用气相色谱-质谱仪检出丙酸血症
作者：彭海 孙圣刚
单位：同济医科大学附属协和医院神经科， 武汉 430022
关键词：气相色谱-质谱仪；丙酸血症；诊断
同济医科大学学报000216 摘要：采用尿素酶法及气相色谱-质谱仪检测临床疑有代谢性疾病患儿的尿液。结果检出5例丙酸血症。表明本方法比传统方法能更准确、快速 地对丙酸血症作出化学诊断及鉴别诊断。
中图法分类号：R446.1， R714.55
Detection of Propionic Acidemia by Ga s Chromatography-Mass Spectrometry
Peng Hai， Sun Shenggang
, 百拇医药
Department of Neurology, Xiehe Hospital, Tongji Medica l University, Wuhan 430022
Abstract：Using urease method and gas chromatography-mass spect rometry (GC-MS), the urine of the patients clinically suspected with metablic d isease was monitored. Five cases were diagnosed having propionic acidemia, indic ating GC-MS was more accurate and quick than traditional method for diagnosis a nd differentiate diagnosis of propionic acidemia.
, 百拇医药
Key words：gas chromatography-mass spectrometry； propionic ac idemia； diagnosis
丙酸血症( Mckusick: 232000, 232050)是一种少见的遗传代谢性疾病。 遗传方式为常染 色体隐性遗传。大部分患者在新生儿期发病。 临床表现为哺乳困难、呕吐、肌张力减低、 抽搐、呼吸困难及意识障碍。生化代谢特征为严重代谢性酸中毒，高血氨症，高甘氨酸血症 及高甘氨酸尿症。尿中3-羟丙酸和甲基柠檬酸排泄增加。
自1969年Hsia等首次报道丙酸血症[1]，距今已30年，但全世界报道不到100例。 随着检查方法的改进，特别是GC/MS用于体液的检测，丙酸血症检出率逐渐增多。本文报道5 例经GC-MS检出的丙酸血症，大部分病例经酶学证实有丙酰辅酶A 羧化酶(PCC)缺乏。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料
5例患者，年龄1～10 d，男性3例，女性2例。2例临床症状出现在出生后1周内。2例在出生 后2周内。1例无临床症状，因其兄(病例2)患丙酸血症死亡，并且其母亲再妊娠时在羊 水中检查出甲基柠檬酸, 故在出生第1 d即采尿检查(详见下)。临床表现：哺乳困难和呕 吐4例，肌张力减低3例，意识障碍1例，呼吸困难3例。死亡1例。
典型病例之一：先证者(病例2)出生第10 d哺乳困难，抽搐，肌张力减低，意识障碍，血氨增高。GC/MS仪检测尿液作出丙酸血症的化学诊断。发病1个月时死亡。其母亲和父亲PC C活性较正常对照低50%，其母亲再妊娠时在 羊水中检查出甲基柠檬酸。先证者之弟(病例4)出生第1 d尿液检查就发现了与丙酸血症有 关的生物化学改变。
典型病例之二：病例5出生第7 d出现呕吐，哺乳困难，呼吸困难，抽搐，血氨增高。尿液检 测发现与丙酸血症有关的生物化学改变。PCC酶活性是正常对照的10%。经用肉毒碱及生物素 治疗，尿中生物化学指标恢复正常。4月后因为感冒尿中又出现生物化学异常。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1尿标本前处理： 取发作时尿0.1 ml加尿素酶1mg (Sigma Chemical Co.，USA) ，温浴除去尿素。然后加入0.9 ml乙醇，混合、离心除掉蛋白。取上清液蒸发，再经氮气 完全吹干。最后按10∶1比例加入0.1 ml N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetam ide (BSTFA; Wako Pure Chemical Co.，Tokyo, Japan) 和trimethylchlorosilane (TMC S; Pierce, Rockford, IL, USA)，在80 ℃、30 min条件下萃取后，取60 μl装瓶送GC/MS 仪检测[2]。
1.2.2 GC/MS仪检测条件： 岛津QP-5000 GC/MS仪，分析毛细管柱(30 m×0.25 mm ， J&W fused silica)，温度从 125 ℃开始，以 16 ℃/min 升温到325 ℃。采用淋巴细胞作 培养细胞，测定PCC酶活性[3]。
, 百拇医药
2 结果
患者尿经尿素酶法处理，GC/MS仪检出的异常代谢产物有： 3-羟丙酸，甲基柠檬酸。还发 现 2-甲基-3-酮戊酸，乳酸，高甘氨酸及血氨增高。详见表1。3例PCC酶活性测定均较 正常对照低。
表1 丙酸症患者实验室所见 指 标
异常人数
被检患者人数
3-羟丙酸
5
5
甲基柠檬酸
5
5
, 百拇医药
甘氨酸
4
5
乳酸
4
5
2-甲基-3-酮戊酸
1
5
尿酮阳性
4
5
甲基丙二酸
, 百拇医药 0
5
血氨增高*
5
5
*为血标本，未标者为尿标本
3 讨论
丙酸血症是因为PCC缺陷或生物素辅酶代谢障碍引起丙酰辅酶A 蓄积，从而产生许多异常代 谢产物并经尿排出。其发病率大约为1/5000[4]。
PCC是人类线粒体内3种依赖生物素的羧化酶之一。由苏氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、异亮氨 酸、胆固醇及长链脂肪酸降解而成的丙酸，经线粒体PCC分解成甲基丙二酰辅酶A，后者再进 一步降解为琥珀酰辅酶A进入三羧酸循环。
, 百拇医药
Lehnert 等报道丙酸血症大约33%有家族史，几乎1/2家族中至少有1人不明原因死亡。 本组仅1个家族中同胞患病，较Lehnert 等报道的低[5]，究其原因，或许是本组病 例少，也可能是东方人种与西方人种家族患病率存在差异，具体原因有待于进一步作多病例 的调查。
哺乳困难是患儿早发症状中最常见者，占80%[5]。常伴剧烈呕吐甚至有的被 误认为幽门梗阻而行手术[6]。本组80%患儿早期有哺乳困难，呕吐，提示如果发现 新生儿或婴儿出现不易解释的呕吐，要想到先天性代谢性疾病。
丙酸血症患儿常出现神经系统症状，如嗜睡，淡漠，抽搐或代谢性昏迷。这些症状可能是毒 性代谢产物蓄积，例如有机酸和氨引起中枢神经系统功能失调。但是这些表现并不是丙酸血 症独有的特征，要注意与其他先天性代谢性异常症以及其他系统疾病鉴别。值得注意的是患 儿最初出现的胃肠症状和逐渐加重的神经系统症状，在禁食含蛋白质食物和静注适量的葡萄 糖几天后，呈戏剧性改变，这有助于鉴别诊断。
, 百拇医药
脑电图及尸检发现丙酸血症患者脑组织有致死性氨中毒。有作者认为这是因为丙酸，丙酰辅 酶A及其代谢产物抑制尿素循环中氨甲酰磷酸合成酶的活性，从而引起血氨增高。本组全部 病例均有血氨增高。因血氨浓度与血丙酸水平相关，临床可利用血氨的变化来观察丙酸血症 急性危象的治疗效果。影像学上本病无特异改变，有报道慢性期CT扫描显示脑萎缩。1986年 Behbehani等首次报道丙酸血症患儿中枢神经系统髓鞘形成障碍或脱髓鞘。还有人并认为基 底节特别容易受累。本病活检可见脑萎缩，脑肿胀，脱髓鞘Alzhermer Ⅱ型细胞。
丙酸血症发作时尿中出现大量3-羟丙酸、甲基柠檬酸、甘氨酸。尿中乳酸也增高。血氨增 高及尿酮阳性。还可出现微量异常代谢产物如3-羟基-3-甲基-3-戊二酸，2-甲基-丁 酰甘氨酸，2-甲基-乙酰乙酸，2-甲基-3-羟丁酸，2-甲基-戊烯二酸，2-羟基-2- 甲基-丁二酸，3-甲基-己二酸和戊二酸。尿中3-羟丙酸和甲基柠檬酸在发作期和缓解期 均可检出，这是本病化学诊断最主要的指标。
, http://www.100md.com
丙酸血症和甲基丙二酸尿症患者的临床表现相似，并且尿中均可测出甲基柠檬酸。鉴别 诊断时必须注意，后者尿中还可检出甲基丙二酸。
检测这些代谢产物，长期采用的有机溶媒抽出法，对鉴别诊断重要的指标物质如甲基柠檬酸 等抽出率极低，且繁琐费时。采用本方法，分离及检出的强度高3～4倍而且仅90 min可同时 一次查出有关代谢产物，大大缩短了检测时间。因此用GC/MS仪对丙酸血症作化 学诊断具有敏感性和特异性，并且准确、快速。GC/MS仪特别适用于大规模人群中先天性代 谢性异常症的筛查，值得推广。
彭海, 女, 1954年生, 副教授
参考文献
1，Hsia Y E, Scully K J, Rosenberg L E. Defective propionate carboxylat ion in ketotic hyperglycinemia. Lancet, 1969, 1:757
, 百拇医药
2，Matsumoto I, Kuhara T. A new chemical diagnostic method for inborn e rrors of metabolism by massspectrometry. Mass spectrometry Revews, 1996, 15:43
3，Yosino M, Aramaki S, Yamashita F et al. Erythematous skin le sions and partial deficiency of 3-methylcrotonyl- CoA carboxylase in peripheral lymphosytes in a patient with propionic acidemia. J Inher Metab Dis, 1991, 14: 839
4，Lehnert W. Long-term results of selective screening for inborn er rors of metabolism. Eur J Pediatr, 1994,153:780
, 百拇医药
5，Lehnert W, Sperl W, Suormala T et al. Propionic acidemia: Clinical, biochemical and therapeutic aspects. Experience in 30 patients. Eur J Pediatr, 1994, 153 (suppl 1):568
6，Stork L C, Ambruso D R, wallner S F et al. Pancytopenia in propionic acidemia: hematologic evaluation and studies of hematopoesis in vitro. Pediatr Res, 1986, 20:783
(收稿；1999-09-14), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院神经科， 武汉 430022
关键词：气相色谱-质谱仪；丙酸血症；诊断
同济医科大学学报000216 摘要：采用尿素酶法及气相色谱-质谱仪检测临床疑有代谢性疾病患儿的尿液。结果检出5例丙酸血症。表明本方法比传统方法能更准确、快速 地对丙酸血症作出化学诊断及鉴别诊断。
中图法分类号：R446.1， R714.55
Detection of Propionic Acidemia by Ga s Chromatography-Mass Spectrometry
Peng Hai， Sun Shenggang
, 百拇医药
Department of Neurology, Xiehe Hospital, Tongji Medica l University, Wuhan 430022
Abstract：Using urease method and gas chromatography-mass spect rometry (GC-MS), the urine of the patients clinically suspected with metablic d isease was monitored. Five cases were diagnosed having propionic acidemia, indic ating GC-MS was more accurate and quick than traditional method for diagnosis a nd differentiate diagnosis of propionic acidemia.
, 百拇医药
Key words：gas chromatography-mass spectrometry； propionic ac idemia； diagnosis
丙酸血症( Mckusick: 232000, 232050)是一种少见的遗传代谢性疾病。 遗传方式为常染 色体隐性遗传。大部分患者在新生儿期发病。 临床表现为哺乳困难、呕吐、肌张力减低、 抽搐、呼吸困难及意识障碍。生化代谢特征为严重代谢性酸中毒，高血氨症，高甘氨酸血症 及高甘氨酸尿症。尿中3-羟丙酸和甲基柠檬酸排泄增加。
自1969年Hsia等首次报道丙酸血症[1]，距今已30年，但全世界报道不到100例。 随着检查方法的改进，特别是GC/MS用于体液的检测，丙酸血症检出率逐渐增多。本文报道5 例经GC-MS检出的丙酸血症，大部分病例经酶学证实有丙酰辅酶A 羧化酶(PCC)缺乏。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 临床资料
5例患者，年龄1～10 d，男性3例，女性2例。2例临床症状出现在出生后1周内。2例在出生 后2周内。1例无临床症状，因其兄(病例2)患丙酸血症死亡，并且其母亲再妊娠时在羊 水中检查出甲基柠檬酸, 故在出生第1 d即采尿检查(详见下)。临床表现：哺乳困难和呕 吐4例，肌张力减低3例，意识障碍1例，呼吸困难3例。死亡1例。
典型病例之一：先证者(病例2)出生第10 d哺乳困难，抽搐，肌张力减低，意识障碍，血氨增高。GC/MS仪检测尿液作出丙酸血症的化学诊断。发病1个月时死亡。其母亲和父亲PC C活性较正常对照低50%，其母亲再妊娠时在 羊水中检查出甲基柠檬酸。先证者之弟(病例4)出生第1 d尿液检查就发现了与丙酸血症有 关的生物化学改变。
典型病例之二：病例5出生第7 d出现呕吐，哺乳困难，呼吸困难，抽搐，血氨增高。尿液检 测发现与丙酸血症有关的生物化学改变。PCC酶活性是正常对照的10%。经用肉毒碱及生物素 治疗，尿中生物化学指标恢复正常。4月后因为感冒尿中又出现生物化学异常。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1尿标本前处理： 取发作时尿0.1 ml加尿素酶1mg (Sigma Chemical Co.，USA) ，温浴除去尿素。然后加入0.9 ml乙醇，混合、离心除掉蛋白。取上清液蒸发，再经氮气 完全吹干。最后按10∶1比例加入0.1 ml N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetam ide (BSTFA; Wako Pure Chemical Co.，Tokyo, Japan) 和trimethylchlorosilane (TMC S; Pierce, Rockford, IL, USA)，在80 ℃、30 min条件下萃取后，取60 μl装瓶送GC/MS 仪检测[2]。
1.2.2 GC/MS仪检测条件： 岛津QP-5000 GC/MS仪，分析毛细管柱(30 m×0.25 mm ， J&W fused silica)，温度从 125 ℃开始，以 16 ℃/min 升温到325 ℃。采用淋巴细胞作 培养细胞，测定PCC酶活性[3]。
, 百拇医药
2 结果
患者尿经尿素酶法处理，GC/MS仪检出的异常代谢产物有： 3-羟丙酸，甲基柠檬酸。还发 现 2-甲基-3-酮戊酸，乳酸，高甘氨酸及血氨增高。详见表1。3例PCC酶活性测定均较 正常对照低。
表1 丙酸症患者实验室所见 指 标
异常人数
被检患者人数
3-羟丙酸
5
5
甲基柠檬酸
5
5
, 百拇医药
甘氨酸
4
5
乳酸
4
5
2-甲基-3-酮戊酸
1
5
尿酮阳性
4
5
甲基丙二酸
, 百拇医药 0
5
血氨增高*
5
5
*为血标本，未标者为尿标本
3 讨论
丙酸血症是因为PCC缺陷或生物素辅酶代谢障碍引起丙酰辅酶A 蓄积，从而产生许多异常代 谢产物并经尿排出。其发病率大约为1/5000[4]。
PCC是人类线粒体内3种依赖生物素的羧化酶之一。由苏氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、异亮氨 酸、胆固醇及长链脂肪酸降解而成的丙酸，经线粒体PCC分解成甲基丙二酰辅酶A，后者再进 一步降解为琥珀酰辅酶A进入三羧酸循环。
, 百拇医药
Lehnert 等报道丙酸血症大约33%有家族史，几乎1/2家族中至少有1人不明原因死亡。 本组仅1个家族中同胞患病，较Lehnert 等报道的低[5]，究其原因，或许是本组病 例少，也可能是东方人种与西方人种家族患病率存在差异，具体原因有待于进一步作多病例 的调查。
哺乳困难是患儿早发症状中最常见者，占80%[5]。常伴剧烈呕吐甚至有的被 误认为幽门梗阻而行手术[6]。本组80%患儿早期有哺乳困难，呕吐，提示如果发现 新生儿或婴儿出现不易解释的呕吐，要想到先天性代谢性疾病。
丙酸血症患儿常出现神经系统症状，如嗜睡，淡漠，抽搐或代谢性昏迷。这些症状可能是毒 性代谢产物蓄积，例如有机酸和氨引起中枢神经系统功能失调。但是这些表现并不是丙酸血 症独有的特征，要注意与其他先天性代谢性异常症以及其他系统疾病鉴别。值得注意的是患 儿最初出现的胃肠症状和逐渐加重的神经系统症状，在禁食含蛋白质食物和静注适量的葡萄 糖几天后，呈戏剧性改变，这有助于鉴别诊断。
, 百拇医药
脑电图及尸检发现丙酸血症患者脑组织有致死性氨中毒。有作者认为这是因为丙酸，丙酰辅 酶A及其代谢产物抑制尿素循环中氨甲酰磷酸合成酶的活性，从而引起血氨增高。本组全部 病例均有血氨增高。因血氨浓度与血丙酸水平相关，临床可利用血氨的变化来观察丙酸血症 急性危象的治疗效果。影像学上本病无特异改变，有报道慢性期CT扫描显示脑萎缩。1986年 Behbehani等首次报道丙酸血症患儿中枢神经系统髓鞘形成障碍或脱髓鞘。还有人并认为基 底节特别容易受累。本病活检可见脑萎缩，脑肿胀，脱髓鞘Alzhermer Ⅱ型细胞。
丙酸血症发作时尿中出现大量3-羟丙酸、甲基柠檬酸、甘氨酸。尿中乳酸也增高。血氨增 高及尿酮阳性。还可出现微量异常代谢产物如3-羟基-3-甲基-3-戊二酸，2-甲基-丁 酰甘氨酸，2-甲基-乙酰乙酸，2-甲基-3-羟丁酸，2-甲基-戊烯二酸，2-羟基-2- 甲基-丁二酸，3-甲基-己二酸和戊二酸。尿中3-羟丙酸和甲基柠檬酸在发作期和缓解期 均可检出，这是本病化学诊断最主要的指标。
, http://www.100md.com
丙酸血症和甲基丙二酸尿症患者的临床表现相似，并且尿中均可测出甲基柠檬酸。鉴别 诊断时必须注意，后者尿中还可检出甲基丙二酸。
检测这些代谢产物，长期采用的有机溶媒抽出法，对鉴别诊断重要的指标物质如甲基柠檬酸 等抽出率极低，且繁琐费时。采用本方法，分离及检出的强度高3～4倍而且仅90 min可同时 一次查出有关代谢产物，大大缩短了检测时间。因此用GC/MS仪对丙酸血症作化 学诊断具有敏感性和特异性，并且准确、快速。GC/MS仪特别适用于大规模人群中先天性代 谢性异常症的筛查，值得推广。
彭海, 女, 1954年生, 副教授
参考文献
1，Hsia Y E, Scully K J, Rosenberg L E. Defective propionate carboxylat ion in ketotic hyperglycinemia. Lancet, 1969, 1:757
, 百拇医药
2，Matsumoto I, Kuhara T. A new chemical diagnostic method for inborn e rrors of metabolism by massspectrometry. Mass spectrometry Revews, 1996, 15:43
3，Yosino M, Aramaki S, Yamashita F et al. Erythematous skin le sions and partial deficiency of 3-methylcrotonyl- CoA carboxylase in peripheral lymphosytes in a patient with propionic acidemia. J Inher Metab Dis, 1991, 14: 839
4，Lehnert W. Long-term results of selective screening for inborn er rors of metabolism. Eur J Pediatr, 1994,153:780
, 百拇医药
5，Lehnert W, Sperl W, Suormala T et al. Propionic acidemia: Clinical, biochemical and therapeutic aspects. Experience in 30 patients. Eur J Pediatr, 1994, 153 (suppl 1):568
6，Stork L C, Ambruso D R, wallner S F et al. Pancytopenia in propionic acidemia: hematologic evaluation and studies of hematopoesis in vitro. Pediatr Res, 1986, 20:783
(收稿；1999-09-14), 百拇医药