcoRI)
Fig 2 Identification of recombinant plasmid VHEpSV-gpt by
enzyme digestion
1： DNA markers λ DNA/EcoR I plus Hind Ⅲ ;
2， 3： Positive clones； 4， 5： Negative clones.
图3重组质粒VHEpSV-gpt插入方向的鉴定(HindⅢ)
Fig 3 Identification of inserting direction of recombinant plasmid VHEpSV-gpt
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1： DNA markers λ DNA/EcoR Iplus Hind Ⅲ ; 2： Forward inserting clone;
3： Reverse inserting clone;4： Negative clone.
2.2 轻链基因真核表达载体的构建将人源性抗HFRS病毒抗体Vκ基因经多次克隆以后构建轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo，流程图4。挑取5个单菌落提取质粒，用HindⅢ酶切，结果有3个克隆可切出1.3kb左右的片段，表明有目的基因插入，命名为VκEpSV-neo，2个是载体自连(图5)。将3个阳性克隆用EcoRⅠ酶切鉴定方向，结果其中有1个为正向插入，2个为反向插入(图6)。
图4 人抗体轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo的构建
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Fig 4 Construction of eukaryotic expression vector Vκ EpSV-neo of human antibody of light chain genes
图5 重组质粒VκEpSV-neo的酶切鉴定
Fig 5 Identification of recombinant plasmid Vκ EpSV-neo by
enzyme digestion
1： DNA markers λ DNA/EcoRI plus Hind Ⅲ ;
2,3,4： Positive clones； 5,6： Negative clones.
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图6 重组质粒VκEpSV-neo插入方向的鉴定
Fig 6 Insertion direction analysis of recombinant plasmid
Vκ EpSV-neo
1： DNA markers λ DNA/EcoR I+ Hind Ⅲ ; 2： Forward inserting clone;
3， 4： Reverse inserting clones; 5： Negative clone.
图7 人源性抗HFRS病毒基因抗体真核表达载体
Fig 7 Eukaryotic expression vector bearing gene of human anti-
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body against HFRS virus
(A)： VHEpSV- gpt;(B)： Vκ EpSV- neo R:EcoR I;(B):BamH I; (H):Hind Ⅲ ;
(P):Promoter;(L):Leader; (E):Enhancer.
3 讨论
目的基因在真核细胞中表达，必须将其与启动子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件连接。除此之外，还需要有增强子。为了使抗HFRS病毒抗体基因能在真核细胞中有效表达，我们将抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件连接，并将增强子基因置于J区基因和恒定区基因之间，以得到高效表达。同时，为了能够得到更接近天然抗HFRS病毒的抗体，我们将带有启动子、前导肽序列和增强子的抗体可变区基因与编码人抗体Cγ和Cκ基因相连。采用的载体是pSV-gpt及pSV-neo，前者含有人抗体Cγ基因及抗生素筛选标记基因gpt，转染真核细胞以后,可用霉酚酸选择筛选；后者含有Cκ基因及抗生素筛选标记基因neo，转染真核细胞以后,可用G418选择筛选。将目的基因克隆入载体pSV-gpt及pSV-neo时，由于采用单酶切克隆(克隆重链基因时用EcoRⅠ，克隆轻链时用HindⅢ)，因此制备载体时，酶切回收以后，再将之去磷酸化反应，以尽可能地防止载体自连。另外，在鉴定重组质粒时，不仅要鉴定是否有目的基因插入，而且还要鉴定插入的方向，只有正向插入，才有表达活性。本研究采用酶切法鉴定目的基因的插入方向，成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因正向插入的真核表达载体(图7)，为下一步在真核细胞中表达人源性抗HFRS病毒抗体奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金资助,No.39570661
作者简介：吴兴安，男，31岁，讲师，博士西安市长乐西路17号.Tel.(029)3374526;
参考文献:
〔1〕汪力亚，郑仁瑞，徐志凯，等.肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体的建立与应用〔J〕.第四军医大学学报,1988;9(1):20-24.
〔2〕王海涛，徐志凯，汪力亚，等.检测肾综合征出血热循环免疫复合物的酶联免疫测定(ELISA)捕捉法的建立及初步应用〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,1995;9(3):269-271.
〔3〕徐志凯，汪力亚，王海涛，等.单克隆抗体治疗肾综合征出血热患者的初步观察〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志，1996;10(3):284-286.
, 百拇医药
〔4〕 Bruggemann M, Winter G, Waldmann H， et al. The immunogenicity of chimeric antibodies〔J〕 . J Exp Med， 1989;170(6):2153- 2157.
〔5〕 Bruggemann M, Neuberger MS. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice〔J〕 . Immunol Today, 1996;17(8):391- 397.
〔6〕 Ihara S, Maeda F, Takekoshi M, et al. Neutralizing human antibody specific for human cytomegalovirus in E.coli. expression system〔J〕 . Nippon Rinsho,1998;56(1):161～ 166.
收稿日期：1999-07-14
修回日期：1999-10-29, http://www.100md.com
单位：吴兴安 徐志凯 姜绍谆 阎岩 罗雯 白文涛 张芳琳 刘勇 王海(第四军医大学微生物学教研室，陕西西安710032)
关键词：肾综合征出血热病毒；人源性抗体；真核表达；载体
细胞与分子免疫学杂志000106摘要:目的构建人源性抗HFRS病毒基因工程抗体基因的表达载体，为其进一步在真核细胞中表达奠定基础。方法：经多次克隆将人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体恒定区基因和抗生素筛选标记基因相连接，构建抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt及轻链真核表达载体VκEpSV-neo。结果重组质粒酶切鉴定表明，人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因已与载体pSV-gpt和pSV-neo正确连接。结论利用基因工程技术成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体。
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中图号:Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0020-22
Construction and identification of eukaryotic expression vectors bearing the gene of human antibody against HFRS virus
Wu Xingan, XU Zhikai, JIANG Shaozhun, YAN Yan, LUO Wen, BAI Wentao, ZHANG Fanglin, LIU Yong, WANG Haitao
Department of Microbiology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
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Abstract:Aim To construct anti-HFRS virus human engineering antibody expression vectors and then to express it in eukaryotic cells. Methods The variable region genes of human anti-HFRS virus antibody were connected with human antibody constant region genes,antibiotic resistant gene and elements of eukaryotic expression regulation including promotor,leader sequence,enhancer and splice signal via several times cloning. Thus human antibody eukaryotic expression vectors VHEpSV-gpt and Vκ EpSV neo were constructed respectively. Results Variable region genes of human anti-HFRS virus antibody were connected with the vectors pSV-gpt and pSV-neo by enzyme digestion. Conclusion Eukaryotic expression vectors of human anti-HFRS virus antibody are constructed successfully by using engineering technoigue.
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Keywords: HFRS virus;human antibody;eukaryotic expression vector
肾综合征出血热(HFRS)在我国是危害最严重的急性病毒性传染病之一，目前尚无特异的有效疗法。80年代中期以来，我室相继制备了多株鼠源性抗HFRS病毒的单克隆抗体(mAb)〔1〕，并用于HFRS的病原学研究、实验室诊断、血清流行病学调查及感染动物的实验治疗等方面，取得较好的效果〔2，3〕。但由于鼠源性mAb对于人体为异种蛋白，用于临床治疗时受到很大的限制，故促使人们采用基因工程技术探讨研制人源性mAb〔4-6〕。我们将人源性抗HFRS病毒抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体恒定区基因相连接，成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料大肠杆菌JM110(不修饰BclI位点)及大肠杆菌XLI-Blue四环素(Tet.)抗性，由中国预防医学科学院病毒学研究所梁米芳研究员惠赠。载体M13VHPCR1和M13VKPCR1由英国剑桥大学Winter教授馈赠，含有表达抗体所需的启动子、前导肽序列和剪接信号等真核表达元件。载体pSV-gpt和pSV-neo，由中国医学科学院肿瘤研究所李以莞教授惠赠，前者为13.4kb，含有人Igγ恒定区基因及筛选标记基因gpt；后者为10.4kb，含有人Igkappa恒定区基因和筛选标记基因neo。载体pGEM3zfE(含有增强子)由本室祝道成博士构建。pUCVHPCR1由本室阎岩讲师从M13VHPCR1和pUC18质粒而构建。重组质粒VH1A8sfi和Vκ1A8Xho分别含人源性抗HFRS病毒抗体VH基因及Vκ基因由作者构建。
1.2 方法将含人源性抗HFRS病毒抗体VH基因的重组质粒VH1A8sfi用PstⅠ和BstEⅡ酶切后，经15g/L琼脂糖凝胶电泳，回收360bp左右的HuVH带。再经多次克隆后，与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件及人抗体γ重链恒定区基因和抗生素筛选标记基因gpt连接，构建抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt。将含Vκ基因的重组质粒Vκ1A8Xho用BglII和XbaⅠ酶切后，回收约330bp左右的HuVκ带；再用PvuⅡ酶切后，回收330bp左右的HuVκ带。与构建重链基因表达载体类似的方法，将人源性抗HFRS病毒抗体Vκ基因经多次克隆后，与各真核表达元件及人抗体κ轻链恒定区基因和抗生素筛选标记基因neo连接，构建轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo，流程见图2。
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2 结果
2.1 重链基因真核表达载体的构建将人源性抗HFRS病毒抗体VH基因经多次克隆以后，构建重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt，流程见图1。挑取4个单菌落提取质粒，用EcoRⅠ酶切，结果有2个克隆可切出1.5kb左右的片段，说明有目的片段插入，将其命名为VHEpSVgpt，2个为载体自连(图2)。再将2个阳性克隆用HindⅢ酶切鉴定插入方向，其中有1个为正向插入，1个为反向插入(图3)。
图1 人抗体重链基因真核表达载体VHEpSV-gpt的构建
Fig 1 Construction of eukaryotic expression vectorVHEpSV-gpt
heavy chain genes of human antibody
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图2 重组质粒VHEpSV-gpt的酶切鉴定(EcoRI)
Fig 2 Identification of recombinant plasmid VHEpSV-gpt by
enzyme digestion
1： DNA markers λ DNA/EcoR I plus Hind Ⅲ ;
2， 3： Positive clones； 4， 5： Negative clones.
图3重组质粒VHEpSV-gpt插入方向的鉴定(HindⅢ)
Fig 3 Identification of inserting direction of recombinant plasmid VHEpSV-gpt
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1： DNA markers λ DNA/EcoR Iplus Hind Ⅲ ; 2： Forward inserting clone;
3： Reverse inserting clone;4： Negative clone.
2.2 轻链基因真核表达载体的构建将人源性抗HFRS病毒抗体Vκ基因经多次克隆以后构建轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo，流程图4。挑取5个单菌落提取质粒，用HindⅢ酶切，结果有3个克隆可切出1.3kb左右的片段，表明有目的基因插入，命名为VκEpSV-neo，2个是载体自连(图5)。将3个阳性克隆用EcoRⅠ酶切鉴定方向，结果其中有1个为正向插入，2个为反向插入(图6)。
图4 人抗体轻链基因真核表达载体VκEpSV-neo的构建
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Fig 4 Construction of eukaryotic expression vector Vκ EpSV-neo of human antibody of light chain genes
图5 重组质粒VκEpSV-neo的酶切鉴定
Fig 5 Identification of recombinant plasmid Vκ EpSV-neo by
enzyme digestion
1： DNA markers λ DNA/EcoRI plus Hind Ⅲ ;
2,3,4： Positive clones； 5,6： Negative clones.
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图6 重组质粒VκEpSV-neo插入方向的鉴定
Fig 6 Insertion direction analysis of recombinant plasmid
Vκ EpSV-neo
1： DNA markers λ DNA/EcoR I+ Hind Ⅲ ; 2： Forward inserting clone;
3， 4： Reverse inserting clones; 5： Negative clone.
图7 人源性抗HFRS病毒基因抗体真核表达载体
Fig 7 Eukaryotic expression vector bearing gene of human anti-
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body against HFRS virus
(A)： VHEpSV- gpt;(B)： Vκ EpSV- neo R:EcoR I;(B):BamH I; (H):Hind Ⅲ ;
(P):Promoter;(L):Leader; (E):Enhancer.
3 讨论
目的基因在真核细胞中表达，必须将其与启动子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件连接。除此之外，还需要有增强子。为了使抗HFRS病毒抗体基因能在真核细胞中有效表达，我们将抗体可变区基因与启动子、增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真核表达元件连接，并将增强子基因置于J区基因和恒定区基因之间，以得到高效表达。同时，为了能够得到更接近天然抗HFRS病毒的抗体，我们将带有启动子、前导肽序列和增强子的抗体可变区基因与编码人抗体Cγ和Cκ基因相连。采用的载体是pSV-gpt及pSV-neo，前者含有人抗体Cγ基因及抗生素筛选标记基因gpt，转染真核细胞以后,可用霉酚酸选择筛选；后者含有Cκ基因及抗生素筛选标记基因neo，转染真核细胞以后,可用G418选择筛选。将目的基因克隆入载体pSV-gpt及pSV-neo时，由于采用单酶切克隆(克隆重链基因时用EcoRⅠ，克隆轻链时用HindⅢ)，因此制备载体时，酶切回收以后，再将之去磷酸化反应，以尽可能地防止载体自连。另外，在鉴定重组质粒时，不仅要鉴定是否有目的基因插入，而且还要鉴定插入的方向，只有正向插入，才有表达活性。本研究采用酶切法鉴定目的基因的插入方向，成功地构建了人源性抗HFRS病毒抗体基因正向插入的真核表达载体(图7)，为下一步在真核细胞中表达人源性抗HFRS病毒抗体奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金资助,No.39570661
作者简介：吴兴安，男，31岁，讲师，博士西安市长乐西路17号.Tel.(029)3374526;
参考文献:
〔1〕汪力亚，郑仁瑞，徐志凯，等.肾综合征出血热病毒血凝素单克隆抗体的建立与应用〔J〕.第四军医大学学报,1988;9(1):20-24.
〔2〕王海涛，徐志凯，汪力亚，等.检测肾综合征出血热循环免疫复合物的酶联免疫测定(ELISA)捕捉法的建立及初步应用〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,1995;9(3):269-271.
〔3〕徐志凯，汪力亚，王海涛，等.单克隆抗体治疗肾综合征出血热患者的初步观察〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志，1996;10(3):284-286.
, 百拇医药
〔4〕 Bruggemann M, Winter G, Waldmann H， et al. The immunogenicity of chimeric antibodies〔J〕 . J Exp Med， 1989;170(6):2153- 2157.
〔5〕 Bruggemann M, Neuberger MS. Strategies for expressing human antibody repertoires in transgenic mice〔J〕 . Immunol Today, 1996;17(8):391- 397.
〔6〕 Ihara S, Maeda F, Takekoshi M, et al. Neutralizing human antibody specific for human cytomegalovirus in E.coli. expression system〔J〕 . Nippon Rinsho,1998;56(1):161～ 166.
收稿日期：1999-07-14
修回日期：1999-10-29, http://www.100md.com