氧化型低密度脂蛋白和抗氧化剂对人血管内皮细胞钙转运的影响
作者：徐雅琴 唐朝枢 张钧华 曹静 宁涛 柯杨
单位：徐雅琴(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；张钧华(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；曹静(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；宁涛(北京医科大学临床肿瘤学研究所，北京 100034)；柯杨(北京医科大学临床肿瘤学研究所，北京 100034)
关键词：氧化型低密度脂蛋白；抗氧化剂；维生素E；钙；内皮 ，血管；信号转导
中国动脉硬化杂志000108[摘 要] 为探讨氧化型低密度脂蛋白和抗氧化剂对内皮细胞钙转运功能的影 响，揭示氧化型低密度脂蛋白毒 性作用的分子机制和预防措施，采用体外培养的人脐静脉内皮细胞，单独给予氧化型低密度 脂蛋白及同时给予氧化型低密度脂蛋白和抗氧化剂维生素E，分别测定细胞钙摄取和释放功 能，并测定细胞及上清液乳酸脱氢酶活性，计算细胞死亡率。结果发现，氧化型低密度脂 蛋 白呈剂量依赖性增加细胞死亡率，同时刺激内皮细胞钙摄取增加，对钙释放无影响，维生素 E可抑制氧化型低密度脂蛋白的上述作用。结果提示，氧化型低密度脂蛋白刺激内皮细胞钙 摄取可能是其致内皮细胞损伤的机制，维生素E通过抑制此作用而达到细胞保护的效应。
, 百拇医药
[中图分类号] R329.2+5 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0032-03
The Effect of Oxidized Low Density Lipoprotein and Antioxidant on Calcium Transp ortation of Human Vascular Endothelial Cells
XU Ya-Qin TANG Chao-Shu ZHANG Jun-Hua CAO Jing NING Tao KE Yang
(The Department of Cardiology, First Hospital， Beijing Medical University，B eijing 100034,China)
, http://www.100md.com
ABSTRACT Aim To examine the effects of oxidized low densi ty lipoprotein (ox- LDL) and antioxidant on calcium transportation of human vascular endothelial cel ls, then explore the molecular mechanism of cytotoxicity induced by ox-LDL. Meth ods Confluent primary cultures of human umbilical vein endotheli al cells (hUVEC) were exposed respectively to ox-LDL or ox-LDL and vitamin E in medium. The u pt ake and release of calcium by hUVEC were measured. The mortality of hUVEC we re assessed by the messurement of LDH. Results Ox-LD L enhanced the mortality of hUVEC and the uptake of calcium by hUVEC with a dose-dependence manner, wh ile vitamin E inhibited these effects. Conclusions Ox-LDL may stimulate th e uptake of calcium by hUVEC, leading to hUVEC injury. Vitamin E could protect hUVEC from such cytotoxic effect by inhibitting cellular uptake of calcium.
, http://www.100md.com
MeSH Oxidized Low Density Lipoprotein； Antioxidants; Vitam inE; Calcium; Endothelium,Vascular; Signal Transduction
氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱发的内皮细胞损伤 是导致动脉粥样硬化、高血压等血管损伤性疾病的重要因素，但其详尽机制还不甚明了。有 研究显示，氧化型低密度脂蛋白可引起剂量依赖的细胞内游离钙浓度升高,同时造成内皮细 胞损伤，推测Ca2+信号转导通路的激活可能是氧化型低密度脂蛋白内皮损伤的机制， 但这种钙浓度升高是由于细胞摄取细胞外钙增加和/或细胞内钙释放引起尚不清楚 [1,3]。本工作通过检测氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞(human umbilical v ein endothelial cells ，hUVEC)钙摄取和释放功能的影响以及抗氧 化剂维生素E的干预保护作用，以期揭示氧化型低密度脂蛋白 毒性作用的分子机制和预防措施。
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1 材料和方法
1.1 材料
人脐静脉内皮细胞系由北京市肿瘤研究所提供，低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)购自北京协和医科大学基础 所，Nicardipin和维生素E购自Sigma公司，45Ca为Dupont NEN产品，RPMI1640购自G ibco公司。
1.2 人脐静脉内皮细胞系培养
人脐静脉内皮细胞系用含10%胎牛血清的1640培养基培养，细胞汇集成 单层达80%，0.01%胰酶37℃消化5 min，以1×105 cells接种于24孔板，贴壁24 h，换 无血清培养基培养24 h，然后分组加药。
1.3 氧化型低密度脂蛋白的制备
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参照张林华等[2]方法分离制备人血清低密度脂蛋白，采用考马斯亮兰 法做低密度脂蛋白蛋白定量，低密度脂蛋白在含5 μmol/L CuSO4的PBS中氧化20 h (37 ℃ )。低密度脂蛋白氧化修饰程度通过测定硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)值，氧化型低密度 脂蛋白产生的丙二醛是低密度脂蛋白的4.3倍。
1.4 实验分组
①对照组；②ox-LDL (25 mg/L)组； ③ox-LDL (50 mg/L)组；④ox-LDL(100 mg/L)组；⑤维生素E(50 mg/L)+ ox-LDL(50 mg/L)组；⑥Nicardipin(1 μmo l/L)+ ox-LDL (50 mg/L)组
1.5 细胞钙摄取功能测定
2×105内皮细胞无血清培养24 h，分组加药，37℃孵育8 h，冷PBS 洗3遍，KRB液(含葡萄糖11 mmol/L、HEPES 30 mmol/L、0.1%牛血清白蛋白、NaCl 136 mmo l/L、KCl 4.0 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L及MgCl2 1.0 mmol/L，pH 7.35)37℃预孵育 10 min，加45CaCl2 1 m Ci/L，37℃孵育5 min，冰浴下刮下细胞置于滤膜上，抽 干加闪烁液 ，液闪仪测定滤膜放射性计数。
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1.6 细胞钙释放功能测定
45 Ca负荷操作同上述，加45CaCl2 1 u，37℃孵育10 min后， 冷PBS洗5遍，无Ca的KRB液37℃预孵育2 min，取0.2 mL孵育液，加闪烁液，液闪仪测定放射 性计数。
1.7 乳酸脱氢酶活性测定
采用Wrablewski等[5]报道的方法分别测培养液和细胞内乳酸脱氢酶 活性，细胞死亡率=培养液乳酸脱氢酶活性÷(细胞内乳酸脱氢酶活性+培 养液乳酸脱氢酶活性)×100%。
1.8 统计学处理
数据以±s表示，采 用方差分析组间q检验进行统计学处理，P<0.05表示有统计学意义。
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2 结果
2.1 氧化型低密度脂蛋白及维生素E对内皮细胞钙摄取及释放的影响
氧化型低密度脂蛋白(25、50和100 mg/L)呈浓 度依赖性刺激内皮细胞钙摄取增加(69%、 131%和192%，P<0.01)，预先 加维生素E和钙通道 拮抗剂nicardipin处理则抑制了此效应。但不同浓度的氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞 钙释放无明显影响，预先加维生素E及钙通道拮抗剂后亦未产生明显影响(表1，Table 1) 。
2.2 氧化型低密度脂蛋白及维生素E对内皮细胞死亡率的影响
与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白(25、50、100 mg/L)呈浓度依赖性增加内皮细胞死亡 率(P<0.05)，预先加维生素E和钙通道阻断剂nicardipin后细胞死亡率 明显下降(P<0.01)，见表1(Table 1)。
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表1. 维生素E和不同浓度氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞钙
转运功能及内皮细胞死 亡率的影响
Table 1. The effects of vitamin E and different ox-LDL
concentration on t he calcium transportation and
the mortality of endothelial cells (μmol/106 cells，n=6) Groups
Ca2+ uptake
Ca2+ release
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Mortality
Control
520±158
78±23
7.03±0.21
Ox-LDL(25 mg/L)
880±183a
73±14
9.02±1.35b
Ox-LDL(50 mg/L)
1204±386a
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78±17
15.78±2.53b
Ox-LDL(100 mg/L)
1519±518a
107±45
19.22±3.68b
VitE+ox-LDL
620±247c
94±12
10.57±1.69c
, 百拇医药
Nicardipin+ox-LDL
436±181
74±17
11.31±1.32
a: P<0.01, b: P<0.05，compared with control gro up； c:P<0.01, compared with ox-LDL (50 mg/L) group
3 讨论
近年来，关于氧化型低密度脂蛋白与细胞特异性受体结合激活细胞内第二信使途径进而产生 一系列生物学效应的信号转导通路的研究越来越受到关注。其中，氧化型低密度脂蛋白引起 细胞内游离钙 浓度升高被认 为是氧化型低密度脂蛋白造成内皮细胞损伤的机制之一。细胞浆Ca2+源于细胞外Ca2+内入和细胞内Ca2+库(如内质网)释放，细胞外Ca2+主要通过Ca2+ 通道进入细胞，而细胞内Ca2+ 主要通过质膜钙泵、 Na+/Ca2+交换释放出细胞外。此外，肌浆网上钙泵对钙的摄取也参与了细胞内Ca 2+浓度调节。
, 百拇医药
本研究应用不同浓度的氧化型低密度脂蛋白刺激hUVEC，引起浓度依赖性内皮细胞死亡 率增加,这与其他学者研究结果一致[6]。同等浓度的氧化型低密度脂蛋白作用内 皮细胞时发现，氧化型低密度脂蛋白对细胞钙释放功 能无影响，而呈浓度依赖地促进细胞钙摄取增加，应用钙通道阻断剂可有效抑制此效应，表 明氧化型低密度脂蛋白刺激细胞Ca2+摄入是通过质膜钙通道进行的，而且这可能是氧 化型低密度脂蛋白导致内皮细胞损伤的机制之一。
氧化型低密度脂蛋白刺激钙通道开放的机制目前尚不清楚，膜脂质过氧化是刺激钙通道开放 的重要因素之 一。本研究用抗氧化剂维生素E处理，有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca2+摄入的 作用，提示氧化型低密度脂蛋白可能通过氧化应激反应促进细胞钙内流。Mabile等[1 ]研究表明，维生素E可显著抑制氧化型低密度脂蛋白引起的内皮细胞内游离Ca2+ 浓度的升高，同时减轻氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞的毒性作用，这与我们的实验结果 一致。
, 百拇医药
[作者简介] 徐雅琴，女，1968年12月出生，北京医科大学 第一医院心内科博士。
参考文献
[1] Mabile L, Fitoussi G, Periquet B, et al. α-Tocopherol and tro lox block the earl y intracellular events (TBARS and calcium rises)elicited by oxidized low density lipoproteins in cultured endothelial cells[J]. Free Radical B iolo gy &Medicine, 1995, 19 (2): 177-187
[2] 张林华， 刘秉文. 一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白[J] . 生物化学与生物物理学报， 1989， 21 (3)： 257-260
, 百拇医药
[3] Negre-Salvayre A, Fitoussi G, Reaud V, et al. A delayed and sustained rise of cy tosolic calcium is elicited by oxidized LDL in cultured bovine aortic endothelia l cells [J]. FEBS Lett , 1992, 299: 60-65
[4] Boissonneault GA, Wang Y, Chung BH, et al. Oxidized low densi ty lipoproteins delay endothelial wound healing:Lack of effect of vitamin E [ J]. Ann Nutr Metab， 1995, 39 (1):1-8
[5] Wrablewski F, LaDue GS. Lactate dehydrogenase activity in bl ood[J]. Proc Soc Exp Med， 1955， 90 : 210
[6] Zhao B, zhang Y, Lin B， et al. Endothelial cells injured by oxidi zed low density lipoproteins [J]. Am J Hematol, 1995 , 49 (3): 250-252
(此文1999-08-15收到， 2000-02-30修回), http://www.100md.com
单位：徐雅琴(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；唐朝枢(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；张钧华(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；曹静(北京医科大学第一医院心血管病研究所)；宁涛(北京医科大学临床肿瘤学研究所，北京 100034)；柯杨(北京医科大学临床肿瘤学研究所，北京 100034)
关键词：氧化型低密度脂蛋白；抗氧化剂；维生素E；钙；内皮 ，血管；信号转导
中国动脉硬化杂志000108[摘 要] 为探讨氧化型低密度脂蛋白和抗氧化剂对内皮细胞钙转运功能的影 响，揭示氧化型低密度脂蛋白毒 性作用的分子机制和预防措施，采用体外培养的人脐静脉内皮细胞，单独给予氧化型低密度 脂蛋白及同时给予氧化型低密度脂蛋白和抗氧化剂维生素E，分别测定细胞钙摄取和释放功 能，并测定细胞及上清液乳酸脱氢酶活性，计算细胞死亡率。结果发现，氧化型低密度脂 蛋 白呈剂量依赖性增加细胞死亡率，同时刺激内皮细胞钙摄取增加，对钙释放无影响，维生素 E可抑制氧化型低密度脂蛋白的上述作用。结果提示，氧化型低密度脂蛋白刺激内皮细胞钙 摄取可能是其致内皮细胞损伤的机制，维生素E通过抑制此作用而达到细胞保护的效应。
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[中图分类号] R329.2+5 [文献标识码] A
[文章编号] 1007-3949(2000)-01-0032-03
The Effect of Oxidized Low Density Lipoprotein and Antioxidant on Calcium Transp ortation of Human Vascular Endothelial Cells
XU Ya-Qin TANG Chao-Shu ZHANG Jun-Hua CAO Jing NING Tao KE Yang
(The Department of Cardiology, First Hospital， Beijing Medical University，B eijing 100034,China)
, http://www.100md.com
ABSTRACT Aim To examine the effects of oxidized low densi ty lipoprotein (ox- LDL) and antioxidant on calcium transportation of human vascular endothelial cel ls, then explore the molecular mechanism of cytotoxicity induced by ox-LDL. Meth ods Confluent primary cultures of human umbilical vein endotheli al cells (hUVEC) were exposed respectively to ox-LDL or ox-LDL and vitamin E in medium. The u pt ake and release of calcium by hUVEC were measured. The mortality of hUVEC we re assessed by the messurement of LDH. Results Ox-LD L enhanced the mortality of hUVEC and the uptake of calcium by hUVEC with a dose-dependence manner, wh ile vitamin E inhibited these effects. Conclusions Ox-LDL may stimulate th e uptake of calcium by hUVEC, leading to hUVEC injury. Vitamin E could protect hUVEC from such cytotoxic effect by inhibitting cellular uptake of calcium.
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MeSH Oxidized Low Density Lipoprotein； Antioxidants; Vitam inE; Calcium; Endothelium,Vascular; Signal Transduction
氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱发的内皮细胞损伤 是导致动脉粥样硬化、高血压等血管损伤性疾病的重要因素，但其详尽机制还不甚明了。有 研究显示，氧化型低密度脂蛋白可引起剂量依赖的细胞内游离钙浓度升高,同时造成内皮细 胞损伤，推测Ca2+信号转导通路的激活可能是氧化型低密度脂蛋白内皮损伤的机制， 但这种钙浓度升高是由于细胞摄取细胞外钙增加和/或细胞内钙释放引起尚不清楚 [1,3]。本工作通过检测氧化型低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞(human umbilical v ein endothelial cells ，hUVEC)钙摄取和释放功能的影响以及抗氧 化剂维生素E的干预保护作用，以期揭示氧化型低密度脂蛋白 毒性作用的分子机制和预防措施。
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1 材料和方法
1.1 材料
人脐静脉内皮细胞系由北京市肿瘤研究所提供，低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)购自北京协和医科大学基础 所，Nicardipin和维生素E购自Sigma公司，45Ca为Dupont NEN产品，RPMI1640购自G ibco公司。
1.2 人脐静脉内皮细胞系培养
人脐静脉内皮细胞系用含10%胎牛血清的1640培养基培养，细胞汇集成 单层达80%，0.01%胰酶37℃消化5 min，以1×105 cells接种于24孔板，贴壁24 h，换 无血清培养基培养24 h，然后分组加药。
1.3 氧化型低密度脂蛋白的制备
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参照张林华等[2]方法分离制备人血清低密度脂蛋白，采用考马斯亮兰 法做低密度脂蛋白蛋白定量，低密度脂蛋白在含5 μmol/L CuSO4的PBS中氧化20 h (37 ℃ )。低密度脂蛋白氧化修饰程度通过测定硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)值，氧化型低密度 脂蛋白产生的丙二醛是低密度脂蛋白的4.3倍。
1.4 实验分组
①对照组；②ox-LDL (25 mg/L)组； ③ox-LDL (50 mg/L)组；④ox-LDL(100 mg/L)组；⑤维生素E(50 mg/L)+ ox-LDL(50 mg/L)组；⑥Nicardipin(1 μmo l/L)+ ox-LDL (50 mg/L)组
1.5 细胞钙摄取功能测定
2×105内皮细胞无血清培养24 h，分组加药，37℃孵育8 h，冷PBS 洗3遍，KRB液(含葡萄糖11 mmol/L、HEPES 30 mmol/L、0.1%牛血清白蛋白、NaCl 136 mmo l/L、KCl 4.0 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L及MgCl2 1.0 mmol/L，pH 7.35)37℃预孵育 10 min，加45CaCl2 1 m Ci/L，37℃孵育5 min，冰浴下刮下细胞置于滤膜上，抽 干加闪烁液 ，液闪仪测定滤膜放射性计数。
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1.6 细胞钙释放功能测定
45 Ca负荷操作同上述，加45CaCl2 1 u，37℃孵育10 min后， 冷PBS洗5遍，无Ca的KRB液37℃预孵育2 min，取0.2 mL孵育液，加闪烁液，液闪仪测定放射 性计数。
1.7 乳酸脱氢酶活性测定
采用Wrablewski等[5]报道的方法分别测培养液和细胞内乳酸脱氢酶 活性，细胞死亡率=培养液乳酸脱氢酶活性÷(细胞内乳酸脱氢酶活性+培 养液乳酸脱氢酶活性)×100%。
1.8 统计学处理
数据以±s表示，采 用方差分析组间q检验进行统计学处理，P<0.05表示有统计学意义。
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2 结果
2.1 氧化型低密度脂蛋白及维生素E对内皮细胞钙摄取及释放的影响
氧化型低密度脂蛋白(25、50和100 mg/L)呈浓 度依赖性刺激内皮细胞钙摄取增加(69%、 131%和192%，P<0.01)，预先 加维生素E和钙通道 拮抗剂nicardipin处理则抑制了此效应。但不同浓度的氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞 钙释放无明显影响，预先加维生素E及钙通道拮抗剂后亦未产生明显影响(表1，Table 1) 。
2.2 氧化型低密度脂蛋白及维生素E对内皮细胞死亡率的影响
与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白(25、50、100 mg/L)呈浓度依赖性增加内皮细胞死亡 率(P<0.05)，预先加维生素E和钙通道阻断剂nicardipin后细胞死亡率 明显下降(P<0.01)，见表1(Table 1)。
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表1. 维生素E和不同浓度氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞钙
转运功能及内皮细胞死 亡率的影响
Table 1. The effects of vitamin E and different ox-LDL
concentration on t he calcium transportation and
the mortality of endothelial cells (μmol/106 cells，n=6) Groups
Ca2+ uptake
Ca2+ release
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Mortality
Control
520±158
78±23
7.03±0.21
Ox-LDL(25 mg/L)
880±183a
73±14
9.02±1.35b
Ox-LDL(50 mg/L)
1204±386a
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78±17
15.78±2.53b
Ox-LDL(100 mg/L)
1519±518a
107±45
19.22±3.68b
VitE+ox-LDL
620±247c
94±12
10.57±1.69c
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Nicardipin+ox-LDL
436±181
74±17
11.31±1.32
a: P<0.01, b: P<0.05，compared with control gro up； c:P<0.01, compared with ox-LDL (50 mg/L) group
3 讨论
近年来，关于氧化型低密度脂蛋白与细胞特异性受体结合激活细胞内第二信使途径进而产生 一系列生物学效应的信号转导通路的研究越来越受到关注。其中，氧化型低密度脂蛋白引起 细胞内游离钙 浓度升高被认 为是氧化型低密度脂蛋白造成内皮细胞损伤的机制之一。细胞浆Ca2+源于细胞外Ca2+内入和细胞内Ca2+库(如内质网)释放，细胞外Ca2+主要通过Ca2+ 通道进入细胞，而细胞内Ca2+ 主要通过质膜钙泵、 Na+/Ca2+交换释放出细胞外。此外，肌浆网上钙泵对钙的摄取也参与了细胞内Ca 2+浓度调节。
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本研究应用不同浓度的氧化型低密度脂蛋白刺激hUVEC，引起浓度依赖性内皮细胞死亡 率增加,这与其他学者研究结果一致[6]。同等浓度的氧化型低密度脂蛋白作用内 皮细胞时发现，氧化型低密度脂蛋白对细胞钙释放功 能无影响，而呈浓度依赖地促进细胞钙摄取增加，应用钙通道阻断剂可有效抑制此效应，表 明氧化型低密度脂蛋白刺激细胞Ca2+摄入是通过质膜钙通道进行的，而且这可能是氧 化型低密度脂蛋白导致内皮细胞损伤的机制之一。
氧化型低密度脂蛋白刺激钙通道开放的机制目前尚不清楚，膜脂质过氧化是刺激钙通道开放 的重要因素之 一。本研究用抗氧化剂维生素E处理，有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca2+摄入的 作用，提示氧化型低密度脂蛋白可能通过氧化应激反应促进细胞钙内流。Mabile等[1 ]研究表明，维生素E可显著抑制氧化型低密度脂蛋白引起的内皮细胞内游离Ca2+ 浓度的升高，同时减轻氧化型低密度脂蛋白对内皮细胞的毒性作用，这与我们的实验结果 一致。
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[作者简介] 徐雅琴，女，1968年12月出生，北京医科大学 第一医院心内科博士。
参考文献
[1] Mabile L, Fitoussi G, Periquet B, et al. α-Tocopherol and tro lox block the earl y intracellular events (TBARS and calcium rises)elicited by oxidized low density lipoproteins in cultured endothelial cells[J]. Free Radical B iolo gy &Medicine, 1995, 19 (2): 177-187
[2] 张林华， 刘秉文. 一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白[J] . 生物化学与生物物理学报， 1989， 21 (3)： 257-260
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[3] Negre-Salvayre A, Fitoussi G, Reaud V, et al. A delayed and sustained rise of cy tosolic calcium is elicited by oxidized LDL in cultured bovine aortic endothelia l cells [J]. FEBS Lett , 1992, 299: 60-65
[4] Boissonneault GA, Wang Y, Chung BH, et al. Oxidized low densi ty lipoproteins delay endothelial wound healing:Lack of effect of vitamin E [ J]. Ann Nutr Metab， 1995, 39 (1):1-8
[5] Wrablewski F, LaDue GS. Lactate dehydrogenase activity in bl ood[J]. Proc Soc Exp Med， 1955， 90 : 210
[6] Zhao B, zhang Y, Lin B， et al. Endothelial cells injured by oxidi zed low density lipoproteins [J]. Am J Hematol, 1995 , 49 (3): 250-252
(此文1999-08-15收到， 2000-02-30修回), http://www.100md.com