催化褪黑素生物转化的细胞色素氧化酶P450异构酶的确定及其动力学研究
作者：王西明 C Hiemke S Haertter
单位：王西明(同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030)；C Hiemke S Haertter(美因兹大学医学院精神病院神经化学实验室，德国Mainz 55101)
关键词：褪黑素；细胞色素氧化酶P450异构酶；酶动力学
同济医科大学学报000204 摘要：采用人肝微粒体温育实验,根据CYP450 1A2特异 性抑制法及HPLC机电化学分析仪检测结果，发现：① 催化MT在肝脏羟化和去甲基反应的CYP 450异构酶确证是CYP450 1A2。② CYP450 1A2催化MT 6位羟化反应的Km是(4.48±1.49) μmol/L(
±s)，Vmax是(13.83±2.52) pmol/(mg protein.min)(±s)。③催化MT 5位上O-去甲基主要是CYP450 1A2,还有2C19参与，其Km值分别为0.030 μmol/L和8.796 μmol/L，Vmax分别是0.338 pmol/( mg protein.min)和3.167 pmol/(mg protein.min)。
, 百拇医药
中图法分类号：Q544.6， Q558
Determination and Kinetics of CYP450 Iso enzyme Catalyzing Melatonin Biotransformation
Wang Ximing
(Department of Biochemistry, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medica l University, Wuhan 430003)
C Hiemke S Haertter
(Psyschatrische clinic of University of Mainz Germany Mainz 55101)
, 百拇医药
Abstract：On the basis of in vitro experiment of human-liver microsome incubat ion with melatonin (MT), two main degrade metabolites of melatonin (MT), 6-hy droxymelatonin (6-HMT) and N-acetylserotonin (N-A5HT) were analyzed by using high performance liquid chromatography (HPLC) combined with electrochemical dete ction (ED). It was found: (1) The CYP450 isoenzyme catalyzing MT biotransformati on in liver was approved to be CYP450 1A2. (2) The Km of CYP P50 1A2 responsible for the catalyzation of 6-hydroxylation of MT was 4.48±1.49 μmol/L, Vmax was 13.83±2.52 pmol/(mg protein.min). (3) Both CYP450 1A2 and 2C19, mainly CYP450 1A2, catalyzed the 5-O-desmethyl of MT with the Km being 0.030 μmol/L and 8.7 96 μmol/L, and Vmax being 0.338 pmol/(mg.min) and 3.167 pmol/(mg.min), respecti vely.
, 百拇医药
Key words：melatonin; CYP450 isoenzyme; enzyme kinetics
褪黑素(Melatonin，MT)是由松果体合成分泌的神经内分泌激素，化学名称为N-乙酰-5 甲氧色胺(N-acetyl-5-metho-xytryptamine)。其合成分泌有夜间高、白天低的昼夜 节律性变化，在生理和病理过程中起有重要作用，故有“生物钟”之称[1]。如果 夜间合成分泌减少，则可促进脑的老化[2]。所以，近40年来许多学者对其进行了 多方面的研究，如抗衰老、抗肿癌、预防老年性痴呆等，并取得了许多成果。
在正常生理情况下，MT是在肝内被细胞色素氧化酶P450(CYP450)催化在6位上羟化或5位上O -去甲基反应，分别生成6羟褪黑素(6-OH-Melatonin，6-HMT)和N-乙酰-5羟色胺(N -acetyl-serotonine或N-acetyl-5-OH-tryptamine，N-A5HT)，然后再结合硫酸或 葡萄糖酸由肾脏随尿排出[3]。催化这一生物转化的关键酶是CYP450家族。
, 百拇医药
现知CYP450有许多异构酶，而且大多是由不同的基因表达。在MT的生物转化过程中，究 竟是由哪一种CYP450异构酶特异性催化的问题，至今尚未明确[2]。
因此，本文设计以人肝微粒体进行体外温育实验，采用CYP450异构酶的特异性抑制法和 HPLC-电化学分析仪检测法，研究催化MT生物转化的CYP450异构型及其酶促动力学。
1 材料与方法
1.1 材料
褪黑素，6羟褪黑素，N-乙酰5羟色胺购自sigma公司(美国)，Faraphylline购自Novartis Basel；EDTA购自Sigma公司；NADPH购自GmbH(德国)；“pool”含CYP450 6人肝混合微 粒体(0.302 nmol/mg protein)购自德国血库行；CYP450 2C19和3A4血浆购自德国血库 行。人的肝脏由美因兹大学医学院药理与毒理教研室提供。
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1.2 仪器
高效液相色谱仪(HPLC)为组装：泵是Bischoff的，柱子是Hypersil ODS 3 μm，125×3 mm(德国美因兹)；移动相流速0.6 ml/min，层析积分器是Hitachi型号D-2000(日本 )；自动进样器是Gilson Abimed型号231(德国)；电化学分析仪是esa coulochem，鉴 别器型号5100A(日本)，检波器电压为+0.4 V。
1.3 人肝微粒体的制备
按Haertter.S(1995)Psychopharmacology117：149-153方法制备[4]，制备的 微粒体悬液蛋白质含量测定按Bradford M M(1976)Anal Biochem 72：248-254方法 测定[5]，实验所用人肝微粒体蛋白质的含量为14 mg/ml，-80℃冰箱中保存备用 。
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1.4 实验方法
MT及其代谢产物的测定是根据Raynaul等(1993)[6]的方法进行部分改动，用HPLC 分离和电化学分析仪进行测定。MT加入5 mmol/L的NADP pH≈7.4的磷酸缓冲液后，在37 ℃水浴中预温热2 min，即加入人肝微粒体悬液(蛋白质含量为0.5 mg/每个样品)，温育 30 min。加上100%的乙酸乙酯终止反应。混合摇匀后，以1300 r/min 离心5 min，样品分 成二 相，立即放入干冰浴中冷却，约5 min，待下层凝固后，取上层有机相到玻璃管中，在室温 (约22℃)离心(负压下)抽干，再用分析用磷酸缓冲液溶解提取物，用HPLC进行分离和电 化学分析仪测定。以标准曲线进行计算转化产物含量测定。
1.5 HPLC-电化学分析检测法
提取物0.2 ml加到测定小杯中，和标准一起，由自动加样按给予程序每个样品注入100 μl 给已调试好条件的HPLC和电化学检测仪，记录仪自动打印出MT及其转化分解产物的峰面积， 以峰面积和标准进行计算。标准同1.4处理，但不加肝微粒体和温育30 min。按上述实验条件MT和其主要分解转化产物6HMT和N-A5HT分离测定稳定：6HMT出现在2～3 mi n(RT2～3 min)，N-A-5HT出现4～6 min(RT4～6 min)，MT出现在25～28 min(RT25～ 28 min)，其分离信号敏感性符合测定的生理要求，N-A-5HT信号敏感高于6HMT，其测定 范围在0.1～30 ng/ml，6HMT的测定范围2～100 ng/ml，且回收率大于80%，其标准曲线 的误差变化系数在20%左右，可以以标准曲线进行计算。
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2 结果
2.1 确定催化MT转化分解的酶是CYP4501A2
按上述实验方法及测定方法，我们用MT和制备的人肝微粒体加上NADPH在37℃水浴中温育， 得到了MT的转化分解产物6HMT和N-A-5HT(图1b)和标准一致。为进一步证实其可靠性， 我们又用“pool”(含CYP450的血浆)代替制备的人肝微粒体进行实验。获得同样结果，证 实MT的分解转化是由CYP450催化。furaphylline(呋拉茶碱)是CYP4501A2的特异抑制剂 [7]。我们在上述温育实验中加入20 μmol/L的furaphylline ，无论底物MT是1 μmol/ L还是10 μmol/L，都无6HMT产生，仅产生极微量N-A-5HT(图1)。这说明furaphyllin e抑制MT的生 物转化，也是通过抑制了肝CYP4501A2活性实现的；反过来证明了催化MT在6位上的羟化和 5位上的O-去甲基作用均是由CYP4501A2催化的。
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图1 Furaphylline对MT生物转化的抑制(抑制6HMT和N-A5HT的生成)
2.2 MT生物转化酶(CYP4501A2和2C19)的动力学
以不同浓度MT(0.5～10 μmol/L)，以上述同样的温育实验，测定人肝微粒体CYP4501A2 酶促反应速度(V)，然后进行酶促动力学分析：①将催化生成6HMT的反应速度进行Eadie- Hofstee法作图(图2a)，呈单斜直线图形，说明在催化MT6位羟化反应中，只有CYP4501A2 一种酶参与。并计算得出催化MT羟化反应的Km和Vmax分别为(4.48±1.49) μmol /L(±s)和(13.83±2.52) pmol/(mg.min) (±s)(n ＝6)。②将催化生成N-A-5HT的反应速度同样进行Eadie-Hofstee法作图(图2b)，却 呈曲线图形。说明在催化MT的5位上O-去甲基反应不是仅一种CYP450异构酶参与。又进一步 采用免疫特异性的CYP450 2C19和3A4二种异构酶血浆进行实验。结果表明这二种异构酶均不 参与MT的羟化反应，更进一步确证CYP4501A2是催化MT羟化反应的唯一参与者。但在MT的O- 去甲基反应中CYP4502C19约有10%～20%的催化反应，而CYP4503A4仅在高浓度10 μmol/L( MT)时，才有约2%的催化作用。根据文献[8，9]作图解析计算，在催化MT去甲基 反应中，CYP4501A2和CYP4502C19的Km分别为0.03 μmol/L和8.80 μmol/L；Vmax 分别为0.34 pmol/(mg.min)和3.17 pmol/(mg.min)，亦说明CYP4502C19对MT的O- 去甲基催化作用是较弱的。 
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图2 Eadie Hofstee法作图：底物v/s对v作图
3 讨论
关于MT的合成，已早被阐明是5-羟色胺(5-HT)在松果体内连续被N-乙酰基转移酶(N- AT)和羟基-O-甲基转移酶(H-O-MT)催化合成[10]。但MT的生物转化(降解 )是在肝脏，主要有两种方式。如前所述形成6HMT和N-A-5HT，分别占总产物70 %～80 % 和10 %～15 %，其余尚有1%以MT从尿中排出，还有少量可能会脱乙酰基和脱氨后形成5甲氧 基吲哚乙酸(5MTAA)占2%～4%[10]。这些芳香类代谢物均大部分与硫酸结合或 小部分与葡萄糖醛酸结合经肾随尿排出。本文通过体外MT和人肝微粒体温育实验，测得MT代谢物6HMT和N-A-5HT的比例和文献报导 一致。
本文是以人肝提取的微粒体进行温育实验，微粒体所含有的细胞色素氧化酶丰富，种类很多 ，参与许多物质的生物转化和激素的降解与灭活，本实验证实了褪黑素(MT)的降解主要是 由CYP4501A2所催化的6位的羟化O-去甲基作用，其次还有CYP4502C19和3A4参与O-去甲基 作用，对催化MT生物转化的细胞色素氧化酶异构酶种类进行了确定。但是我们知道还有其他 激素的降解也是通过CYP4501A2催化的，例如，雌激素[11]和某些药物[12] 。所以在临床上使用褪黑素进行药物治疗时，是否会影响其他激素的降解，以及使用某些 抑制CYP4501A2的药物时，会否影响褪黑素或其他激素的生物转化等问题。这是今后需要考 虑和研究的课题，特别是对于肝脏功能受损的患者。
, 百拇医药
王西明，女，1944年生，教授
参考文献
1，Pang S F, Tsang C W, Hong G X et al. Fluctuation of blood melato n in concentrations with age:result of changes in pineal melatonin secretion, body growth, and aging. J Pineal Res, 1990, 8: 179
2，Reppert S M, Weaver D R. Melatonin madness. Cell, 1995, 83: 1059
3，Young I M, Leone R M, Francis et al. Melatonin is metabolized to N-acetyl-serotonin and 6-hydroxymelatonin in man. J Clin Endocrinol Metab, 1985, 60: 114
, http://www.100md.com
4，Hǎrtter S, Arand M, Oesch F et al. Non-competitive inhibit ion of clomipramine N-demethylation by fluvoxamine. Psychophar Macology, 1995, 117:149.
5，Bredford M M. Rapid and sensitive method of the quantification of m icrogram quantities of protein utilising the principal of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976,72:248.
6，Raynaud F, Mauviard F, Geoffriau M et al. Plasma 6-hydroxymelat on in, 6-sulfatoxymelatonin and melatonin kinetics after melatonin administration to rats. Biol Signals, 1993, 2: 259
, 百拇医药
7，Sesardic D, Boobis A R, Murray B P et al. Furaphylline is a pote nt selective inhibitor of cytochrome p4501A2 in man. Br J Clin Phormacol, 1990, 29:6 51
8，Rosenthal H E. A graphic method for the deternimation and presentati on of binding parameters in a complex system. Anal Biochem, 1967, 20: 525
9，Norby J G, Ottolenghi P, Jensen J. Scatchard plot:common misti nterpretation of binding experiments. Anal Biochem, 1980, 102: 318
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10，Brzezinski A. Melatonin in humans. N Engl J Med, 1997, 336: 186
11，Shou M, Korzekwa K R, Brooks E N et al. Role of human hepatic cytochrome P4501A2 and 3A4 in the metabolic activation of estrone. Carci nogenesis, 1997, 18: 207
12，Brosen K.Drug-metabolizing enzymes and therapeutic drug monitoring in psychiatry. Drug Monit, 1996, 18:393.
(收稿：1999-11-01), 百拇医药
单位：王西明(同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉 430030)；C Hiemke S Haertter(美因兹大学医学院精神病院神经化学实验室，德国Mainz 55101)
关键词：褪黑素；细胞色素氧化酶P450异构酶；酶动力学
同济医科大学学报000204 摘要：采用人肝微粒体温育实验,根据CYP450 1A2特异 性抑制法及HPLC机电化学分析仪检测结果，发现：① 催化MT在肝脏羟化和去甲基反应的CYP 450异构酶确证是CYP450 1A2。② CYP450 1A2催化MT 6位羟化反应的Km是(4.48±1.49) μmol/L(
±s)，Vmax是(13.83±2.52) pmol/(mg protein.min)(±s)。③催化MT 5位上O-去甲基主要是CYP450 1A2,还有2C19参与，其Km值分别为0.030 μmol/L和8.796 μmol/L，Vmax分别是0.338 pmol/( mg protein.min)和3.167 pmol/(mg protein.min)。, 百拇医药
中图法分类号：Q544.6， Q558
Determination and Kinetics of CYP450 Iso enzyme Catalyzing Melatonin Biotransformation
Wang Ximing
(Department of Biochemistry, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medica l University, Wuhan 430003)
C Hiemke S Haertter
(Psyschatrische clinic of University of Mainz Germany Mainz 55101)
, 百拇医药
Abstract：On the basis of in vitro experiment of human-liver microsome incubat ion with melatonin (MT), two main degrade metabolites of melatonin (MT), 6-hy droxymelatonin (6-HMT) and N-acetylserotonin (N-A5HT) were analyzed by using high performance liquid chromatography (HPLC) combined with electrochemical dete ction (ED). It was found: (1) The CYP450 isoenzyme catalyzing MT biotransformati on in liver was approved to be CYP450 1A2. (2) The Km of CYP P50 1A2 responsible for the catalyzation of 6-hydroxylation of MT was 4.48±1.49 μmol/L, Vmax was 13.83±2.52 pmol/(mg protein.min). (3) Both CYP450 1A2 and 2C19, mainly CYP450 1A2, catalyzed the 5-O-desmethyl of MT with the Km being 0.030 μmol/L and 8.7 96 μmol/L, and Vmax being 0.338 pmol/(mg.min) and 3.167 pmol/(mg.min), respecti vely.
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Key words：melatonin; CYP450 isoenzyme; enzyme kinetics
褪黑素(Melatonin，MT)是由松果体合成分泌的神经内分泌激素，化学名称为N-乙酰-5 甲氧色胺(N-acetyl-5-metho-xytryptamine)。其合成分泌有夜间高、白天低的昼夜 节律性变化，在生理和病理过程中起有重要作用，故有“生物钟”之称[1]。如果 夜间合成分泌减少，则可促进脑的老化[2]。所以，近40年来许多学者对其进行了 多方面的研究，如抗衰老、抗肿癌、预防老年性痴呆等，并取得了许多成果。
在正常生理情况下，MT是在肝内被细胞色素氧化酶P450(CYP450)催化在6位上羟化或5位上O -去甲基反应，分别生成6羟褪黑素(6-OH-Melatonin，6-HMT)和N-乙酰-5羟色胺(N -acetyl-serotonine或N-acetyl-5-OH-tryptamine，N-A5HT)，然后再结合硫酸或 葡萄糖酸由肾脏随尿排出[3]。催化这一生物转化的关键酶是CYP450家族。
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现知CYP450有许多异构酶，而且大多是由不同的基因表达。在MT的生物转化过程中，究 竟是由哪一种CYP450异构酶特异性催化的问题，至今尚未明确[2]。
因此，本文设计以人肝微粒体进行体外温育实验，采用CYP450异构酶的特异性抑制法和 HPLC-电化学分析仪检测法，研究催化MT生物转化的CYP450异构型及其酶促动力学。
1 材料与方法
1.1 材料
褪黑素，6羟褪黑素，N-乙酰5羟色胺购自sigma公司(美国)，Faraphylline购自Novartis Basel；EDTA购自Sigma公司；NADPH购自GmbH(德国)；“pool”含CYP450 6人肝混合微 粒体(0.302 nmol/mg protein)购自德国血库行；CYP450 2C19和3A4血浆购自德国血库 行。人的肝脏由美因兹大学医学院药理与毒理教研室提供。
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1.2 仪器
高效液相色谱仪(HPLC)为组装：泵是Bischoff的，柱子是Hypersil ODS 3 μm，125×3 mm(德国美因兹)；移动相流速0.6 ml/min，层析积分器是Hitachi型号D-2000(日本 )；自动进样器是Gilson Abimed型号231(德国)；电化学分析仪是esa coulochem，鉴 别器型号5100A(日本)，检波器电压为+0.4 V。
1.3 人肝微粒体的制备
按Haertter.S(1995)Psychopharmacology117：149-153方法制备[4]，制备的 微粒体悬液蛋白质含量测定按Bradford M M(1976)Anal Biochem 72：248-254方法 测定[5]，实验所用人肝微粒体蛋白质的含量为14 mg/ml，-80℃冰箱中保存备用 。
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1.4 实验方法
MT及其代谢产物的测定是根据Raynaul等(1993)[6]的方法进行部分改动，用HPLC 分离和电化学分析仪进行测定。MT加入5 mmol/L的NADP pH≈7.4的磷酸缓冲液后，在37 ℃水浴中预温热2 min，即加入人肝微粒体悬液(蛋白质含量为0.5 mg/每个样品)，温育 30 min。加上100%的乙酸乙酯终止反应。混合摇匀后，以1300 r/min 离心5 min，样品分 成二 相，立即放入干冰浴中冷却，约5 min，待下层凝固后，取上层有机相到玻璃管中，在室温 (约22℃)离心(负压下)抽干，再用分析用磷酸缓冲液溶解提取物，用HPLC进行分离和电 化学分析仪测定。以标准曲线进行计算转化产物含量测定。
1.5 HPLC-电化学分析检测法
提取物0.2 ml加到测定小杯中，和标准一起，由自动加样按给予程序每个样品注入100 μl 给已调试好条件的HPLC和电化学检测仪，记录仪自动打印出MT及其转化分解产物的峰面积， 以峰面积和标准进行计算。标准同1.4处理，但不加肝微粒体和温育30 min。按上述实验条件MT和其主要分解转化产物6HMT和N-A5HT分离测定稳定：6HMT出现在2～3 mi n(RT2～3 min)，N-A-5HT出现4～6 min(RT4～6 min)，MT出现在25～28 min(RT25～ 28 min)，其分离信号敏感性符合测定的生理要求，N-A-5HT信号敏感高于6HMT，其测定 范围在0.1～30 ng/ml，6HMT的测定范围2～100 ng/ml，且回收率大于80%，其标准曲线 的误差变化系数在20%左右，可以以标准曲线进行计算。
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2 结果
2.1 确定催化MT转化分解的酶是CYP4501A2
按上述实验方法及测定方法，我们用MT和制备的人肝微粒体加上NADPH在37℃水浴中温育， 得到了MT的转化分解产物6HMT和N-A-5HT(图1b)和标准一致。为进一步证实其可靠性， 我们又用“pool”(含CYP450的血浆)代替制备的人肝微粒体进行实验。获得同样结果，证 实MT的分解转化是由CYP450催化。furaphylline(呋拉茶碱)是CYP4501A2的特异抑制剂 [7]。我们在上述温育实验中加入20 μmol/L的furaphylline ，无论底物MT是1 μmol/ L还是10 μmol/L，都无6HMT产生，仅产生极微量N-A-5HT(图1)。这说明furaphyllin e抑制MT的生 物转化，也是通过抑制了肝CYP4501A2活性实现的；反过来证明了催化MT在6位上的羟化和 5位上的O-去甲基作用均是由CYP4501A2催化的。
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图1 Furaphylline对MT生物转化的抑制(抑制6HMT和N-A5HT的生成)
2.2 MT生物转化酶(CYP4501A2和2C19)的动力学
以不同浓度MT(0.5～10 μmol/L)，以上述同样的温育实验，测定人肝微粒体CYP4501A2 酶促反应速度(V)，然后进行酶促动力学分析：①将催化生成6HMT的反应速度进行Eadie- Hofstee法作图(图2a)，呈单斜直线图形，说明在催化MT6位羟化反应中，只有CYP4501A2 一种酶参与。并计算得出催化MT羟化反应的Km和Vmax分别为(4.48±1.49) μmol /L(
±s)和(13.83±2.52) pmol/(mg.min) (±s)(n ＝6)。②将催化生成N-A-5HT的反应速度同样进行Eadie-Hofstee法作图(图2b)，却 呈曲线图形。说明在催化MT的5位上O-去甲基反应不是仅一种CYP450异构酶参与。又进一步 采用免疫特异性的CYP450 2C19和3A4二种异构酶血浆进行实验。结果表明这二种异构酶均不 参与MT的羟化反应，更进一步确证CYP4501A2是催化MT羟化反应的唯一参与者。但在MT的O- 去甲基反应中CYP4502C19约有10%～20%的催化反应，而CYP4503A4仅在高浓度10 μmol/L( MT)时，才有约2%的催化作用。根据文献[8，9]作图解析计算，在催化MT去甲基 反应中，CYP4501A2和CYP4502C19的Km分别为0.03 μmol/L和8.80 μmol/L；Vmax 分别为0.34 pmol/(mg.min)和3.17 pmol/(mg.min)，亦说明CYP4502C19对MT的O- 去甲基催化作用是较弱的。 , http://www.100md.com
图2 Eadie Hofstee法作图：底物v/s对v作图
3 讨论
关于MT的合成，已早被阐明是5-羟色胺(5-HT)在松果体内连续被N-乙酰基转移酶(N- AT)和羟基-O-甲基转移酶(H-O-MT)催化合成[10]。但MT的生物转化(降解 )是在肝脏，主要有两种方式。如前所述形成6HMT和N-A-5HT，分别占总产物70 %～80 % 和10 %～15 %，其余尚有1%以MT从尿中排出，还有少量可能会脱乙酰基和脱氨后形成5甲氧 基吲哚乙酸(5MTAA)占2%～4%[10]。这些芳香类代谢物均大部分与硫酸结合或 小部分与葡萄糖醛酸结合经肾随尿排出。本文通过体外MT和人肝微粒体温育实验，测得MT代谢物6HMT和N-A-5HT的比例和文献报导 一致。
本文是以人肝提取的微粒体进行温育实验，微粒体所含有的细胞色素氧化酶丰富，种类很多 ，参与许多物质的生物转化和激素的降解与灭活，本实验证实了褪黑素(MT)的降解主要是 由CYP4501A2所催化的6位的羟化O-去甲基作用，其次还有CYP4502C19和3A4参与O-去甲基 作用，对催化MT生物转化的细胞色素氧化酶异构酶种类进行了确定。但是我们知道还有其他 激素的降解也是通过CYP4501A2催化的，例如，雌激素[11]和某些药物[12] 。所以在临床上使用褪黑素进行药物治疗时，是否会影响其他激素的降解，以及使用某些 抑制CYP4501A2的药物时，会否影响褪黑素或其他激素的生物转化等问题。这是今后需要考 虑和研究的课题，特别是对于肝脏功能受损的患者。
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王西明，女，1944年生，教授
参考文献
1，Pang S F, Tsang C W, Hong G X et al. Fluctuation of blood melato n in concentrations with age:result of changes in pineal melatonin secretion, body growth, and aging. J Pineal Res, 1990, 8: 179
2，Reppert S M, Weaver D R. Melatonin madness. Cell, 1995, 83: 1059
3，Young I M, Leone R M, Francis et al. Melatonin is metabolized to N-acetyl-serotonin and 6-hydroxymelatonin in man. J Clin Endocrinol Metab, 1985, 60: 114
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4，Hǎrtter S, Arand M, Oesch F et al. Non-competitive inhibit ion of clomipramine N-demethylation by fluvoxamine. Psychophar Macology, 1995, 117:149.
5，Bredford M M. Rapid and sensitive method of the quantification of m icrogram quantities of protein utilising the principal of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976,72:248.
6，Raynaud F, Mauviard F, Geoffriau M et al. Plasma 6-hydroxymelat on in, 6-sulfatoxymelatonin and melatonin kinetics after melatonin administration to rats. Biol Signals, 1993, 2: 259
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(收稿：1999-11-01), 百拇医药