携带共扩增基因的CHO细胞表达载体的构建
作者：刘国奇 陈小密 徐静 宋宏彬 于长明 童贻刚 王海涛
单位：刘国奇 陈小密 徐静 宋宏彬 于长明 童贻刚 王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所，北京100071)
关键词：二氢叶酸还原酶；表达载体；中国仓鼠卵巢细胞；绿色荧光蛋白
细胞与分子免疫学杂志000105
摘要：目的构建携带共扩增基因的CHO细胞表达载体。方法以质粒载体pCI-neo为骨架，应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的cDNA，构建了哺乳动物细胞表达载体pCdhfr1。把绿色荧光蛋白基因亚克隆到pCdhfrl的多克隆位点，构建了表达质粒pFP。结果经脂质体法转染CHO细胞，以氨甲喋呤为选择标记，经过一轮扩增后，获得表达绿色荧光蛋白的CHO细胞株。结论应用CHO/DHFR表达系统，为构建CHO细胞的工程细胞株建立了良好的模型。
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中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0017-19
Construction of a CHO cell expression vector carrying coamplification gene
LIU Guo-qi,CHEN Xiao-mi,XU Jing,SONG Hong-bin,YU Chang-ming,TONG Yi-gang, WANG Hai-tao
Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071， China
Abstract:Aim To construct a CHO cell expression vector carrying coamplification gene. Methods Based on the mammalian expression vector pCI-neo, a new mammalian expression vector pCdhfrl was constructed with dihydrofolate reductase(dhfr) gene as selection and coamplification marker. To evaluate its applied value, the enhanced green fluorescent protein(EGFP) gene was subcloned into pCdhfr l and the recombinant expression plasmid pFP was transfected into Chinese hamster ovary(CHO) cells mediated via liposome. Results After one cycle of amplification by methotrexate(Mtx), the CHO cell colonies stably expressed green fluorescent protein. Conclusion A model for the construction of engineered CHO cell line producing recombinant protein with CHO/DHFR system is established.
, 百拇医药
Keywords: dihydrofolate reductase； expression vector; CHO cell; green fluorescent protein
哺乳动物细胞是表达具有天然活性的哺乳动物蛋白的最佳宿主。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞〔1〕。研究表明，克隆化基因在CHO细胞中的稳定表达受诸多因素的影响，采用高表达载体系统是实现外源基因高表达的重要途径之一。真核生物基因高表达载体一般含有如下调控元件：启动子、增强子，多聚腺苷酸加尾信号(PolyA)和内含子等。在表达载体中加入共扩增基因，可大大提高外源基因的表达水平。这种策略对开发具有商业价值的基因工程产品尤为重要，在生物制药业中展现了美好的应用前景。我们以表达质粒pCI-neo为骨架，应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)cDNA，构建了共扩增表达质粒载体pCdhfrl。并以绿色荧光蛋白(EGFP)基因〔2〕作为报告基因，验证了运用该表达载体建立稳定CHO细胞株的可行性。
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1 材料和方法
1.1 材料 E.coli XLl-Blue本室保藏。质粒pCl-neo和pIRESneo/EGFP分别购自美国Promega和Clontech公司。pSH2由本室构建并保存。CHO(dhfr-)细胞株购自美国ATCC(CRL-9096)。用于CHO细胞的培养的IMDM培养基和胎牛血清，为Hyclone产品。DNA限制性内切酶、T4 DNA ligase，Klenow，T4 DNA聚合酶和胰蛋白酶，均购自Takara公司。氨苄青霉素、硫酸链霉素购自华美生物工程公司，使用质量浓度均为80 mg/L，氨甲喋呤购自上海华联制药有限公司，使用浓度最低为100 nmol/L。
1.2 方法 E.coli质粒的提取，采用Qiagen试剂盒；质粒构建的操作方法参见《分子克隆》一书。CHO细胞的转染采用脂质体法，详见Life Technologies的转染试剂使用说明。转染后4 h，换新鲜培养基，48 h后加入选择药物氨甲喋呤。待细胞形成克隆，观察EGFP的表达。
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2 结 果
2.1 表达载体pCdhfr 1的构建 pCdhfr 1的dhfr cDNA来源于质粒pSH2(图1)。pSH2用Bgl II消化后，Klenow酶补平3′凹端，再用Hind III酶切，于低熔点琼脂糖中分离0.7 kb的片段。载体pCI-neo先用BstX I酶切后，用T4 DNA聚合酶削平3′凸端，再用Hind III酶切，去除neo片段，加入分离后的dhfr基因片段。采用3片断相连，将上述0.7 kb的dhfr基因亚克隆到Hind III/BstX I位点，筛选出正确连接的克隆，即得到携带dhfr的共扩增表达载体pCdhfr1(图1、2)。
图1 质粒pCdhfr 1的构建
Fig 1 Construction of plasmid pCdhfr 1
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图2 质粒pCdhfr 1和pFP的酶切鉴定
Fig 2 Restriction enzyme analysis of pCdhfrl and pFP
1:λDNA/Hind III+EcoR I; 2:pFP/EcoR I+Not I; 3:pFP/EcoR I; 4:pFP;5:pCdhfr l/EcoR I;6:pCdhfr l/Sac I;7:pCdhfr l/Hind III;8:pCdhfr l.
2.2 携带EGFP基因表达质粒pFP的构建 为检测pCdhfr 1的应用价值，用EGFP基因作为报告基因构建了表达质粒pFP。表达质粒的构建路线是：用 EcoR I和Sma I双切质粒pIRESneo/EGFP，分离0.7kb的EGFP基因片段，并亚克隆到pCdhfr 1的EcoR I/Sma I位点，构建表达质粒pFP。经酶切鉴定与预期的结果一致(图2，3)。
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图3 质粒pFP的构建
Fig 3 Construction of plasmid pFP
2.3 EGFP基因在CHO细胞中的表达 用脂质体法转染CHO细胞，72 h后于荧光显微镜下，可观察到EGFP的表达。选择药物氨甲喋呤的浓度为100 nmol/L，经加压，一轮扩增后，EGFP在CHO细胞中的表达情况如图4。
图4 EGFP基因在CHO细胞中的表达(×400)
Fig 4 Expression of EGFP gene in CHO cells(×400)
3 讨 论
本文以pCI-neo为骨架，构建了携带共扩增基因dhfr的哺乳动物细胞表达质粒pCdhfr 1。因此，除具有pCI-neo的优点：如携带较强的CMV启动子，人工合成的内含子，SV40的晚期PolyA加尾信号外，还携带dhfr共扩增基因。有文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼DNA序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平〔3〕，因而使这种携带共扩增基因的表达载体，在表达具有商业开发价值的基因时倍受青睐。我们通过EGFP基因初步验证，pCdhfr 1在构建CHO细胞稳定表达细胞株中的应用价值。此外，我们用此载体构建了携带中国人神经生长因子基因的CHO细胞株，其表达产物的活性经鸡胚背神经节培养测定已得到证实(资料待另文发表)。EGFP在CHO细胞株的成功表达，为运用CHO/DHFR系统构建表达克隆化基因的CHO细胞株建立了良好的模型。
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基金项目：国家八六三计划生物技术资助项目，No.Z18-01
作者简介：刘国奇，男，35岁，理学博士北京市丰台东大街20号.Tel.(010)66948563
参考文献 ：
〔1〕 Rolf GW, Wolfgang N, Kristina k, et al. Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals〔J〕 . Drug Res, 1998; 48(II), Nr. 8;870- 880.
〔2〕 Comack BP. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)〔J〕 .Gene, 1996; 173:33- 38.
〔3〕 Kaufman RJ. Strategies for high level in mammalian cells〔J〕 . Techinique, 19990;2:221- 236.
收稿日期：1999-05-14
修回日期：1999-08-03, http://www.100md.com
单位：刘国奇 陈小密 徐静 宋宏彬 于长明 童贻刚 王海涛(军事医学科学院微生物流行病学研究所，北京100071)
关键词：二氢叶酸还原酶；表达载体；中国仓鼠卵巢细胞；绿色荧光蛋白
细胞与分子免疫学杂志000105
摘要：目的构建携带共扩增基因的CHO细胞表达载体。方法以质粒载体pCI-neo为骨架，应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的cDNA，构建了哺乳动物细胞表达载体pCdhfr1。把绿色荧光蛋白基因亚克隆到pCdhfrl的多克隆位点，构建了表达质粒pFP。结果经脂质体法转染CHO细胞，以氨甲喋呤为选择标记，经过一轮扩增后，获得表达绿色荧光蛋白的CHO细胞株。结论应用CHO/DHFR表达系统，为构建CHO细胞的工程细胞株建立了良好的模型。
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中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0017-19
Construction of a CHO cell expression vector carrying coamplification gene
LIU Guo-qi,CHEN Xiao-mi,XU Jing,SONG Hong-bin,YU Chang-ming,TONG Yi-gang, WANG Hai-tao
Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071， China
Abstract:Aim To construct a CHO cell expression vector carrying coamplification gene. Methods Based on the mammalian expression vector pCI-neo, a new mammalian expression vector pCdhfrl was constructed with dihydrofolate reductase(dhfr) gene as selection and coamplification marker. To evaluate its applied value, the enhanced green fluorescent protein(EGFP) gene was subcloned into pCdhfr l and the recombinant expression plasmid pFP was transfected into Chinese hamster ovary(CHO) cells mediated via liposome. Results After one cycle of amplification by methotrexate(Mtx), the CHO cell colonies stably expressed green fluorescent protein. Conclusion A model for the construction of engineered CHO cell line producing recombinant protein with CHO/DHFR system is established.
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Keywords: dihydrofolate reductase； expression vector; CHO cell; green fluorescent protein
哺乳动物细胞是表达具有天然活性的哺乳动物蛋白的最佳宿主。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是用于真核生物基因表达较为成功的宿主细胞〔1〕。研究表明，克隆化基因在CHO细胞中的稳定表达受诸多因素的影响，采用高表达载体系统是实现外源基因高表达的重要途径之一。真核生物基因高表达载体一般含有如下调控元件：启动子、增强子，多聚腺苷酸加尾信号(PolyA)和内含子等。在表达载体中加入共扩增基因，可大大提高外源基因的表达水平。这种策略对开发具有商业价值的基因工程产品尤为重要，在生物制药业中展现了美好的应用前景。我们以表达质粒pCI-neo为骨架，应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)cDNA，构建了共扩增表达质粒载体pCdhfrl。并以绿色荧光蛋白(EGFP)基因〔2〕作为报告基因，验证了运用该表达载体建立稳定CHO细胞株的可行性。
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1 材料和方法
1.1 材料 E.coli XLl-Blue本室保藏。质粒pCl-neo和pIRESneo/EGFP分别购自美国Promega和Clontech公司。pSH2由本室构建并保存。CHO(dhfr-)细胞株购自美国ATCC(CRL-9096)。用于CHO细胞的培养的IMDM培养基和胎牛血清，为Hyclone产品。DNA限制性内切酶、T4 DNA ligase，Klenow，T4 DNA聚合酶和胰蛋白酶，均购自Takara公司。氨苄青霉素、硫酸链霉素购自华美生物工程公司，使用质量浓度均为80 mg/L，氨甲喋呤购自上海华联制药有限公司，使用浓度最低为100 nmol/L。
1.2 方法 E.coli质粒的提取，采用Qiagen试剂盒；质粒构建的操作方法参见《分子克隆》一书。CHO细胞的转染采用脂质体法，详见Life Technologies的转染试剂使用说明。转染后4 h，换新鲜培养基，48 h后加入选择药物氨甲喋呤。待细胞形成克隆，观察EGFP的表达。
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2 结 果
2.1 表达载体pCdhfr 1的构建 pCdhfr 1的dhfr cDNA来源于质粒pSH2(图1)。pSH2用Bgl II消化后，Klenow酶补平3′凹端，再用Hind III酶切，于低熔点琼脂糖中分离0.7 kb的片段。载体pCI-neo先用BstX I酶切后，用T4 DNA聚合酶削平3′凸端，再用Hind III酶切，去除neo片段，加入分离后的dhfr基因片段。采用3片断相连，将上述0.7 kb的dhfr基因亚克隆到Hind III/BstX I位点，筛选出正确连接的克隆，即得到携带dhfr的共扩增表达载体pCdhfr1(图1、2)。
图1 质粒pCdhfr 1的构建
Fig 1 Construction of plasmid pCdhfr 1
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图2 质粒pCdhfr 1和pFP的酶切鉴定
Fig 2 Restriction enzyme analysis of pCdhfrl and pFP
1:λDNA/Hind III+EcoR I; 2:pFP/EcoR I+Not I; 3:pFP/EcoR I; 4:pFP;5:pCdhfr l/EcoR I;6:pCdhfr l/Sac I;7:pCdhfr l/Hind III;8:pCdhfr l.
2.2 携带EGFP基因表达质粒pFP的构建 为检测pCdhfr 1的应用价值，用EGFP基因作为报告基因构建了表达质粒pFP。表达质粒的构建路线是：用 EcoR I和Sma I双切质粒pIRESneo/EGFP，分离0.7kb的EGFP基因片段，并亚克隆到pCdhfr 1的EcoR I/Sma I位点，构建表达质粒pFP。经酶切鉴定与预期的结果一致(图2，3)。
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图3 质粒pFP的构建
Fig 3 Construction of plasmid pFP
2.3 EGFP基因在CHO细胞中的表达 用脂质体法转染CHO细胞，72 h后于荧光显微镜下，可观察到EGFP的表达。选择药物氨甲喋呤的浓度为100 nmol/L，经加压，一轮扩增后，EGFP在CHO细胞中的表达情况如图4。
图4 EGFP基因在CHO细胞中的表达(×400)
Fig 4 Expression of EGFP gene in CHO cells(×400)
3 讨 论
本文以pCI-neo为骨架，构建了携带共扩增基因dhfr的哺乳动物细胞表达质粒pCdhfr 1。因此，除具有pCI-neo的优点：如携带较强的CMV启动子，人工合成的内含子，SV40的晚期PolyA加尾信号外，还携带dhfr共扩增基因。有文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼DNA序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平〔3〕，因而使这种携带共扩增基因的表达载体，在表达具有商业开发价值的基因时倍受青睐。我们通过EGFP基因初步验证，pCdhfr 1在构建CHO细胞稳定表达细胞株中的应用价值。此外，我们用此载体构建了携带中国人神经生长因子基因的CHO细胞株，其表达产物的活性经鸡胚背神经节培养测定已得到证实(资料待另文发表)。EGFP在CHO细胞株的成功表达，为运用CHO/DHFR系统构建表达克隆化基因的CHO细胞株建立了良好的模型。
, 百拇医药
基金项目：国家八六三计划生物技术资助项目，No.Z18-01
作者简介：刘国奇，男，35岁，理学博士北京市丰台东大街20号.Tel.(010)66948563
参考文献 ：
〔1〕 Rolf GW, Wolfgang N, Kristina k, et al. Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals〔J〕 . Drug Res, 1998; 48(II), Nr. 8;870- 880.
〔2〕 Comack BP. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein(GFP)〔J〕 .Gene, 1996; 173:33- 38.
〔3〕 Kaufman RJ. Strategies for high level in mammalian cells〔J〕 . Techinique, 19990;2:221- 236.
收稿日期：1999-05-14
修回日期：1999-08-03, http://www.100md.com