体外感染细胞表达HCV-NS5和复制HCV RNA的实验研究*
作者：叶进 曾令兰 杨木兰 刘微 罗端德
单位：同济医科大学附属协和医院传染病学教研室，武汉 430022
关键词：体外感染；抗原表达；复制；丙型肝炎病毒
同济医科大学学报000229 摘要：为了研究HCV-NS5和HCV RNA 在体外感染细 胞培养系统中的表达和复制情况，选用HCV RNA 水平为2×104拷贝/ml 的阳性血清感染人 肝癌细胞株(HepG2细胞株)。应用胶体金标免疫电镜法和原位杂交法检测HCV在被感染细胞 中NS5蛋白表达和RNA 复制的情况。结果在 细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附，在感染后的第1至第9代细胞中均有发现。感染 后的细胞超微结构完整，未发现HCV颗粒。在感染后的第1至第7代细胞内出现特异性杂交 信号，HCV RNA 阳性物呈蓝紫色细小颗粒分布在细胞浆和细胞核内。因此，HCV能够在HepG2 细胞中表达NS5抗原和复制RNA，而细胞超微结构完整。
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中图法分类号：R631， R392.11， R373.2
Experimental Studies on the Expression o f HCV Non-structure 5 Antigen and Replication of HCV RNA in vitro
Ye Jin, Zeng Linglan, Yang Mulan et al
Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Ton gji Medical University, Wuhan 430022
Abstract：In order to evaluate the expression of HCV non-structure 5 antige n (HCV-NS5) and replication of HCV RNA in the culture system of the infectious c ells in vitro, a human HepG2 cell line was incubated with positive serum contain ing HCV RNA of 2×104 copy/ml. The gold-labeled coloid electron microscopy and in situ hybridization were employed to detect the expression of HCV-NS5 pro t ein and the replication of HCV RNA in the infected cells. In the cytoplasm, the adsorptions of gold-labeled particles with high electronic density were found i n the cells of generation 1 to generation 9 after infection. The ultrastructure of the cells after infection was intact and no adsorptions of HCV particles were found. The special hybridization positive signals appeared in the cells of gene ration 1 to generation 7 after infection. HCV RNA positive signals were shown as blue-purple small graunles in the cytoplasm and on the membrane. It was sugges ted that HCV could expressed NS5 antigen and replicated RNA in the infected HepG 2 cell line. The ultrastructure of cells was intact.
, 百拇医药
Key words：infection in vitro; antigen expression; replication ; hepatitis C virus
HCV 是输血后肝炎的主要病原体，其感染常常发展为慢性过程[1]。丙肝发病机制 十分复杂，至今尚未完全阐明，HCV在体外感染细胞培养系统中的研究，对于弄清丙型肝炎 发病机理有着重要的意义。为了探讨HCV是否能够在体外培养细胞表达和复制，我们做了如 下研究。
1 材料与方法
1.1 感染材料
选择HCV RNA 2×104拷贝/ml (荧光定量法，试剂盒由美国Biotronics公司提供)的血清 ，经血清学检查甲、乙、丁、戊型肝炎标志为阴性，以此作为接种物。同时，选用正常人的 血清作阴性对照。
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1.2 HepG2细胞的培养
利用人肝癌细胞株(HepG2细胞株)作为靶细胞。由中国典型培养物保藏中心提供。将细胞 培养至1×105/瓶，分别用1 ml的HCV RNA 阳性或阴性血清感染细胞，置于37 ℃ CO2孵 化箱中。2 h后加入细胞培养液DMEM(不含小牛血清)过夜。次日弃去上清，用1×PBS 洗涤 3次，再加入DMEM(含100 ml/L小牛血清)继续孵化。每隔3 d细胞传代时收集细胞用于检测 ， 直到28 d。
1.3 标本制备
将收集的细胞用Hank's 液离心洗涤2次，然后用DMEM液将其制备成0.5×106/ml 的细胞 悬液，取50 μl滴片，晾干后用40 ml/L 的多聚甲醛固定。将制备好的细胞片置于-20 ℃ 的冰箱内，准备用作原位杂交。
, 百拇医药
1.4 胶体金标免疫电镜检测细胞中的HCV-NS5
将培养的HepG2细胞经40 ml/L多聚甲醛和2.5 ml/L的戊二醛混合液固定1 h。用0.05 mol/ L TBS洗涤3次，加入10 g/L牛血清白蛋白(BSA)处理30 min后，加入1∶10 的鼠抗- NS 5(由北京医科大学肝病研究所制备)，置室温30 min。0.02 mol/L TBS 洗涤3次，再经10 g/L BSA 处理30 min，加入1∶20羊抗鼠胶体金5 nm(购于武汉博士德生物工程公司)，置 室温下1 h。用0.02 mol/L TBS(pH7.4)洗涤10 min，再用0.05 mol/L PBS洗涤3次，送 同济医科大学电镜室超薄切片后检查。
1.5 原位杂交检测HCV RNA
1.5.1HCV探针：采用地高辛标记的HCV 5’端高度保守的非编码区的探针，探针的序列 为：5'-GCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGCACTCG
, 百拇医药
C，32-mer, 极性(-)。 该探针由北京赛 百盛公司合成并标记。
1.5.2 原位杂交：细胞片先后经0.2 mol/L HCl, Triton-X100 及蛋白酶K等处 理后，逐级酒精脱水。预杂交后滴加20 μl含探针的杂交液(探针浓度为1 mg/L)， 置于4 3 ℃杂交16～18 h，以SSC充分洗涤后，室温下加20 ml/L正常羊血清封闭。再滴加地高辛- 碱性磷酸酶复合物1 h。最后用NBT和BCIP显色。
1.6 对照实验
1.6.1胶体金标免疫电镜实验：分别用PBS代替抗、Ⅱ抗试验。
1.6.2 原位杂交实验：用不含标记探针的杂交液代替杂交液作空白对照。设计对照探针 ，序列为： 5'-TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG, 30-mer, 极性(-)。对细胞进行 杂交。核酸酶消化：杂交前标本先用20 mg/L RNA酶A 37 ℃ 孵化30 min，再进行杂交。
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2 结果
2.1 胶体金标免疫电镜检测 HCV-NS5结果观察
经胶体金标免疫电镜观察，细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附(见图1)。细胞核或 胞膜上也有金标颗粒的吸附。感染后第1至9代的细胞均呈阳性。在电镜下观察，被感染的细 胞超微结构完整，胞质较均匀，偶尔可见到空泡。未见明显的溶解坏死和核固缩，也未发现 病毒颗粒。
对照试验：细胞中未发现金标颗粒。
图1 感染后第一代的HepG2细胞浆内吸附电子密度大的金标颗粒 。胶体金标免疫电镜 ×10000
2.2 原位杂交法检测结果
, 百拇医药
在感染后第一代至第七代的HepG2 细胞中出现特异性杂交阳性信号。HCV RNA阳性物呈蓝紫色细小颗粒，分布在细胞核或胞浆内。其表现形式可分为核型、浆型和核浆混合型 ，以浆型占多数。阳性的细胞呈弥漫分布。
对照试验： 细胞中无特异性杂交信号出现。
3 讨论
1989年，美国Chiron公司的Choo等人[2]首先用黑猩猩建立了慢性丙型肝炎感染的 动物模型，从黑猩猩的血浆中克隆出HCV的基因组。HCV基因组为一正链RNA，含有一个大的 开放阅读框架，上游为5' 非编码区(5' NCR)，下游为3' 非编码区，其基因结构为5' NCR -C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-NCR 3'，其中NS2至NS5为非 结构蛋白。NS5功能比较明确，为RNA依赖的RNA聚合酶，主要参与基因组的复制[3] 。
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我们利用胶体金标免疫电镜法检测HCV-NS5抗原在被感染的HepG2细胞中的表达情况，实 验结果显示，在细胞浆和细胞核内见到电子密度较大的胶体金颗粒，这与众多学者的报道相 一致，HCV抗原的表达主要限定在细胞浆内[4～6]。通过电镜我们还观察到，被感 染的HepG2细胞超微结构完整，胞质均匀，未见到明显的变性和坏死。表明在丙型肝炎的发 病机理中，病毒直接损伤导致肝细胞病变不是主要原因。
原位杂交是一项分子病理学技术，定位性强，灵敏度高，1992年，Negro[7]首先报 道用原位杂交法检测HCV RNA， 开创了应用分子病理学技术在丙型肝炎领域的研究。此方法 能观察病毒核酸在组织和细胞中的定位，有利于对病毒复制和发病机理的研究。我们用地高 辛标记HCV RNA探针作原位杂交试验，在感染后第1代至第7代的HepG2细胞中发现HCV RNA 特异性杂交阳性信号，其阳性信号位于细胞浆或细胞核内，尤其多见于细胞浆内，表明HCV 核酸的复制也是在细胞质内进行。
, 百拇医药
HCV具有高度变异性，这给HCV的研究带来了极大的不便。由于缺乏合适的HCV感染的细胞和 动物模型，使得HCV的研究进展受到了明显地限制[8]。HCV-NS5和HCV RNA 在体 外培养的HepG2细胞内的表达和复制，说明HepG2细胞能够作为HCV的体外细胞的培养株。
国家教委留学回国人员基金资助项目〔No. 1995(806)〕
叶进，女，1959年生，副教授
参考文献
1，卢桥生. 丙型肝炎病毒定量检测及其临床意义. 国外医学流行病学传染病学分 册,1997,24 (3): 102
2，Choo Q L, Kuo G, Weiner A J et al. Isolation of a cDNA clone der ive d from a bloodborne non-A, non-B, viral hepatitis genome. Sience, 1989, 244： 359
, 百拇医药
3，单梅梅.丙型肝炎病毒体外复制和表达的若干研究进展.国外医学流行病学传染 病学分册，1997, 24 (3)：97
4，王林杰，王松山.丙型肝炎肝穿组织中丙型肝炎病毒C33C抗原的免疫组织化学 研究. 中华实验和临床病毒学杂志，1996，10 (2)：193
5，Lungu O, Sun X W, Wrught T C et al. A polymerase chain reaction -enzyme-linked immunosorbent assay method for detecting human papilloma virus in cervical carcinomas and high-grade cervical cancer precursors. Obtet Gynecol , 1995, 47：337
6，赵西平，杨东亮，陈孝平等. 肝细胞肝癌癌变及癌旁肝组织中HCV NS5蛋白 的检测. 中华传染病杂志，1997，15 (2)：79
7，Negro F, Pacchioni D, Shimizu Y et al. Detection of intrahepatic replication of hepatitis C virus RNA by in situ hybridization and comparison with histopathology. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 2247
8，王小红.抗丙型肝炎病毒药物评价模型研究进展. 国外医学流行病学传染病学 分册， 1997, 24 (4)：156
(收稿；1999-04-27), 百拇医药
单位：同济医科大学附属协和医院传染病学教研室，武汉 430022
关键词：体外感染；抗原表达；复制；丙型肝炎病毒
同济医科大学学报000229 摘要：为了研究HCV-NS5和HCV RNA 在体外感染细 胞培养系统中的表达和复制情况，选用HCV RNA 水平为2×104拷贝/ml 的阳性血清感染人 肝癌细胞株(HepG2细胞株)。应用胶体金标免疫电镜法和原位杂交法检测HCV在被感染细胞 中NS5蛋白表达和RNA 复制的情况。结果在 细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附，在感染后的第1至第9代细胞中均有发现。感染 后的细胞超微结构完整，未发现HCV颗粒。在感染后的第1至第7代细胞内出现特异性杂交 信号，HCV RNA 阳性物呈蓝紫色细小颗粒分布在细胞浆和细胞核内。因此，HCV能够在HepG2 细胞中表达NS5抗原和复制RNA，而细胞超微结构完整。
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中图法分类号：R631， R392.11， R373.2
Experimental Studies on the Expression o f HCV Non-structure 5 Antigen and Replication of HCV RNA in vitro
Ye Jin, Zeng Linglan, Yang Mulan et al
Department of Infectious Diseases, Xiehe Hospital, Ton gji Medical University, Wuhan 430022
Abstract：In order to evaluate the expression of HCV non-structure 5 antige n (HCV-NS5) and replication of HCV RNA in the culture system of the infectious c ells in vitro, a human HepG2 cell line was incubated with positive serum contain ing HCV RNA of 2×104 copy/ml. The gold-labeled coloid electron microscopy and in situ hybridization were employed to detect the expression of HCV-NS5 pro t ein and the replication of HCV RNA in the infected cells. In the cytoplasm, the adsorptions of gold-labeled particles with high electronic density were found i n the cells of generation 1 to generation 9 after infection. The ultrastructure of the cells after infection was intact and no adsorptions of HCV particles were found. The special hybridization positive signals appeared in the cells of gene ration 1 to generation 7 after infection. HCV RNA positive signals were shown as blue-purple small graunles in the cytoplasm and on the membrane. It was sugges ted that HCV could expressed NS5 antigen and replicated RNA in the infected HepG 2 cell line. The ultrastructure of cells was intact.
, 百拇医药
Key words：infection in vitro; antigen expression; replication ; hepatitis C virus
HCV 是输血后肝炎的主要病原体，其感染常常发展为慢性过程[1]。丙肝发病机制 十分复杂，至今尚未完全阐明，HCV在体外感染细胞培养系统中的研究，对于弄清丙型肝炎 发病机理有着重要的意义。为了探讨HCV是否能够在体外培养细胞表达和复制，我们做了如 下研究。
1 材料与方法
1.1 感染材料
选择HCV RNA 2×104拷贝/ml (荧光定量法，试剂盒由美国Biotronics公司提供)的血清 ，经血清学检查甲、乙、丁、戊型肝炎标志为阴性，以此作为接种物。同时，选用正常人的 血清作阴性对照。
, http://www.100md.com
1.2 HepG2细胞的培养
利用人肝癌细胞株(HepG2细胞株)作为靶细胞。由中国典型培养物保藏中心提供。将细胞 培养至1×105/瓶，分别用1 ml的HCV RNA 阳性或阴性血清感染细胞，置于37 ℃ CO2孵 化箱中。2 h后加入细胞培养液DMEM(不含小牛血清)过夜。次日弃去上清，用1×PBS 洗涤 3次，再加入DMEM(含100 ml/L小牛血清)继续孵化。每隔3 d细胞传代时收集细胞用于检测 ， 直到28 d。
1.3 标本制备
将收集的细胞用Hank's 液离心洗涤2次，然后用DMEM液将其制备成0.5×106/ml 的细胞 悬液，取50 μl滴片，晾干后用40 ml/L 的多聚甲醛固定。将制备好的细胞片置于-20 ℃ 的冰箱内，准备用作原位杂交。
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1.4 胶体金标免疫电镜检测细胞中的HCV-NS5
将培养的HepG2细胞经40 ml/L多聚甲醛和2.5 ml/L的戊二醛混合液固定1 h。用0.05 mol/ L TBS洗涤3次，加入10 g/L牛血清白蛋白(BSA)处理30 min后，加入1∶10 的鼠抗- NS 5(由北京医科大学肝病研究所制备)，置室温30 min。0.02 mol/L TBS 洗涤3次，再经10 g/L BSA 处理30 min，加入1∶20羊抗鼠胶体金5 nm(购于武汉博士德生物工程公司)，置 室温下1 h。用0.02 mol/L TBS(pH7.4)洗涤10 min，再用0.05 mol/L PBS洗涤3次，送 同济医科大学电镜室超薄切片后检查。
1.5 原位杂交检测HCV RNA
1.5.1HCV探针：采用地高辛标记的HCV 5’端高度保守的非编码区的探针，探针的序列 为：5'-GCACGGTCTACGAGACCTCCCGGGGCACTCG
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C，32-mer, 极性(-)。 该探针由北京赛 百盛公司合成并标记。
1.5.2 原位杂交：细胞片先后经0.2 mol/L HCl, Triton-X100 及蛋白酶K等处 理后，逐级酒精脱水。预杂交后滴加20 μl含探针的杂交液(探针浓度为1 mg/L)， 置于4 3 ℃杂交16～18 h，以SSC充分洗涤后，室温下加20 ml/L正常羊血清封闭。再滴加地高辛- 碱性磷酸酶复合物1 h。最后用NBT和BCIP显色。
1.6 对照实验
1.6.1胶体金标免疫电镜实验：分别用PBS代替抗、Ⅱ抗试验。
1.6.2 原位杂交实验：用不含标记探针的杂交液代替杂交液作空白对照。设计对照探针 ，序列为： 5'-TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG, 30-mer, 极性(-)。对细胞进行 杂交。核酸酶消化：杂交前标本先用20 mg/L RNA酶A 37 ℃ 孵化30 min，再进行杂交。
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2 结果
2.1 胶体金标免疫电镜检测 HCV-NS5结果观察
经胶体金标免疫电镜观察，细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附(见图1)。细胞核或 胞膜上也有金标颗粒的吸附。感染后第1至9代的细胞均呈阳性。在电镜下观察，被感染的细 胞超微结构完整，胞质较均匀，偶尔可见到空泡。未见明显的溶解坏死和核固缩，也未发现 病毒颗粒。
对照试验：细胞中未发现金标颗粒。
图1 感染后第一代的HepG2细胞浆内吸附电子密度大的金标颗粒 。胶体金标免疫电镜 ×10000
2.2 原位杂交法检测结果
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在感染后第一代至第七代的HepG2 细胞中出现特异性杂交阳性信号。HCV RNA阳性物呈蓝紫色细小颗粒，分布在细胞核或胞浆内。其表现形式可分为核型、浆型和核浆混合型 ，以浆型占多数。阳性的细胞呈弥漫分布。
对照试验： 细胞中无特异性杂交信号出现。
3 讨论
1989年，美国Chiron公司的Choo等人[2]首先用黑猩猩建立了慢性丙型肝炎感染的 动物模型，从黑猩猩的血浆中克隆出HCV的基因组。HCV基因组为一正链RNA，含有一个大的 开放阅读框架，上游为5' 非编码区(5' NCR)，下游为3' 非编码区，其基因结构为5' NCR -C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-NCR 3'，其中NS2至NS5为非 结构蛋白。NS5功能比较明确，为RNA依赖的RNA聚合酶，主要参与基因组的复制[3] 。
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我们利用胶体金标免疫电镜法检测HCV-NS5抗原在被感染的HepG2细胞中的表达情况，实 验结果显示，在细胞浆和细胞核内见到电子密度较大的胶体金颗粒，这与众多学者的报道相 一致，HCV抗原的表达主要限定在细胞浆内[4～6]。通过电镜我们还观察到，被感 染的HepG2细胞超微结构完整，胞质均匀，未见到明显的变性和坏死。表明在丙型肝炎的发 病机理中，病毒直接损伤导致肝细胞病变不是主要原因。
原位杂交是一项分子病理学技术，定位性强，灵敏度高，1992年，Negro[7]首先报 道用原位杂交法检测HCV RNA， 开创了应用分子病理学技术在丙型肝炎领域的研究。此方法 能观察病毒核酸在组织和细胞中的定位，有利于对病毒复制和发病机理的研究。我们用地高 辛标记HCV RNA探针作原位杂交试验，在感染后第1代至第7代的HepG2细胞中发现HCV RNA 特异性杂交阳性信号，其阳性信号位于细胞浆或细胞核内，尤其多见于细胞浆内，表明HCV 核酸的复制也是在细胞质内进行。
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HCV具有高度变异性，这给HCV的研究带来了极大的不便。由于缺乏合适的HCV感染的细胞和 动物模型，使得HCV的研究进展受到了明显地限制[8]。HCV-NS5和HCV RNA 在体 外培养的HepG2细胞内的表达和复制，说明HepG2细胞能够作为HCV的体外细胞的培养株。
国家教委留学回国人员基金资助项目〔No. 1995(806)〕
叶进，女，1959年生，副教授
参考文献
1，卢桥生. 丙型肝炎病毒定量检测及其临床意义. 国外医学流行病学传染病学分 册,1997,24 (3): 102
2，Choo Q L, Kuo G, Weiner A J et al. Isolation of a cDNA clone der ive d from a bloodborne non-A, non-B, viral hepatitis genome. Sience, 1989, 244： 359
, 百拇医药
3，单梅梅.丙型肝炎病毒体外复制和表达的若干研究进展.国外医学流行病学传染 病学分册，1997, 24 (3)：97
4，王林杰，王松山.丙型肝炎肝穿组织中丙型肝炎病毒C33C抗原的免疫组织化学 研究. 中华实验和临床病毒学杂志，1996，10 (2)：193
5，Lungu O, Sun X W, Wrught T C et al. A polymerase chain reaction -enzyme-linked immunosorbent assay method for detecting human papilloma virus in cervical carcinomas and high-grade cervical cancer precursors. Obtet Gynecol , 1995, 47：337
6，赵西平，杨东亮，陈孝平等. 肝细胞肝癌癌变及癌旁肝组织中HCV NS5蛋白 的检测. 中华传染病杂志，1997，15 (2)：79
7，Negro F, Pacchioni D, Shimizu Y et al. Detection of intrahepatic replication of hepatitis C virus RNA by in situ hybridization and comparison with histopathology. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89: 2247
8，王小红.抗丙型肝炎病毒药物评价模型研究进展. 国外医学流行病学传染病学 分册， 1997, 24 (4)：156
(收稿；1999-04-27), 百拇医药