一种获取氧化修饰型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的有效方法
作者：成晓龙
单位：成晓龙(山西医科大学研究生处 太原 030001)
关键词：培养基；巨噬细胞；脂蛋白类，LDL；氧化
山西医科大学学报000208
摘要：探讨了不同培养体系对血单核细胞源性巨噬细胞氧化修饰低密度脂蛋白能力的影响，旨在寻求一种获得Ox-LDL的有效方法。实验分为4组，分别为Ham F-10、DMEM、DMEM+3 μmol/L Fe2+、DMEM+1 μmol/L Cu2+。通过测定细胞存活率以及培养液上清中硫代巴比妥酸反应物(TBARS)，反映不同培养体系对巨噬细胞生长状态及氧化修饰LDL能力的影响。结果表明：Ham F-10培养液对血单核细胞产生毒性，与DMEM培养液相比，细胞存活率显著降低；DMEM培养液中细胞生长良好，存活率高，但单纯DMEM培养液以及添加Fe2+的培养体系TBARS值显著低于添加Cu2+的DMEM培养体系，提示添加Cu2+的DMEM培养体系有利于巨噬细胞发挥氧化修饰LDL的能力。实验结果提示：在研究巨噬细胞氧化修饰LDL的实验中，宜选用“DMEM+1 μmol/L Cu2+”的培养体系。
, 百拇医药
中图分类号：R362 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)02-0112-02
An effective method of oxidation of low density lipoprotein
Cheng Xiaolong
(Dept. of Postgraduate,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract: The effect of different media on oxidation of LDL by monocyte-derived macrophage system was investigated.The results showed that monocytes almost all turned into macrophages in DMEM medium whereas grew very badly and most of them died in Hams F-10 medium.Little or no modification of LDL took place when it was incubated with macrophages in DMEM,and adding 3 μmol/L Fe2+ did not increase the modification of LDL by macrophages. Macrophages modify LDL well when they incubate in DMEM medium containing 1 μmol/L Cu2+, suggesting that Cu2+ (1 μmol/L) modifies LDL effectively when it is added to DMEM but not to Ham's F-10.
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Key words: culture media; macrophages; lipoproteins,LDL; oxidation
单核细胞源性巨噬细胞在LDL的氧化修饰过程中起重要作用[1]，但体外实验中如何使单核细胞转化为M以及发挥M氧化修饰LDL的能力持有争议，培养体系选择不当往往导致实验失败[2～5]。本实验旨在探讨利于单核细胞转化为M以及充分发挥M氧化修饰LDL能力的最佳培养体系。
1 材料与方法
1.1 材料Ham F-10(含3 μmol/L Fe2+)培养液、DMEM培养液均购自GIBCO-BRL公司，含双抗、二性霉素、HEPES，抽滤消毒、分装，4 ℃备用；胎牛血清购自Sigma公司，56 ℃灭活1 h后分装，-20 ℃备用；淋巴细胞分离液国产，分装于棕色瓶，4 ℃备用；LDL购自上海生物制品研究所，浓度为3.44 g/L，用前在无EDTA的PBS(pH7.4)中4 ℃透析24 h，超滤除菌，4 ℃保存；NAPCO MODEL 5410型CO2培养箱；洁净工作台；L×3-64-01型离心机。
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1.2 血单核细胞源性巨噬细胞的分离、纯化、培养 常规消毒SD大鼠，2 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血(肝素钠抗凝)，以培养液适当稀释抗凝血，将之加于事先装有4 ml淋巴细胞分离液的试管中(1∶1)，注意勿使界面混匀，1 800 r/min离心15～20 min，吸取含单核细胞和淋巴细胞的白膜层，以PBS(pH7.4)洗2次，1 800 r/min离心5 min，调整细胞浓度为1×109/L，37 ℃、50 ml/L CO2、饱和温度贴壁纯化1 h，弃上清。分设两组，分别换以Ham F-10培养液、DMEM培养液继续培养约1周，使单核细胞转化为成熟的巨噬细胞。
1.3 巨噬细胞存活率的计算 以贴壁细胞数与接种细胞数之比表示细胞存活率。
1.4 LDL的氧化修饰体系 将DMEM培养液中巨噬细胞收集，调整细胞浓度为3×109/L，分为3组，单纯DMEM培养液、添加3 μmol/L Fe2+的DMEM培养液、添加1 μmol/L Cu2+的DMEM培养液，各组LDL终浓度均为0.2 g/L，37 ℃孵育24 h，反应结束时加入终浓度为10 g/L EDTA以终止氧化修饰。
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1.5 TBARS的测定 取500 μl上清液，加3.06 mol/L(500 g/L)三氯醋酸1 ml，再加6.7 g/L硫代巴比妥酸1 ml后混匀，置100℃水浴45 min，冷却到60℃后，3 000 r/min离心15 min，取上清液在532 nm处比色，测其OD值，以四乙氧基丙烷作标准，结果以每毫克LDL含MDA(μmol/g)表示。
1.6 统计分析 采用SPSS/PC+软件进行ONEWAY分析，显著性界值定为0.05。
2 结果
Ham F-10培养液中细胞生长状态差，细胞存活率为30.7%；DMEM培养液中细胞生长良好，存活率显著高于Ham F-10培养液组为86.9%，从TBARS指标来看，DMEM+1 μmol/L Cu2+组为48.92±2.2，显著高于DMEM(10.7±0.9)和DMEM+3 μmol/L Fe2+(8.91±1.8)两组。
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3 讨论
氧化修饰型LDL(Ox-LDL)对动脉粥样硬化的发生发展起至关重要的作用[1]，资料表明内皮细胞、平滑肌细胞、血单核细胞源性巨噬细胞，淋巴细胞均有氧化修饰LDL的能力[2～4]，但Montgomery研究未发现单核细胞源性Mφ可以氧化修饰LDL[5]。以往的许多体外实验中，研究Mφ氧化修饰LDL能力的实验也大多失败，造成这种差别的原因在于他们所用的培养Mφ使其发挥氧化修饰LDL能力的体系不同，因此本实验选用不同的培养体系旨在探讨发挥Mφ氧化修饰LDL能力的最佳培养体系。结果表明Ham F-10培养液对血单核细胞源性Mφ产生的毒性很大，约有70%细胞死亡，细胞存活率显著低于DMEM培养液，无法应用于氧化修饰LDL的实验研究中，而在DMEM培养液中细胞生长良好，建议在血单核细胞源性Mφ的培养中使用DMEM培养液，但单纯的DMEM培养液并不是LDL氧化修饰的最佳体系，从TBARS指标可以看出，DMEM以及添加3 μmol/L Fe2+的DMEM培养液中Mφ并未发挥明显的氧化修饰LDL的能力，只有添加1 μmol/L Cu2+的DMEM培养液中TBARS显著升高，提示Mφ已发挥明显的氧化修饰LDL的作用。这与Michael等[6]的研究结果相吻合，推测体外实验LDL的氧化修饰可能依赖于低浓度的Cu2+。
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总之，在研究LDL氧化修饰的体外实验中，应选用DMEM培养液以防止Ham F-10培养液对细胞所产生的毒性，同时应向DMEM培养液中添加低浓度Cu2+以利于Mφ发挥氧化修饰LDL的能力。
作者简介：成晓龙，男，1971年6月生，硕士，讲师
参考文献：
[1] Steinberg D,Steinbrecher UP.Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis[J].J Clin Invest，1991，88:1785～1792.
[2] Lesnik P,Dachet C,Petit L.Impact of a combination of a calcium antagonist and a beta-blocker on cell-and copper- mediated oxidation of LDL and on the accumulation and efflux of cholesterol in human macrophages and murine J774 cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(3):979～988.
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[3] Graham A,Wood JL,Stone D.Human(THP-1)macrophages oxidize LDL by a thiol-dependent mechanism[J].Free Radic Res,1996,25(2):181～192.
[4] Lamb DJ,Wilkins GM,Leake DS.The oxidative modification of low density lipoprotein by human lymphocytes[J].Atherosclerosis,1992,92:187～192.
[5] Monlton KS,Barnett J,Parthasarathy S.Regulated expression of the human acetylated low density lipoprotein receptor gene and isolation of promoter sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:8102～8106.
[6] Michael A,Rosenfeld M,Fong LG.Macrophage-mediated oxidation of extracellular low density lipoprotein requires an initial binding of the lipoprotein to its receptor[J].J Lipid Res,1994,35:385.
收稿日期：1999-09-28, http://www.100md.com
单位：成晓龙(山西医科大学研究生处 太原 030001)
关键词：培养基；巨噬细胞；脂蛋白类，LDL；氧化
山西医科大学学报000208
摘要：探讨了不同培养体系对血单核细胞源性巨噬细胞氧化修饰低密度脂蛋白能力的影响，旨在寻求一种获得Ox-LDL的有效方法。实验分为4组，分别为Ham F-10、DMEM、DMEM+3 μmol/L Fe2+、DMEM+1 μmol/L Cu2+。通过测定细胞存活率以及培养液上清中硫代巴比妥酸反应物(TBARS)，反映不同培养体系对巨噬细胞生长状态及氧化修饰LDL能力的影响。结果表明：Ham F-10培养液对血单核细胞产生毒性，与DMEM培养液相比，细胞存活率显著降低；DMEM培养液中细胞生长良好，存活率高，但单纯DMEM培养液以及添加Fe2+的培养体系TBARS值显著低于添加Cu2+的DMEM培养体系，提示添加Cu2+的DMEM培养体系有利于巨噬细胞发挥氧化修饰LDL的能力。实验结果提示：在研究巨噬细胞氧化修饰LDL的实验中，宜选用“DMEM+1 μmol/L Cu2+”的培养体系。
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中图分类号：R362 文献标识码：A
文章编号：1007-6611(2000)02-0112-02
An effective method of oxidation of low density lipoprotein
Cheng Xiaolong
(Dept. of Postgraduate,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract: The effect of different media on oxidation of LDL by monocyte-derived macrophage system was investigated.The results showed that monocytes almost all turned into macrophages in DMEM medium whereas grew very badly and most of them died in Hams F-10 medium.Little or no modification of LDL took place when it was incubated with macrophages in DMEM,and adding 3 μmol/L Fe2+ did not increase the modification of LDL by macrophages. Macrophages modify LDL well when they incubate in DMEM medium containing 1 μmol/L Cu2+, suggesting that Cu2+ (1 μmol/L) modifies LDL effectively when it is added to DMEM but not to Ham's F-10.
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Key words: culture media; macrophages; lipoproteins,LDL; oxidation
单核细胞源性巨噬细胞在LDL的氧化修饰过程中起重要作用[1]，但体外实验中如何使单核细胞转化为M以及发挥M氧化修饰LDL的能力持有争议，培养体系选择不当往往导致实验失败[2～5]。本实验旨在探讨利于单核细胞转化为M以及充分发挥M氧化修饰LDL能力的最佳培养体系。
1 材料与方法
1.1 材料Ham F-10(含3 μmol/L Fe2+)培养液、DMEM培养液均购自GIBCO-BRL公司，含双抗、二性霉素、HEPES，抽滤消毒、分装，4 ℃备用；胎牛血清购自Sigma公司，56 ℃灭活1 h后分装，-20 ℃备用；淋巴细胞分离液国产，分装于棕色瓶，4 ℃备用；LDL购自上海生物制品研究所，浓度为3.44 g/L，用前在无EDTA的PBS(pH7.4)中4 ℃透析24 h，超滤除菌，4 ℃保存；NAPCO MODEL 5410型CO2培养箱；洁净工作台；L×3-64-01型离心机。
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1.2 血单核细胞源性巨噬细胞的分离、纯化、培养 常规消毒SD大鼠，2 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉采血(肝素钠抗凝)，以培养液适当稀释抗凝血，将之加于事先装有4 ml淋巴细胞分离液的试管中(1∶1)，注意勿使界面混匀，1 800 r/min离心15～20 min，吸取含单核细胞和淋巴细胞的白膜层，以PBS(pH7.4)洗2次，1 800 r/min离心5 min，调整细胞浓度为1×109/L，37 ℃、50 ml/L CO2、饱和温度贴壁纯化1 h，弃上清。分设两组，分别换以Ham F-10培养液、DMEM培养液继续培养约1周，使单核细胞转化为成熟的巨噬细胞。
1.3 巨噬细胞存活率的计算 以贴壁细胞数与接种细胞数之比表示细胞存活率。
1.4 LDL的氧化修饰体系 将DMEM培养液中巨噬细胞收集，调整细胞浓度为3×109/L，分为3组，单纯DMEM培养液、添加3 μmol/L Fe2+的DMEM培养液、添加1 μmol/L Cu2+的DMEM培养液，各组LDL终浓度均为0.2 g/L，37 ℃孵育24 h，反应结束时加入终浓度为10 g/L EDTA以终止氧化修饰。
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1.5 TBARS的测定 取500 μl上清液，加3.06 mol/L(500 g/L)三氯醋酸1 ml，再加6.7 g/L硫代巴比妥酸1 ml后混匀，置100℃水浴45 min，冷却到60℃后，3 000 r/min离心15 min，取上清液在532 nm处比色，测其OD值，以四乙氧基丙烷作标准，结果以每毫克LDL含MDA(μmol/g)表示。
1.6 统计分析 采用SPSS/PC+软件进行ONEWAY分析，显著性界值定为0.05。
2 结果
Ham F-10培养液中细胞生长状态差，细胞存活率为30.7%；DMEM培养液中细胞生长良好，存活率显著高于Ham F-10培养液组为86.9%，从TBARS指标来看，DMEM+1 μmol/L Cu2+组为48.92±2.2，显著高于DMEM(10.7±0.9)和DMEM+3 μmol/L Fe2+(8.91±1.8)两组。
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3 讨论
氧化修饰型LDL(Ox-LDL)对动脉粥样硬化的发生发展起至关重要的作用[1]，资料表明内皮细胞、平滑肌细胞、血单核细胞源性巨噬细胞，淋巴细胞均有氧化修饰LDL的能力[2～4]，但Montgomery研究未发现单核细胞源性Mφ可以氧化修饰LDL[5]。以往的许多体外实验中，研究Mφ氧化修饰LDL能力的实验也大多失败，造成这种差别的原因在于他们所用的培养Mφ使其发挥氧化修饰LDL能力的体系不同，因此本实验选用不同的培养体系旨在探讨发挥Mφ氧化修饰LDL能力的最佳培养体系。结果表明Ham F-10培养液对血单核细胞源性Mφ产生的毒性很大，约有70%细胞死亡，细胞存活率显著低于DMEM培养液，无法应用于氧化修饰LDL的实验研究中，而在DMEM培养液中细胞生长良好，建议在血单核细胞源性Mφ的培养中使用DMEM培养液，但单纯的DMEM培养液并不是LDL氧化修饰的最佳体系，从TBARS指标可以看出，DMEM以及添加3 μmol/L Fe2+的DMEM培养液中Mφ并未发挥明显的氧化修饰LDL的能力，只有添加1 μmol/L Cu2+的DMEM培养液中TBARS显著升高，提示Mφ已发挥明显的氧化修饰LDL的作用。这与Michael等[6]的研究结果相吻合，推测体外实验LDL的氧化修饰可能依赖于低浓度的Cu2+。
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总之，在研究LDL氧化修饰的体外实验中，应选用DMEM培养液以防止Ham F-10培养液对细胞所产生的毒性，同时应向DMEM培养液中添加低浓度Cu2+以利于Mφ发挥氧化修饰LDL的能力。
作者简介：成晓龙，男，1971年6月生，硕士，讲师
参考文献：
[1] Steinberg D,Steinbrecher UP.Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis[J].J Clin Invest，1991，88:1785～1792.
[2] Lesnik P,Dachet C,Petit L.Impact of a combination of a calcium antagonist and a beta-blocker on cell-and copper- mediated oxidation of LDL and on the accumulation and efflux of cholesterol in human macrophages and murine J774 cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(3):979～988.
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[3] Graham A,Wood JL,Stone D.Human(THP-1)macrophages oxidize LDL by a thiol-dependent mechanism[J].Free Radic Res,1996,25(2):181～192.
[4] Lamb DJ,Wilkins GM,Leake DS.The oxidative modification of low density lipoprotein by human lymphocytes[J].Atherosclerosis,1992,92:187～192.
[5] Monlton KS,Barnett J,Parthasarathy S.Regulated expression of the human acetylated low density lipoprotein receptor gene and isolation of promoter sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:8102～8106.
[6] Michael A,Rosenfeld M,Fong LG.Macrophage-mediated oxidation of extracellular low density lipoprotein requires an initial binding of the lipoprotein to its receptor[J].J Lipid Res,1994,35:385.
收稿日期：1999-09-28, http://www.100md.com