异丙肾上腺素调节窦房结起搏细胞延迟整流钾通道信号传递机制的研究
作者：镇郁琼 雷鸣
单位：镇郁琼(同济医科大学附设卫校生理学教研室，武汉 430030)；雷鸣(Cellular Cardiac Group, Department of Physiology, University of Leeds,Leeds , LS2 9JT.U.K.)
关键词：异丙肾上腺素；延迟整流钾通道；窦房结起搏细胞
同济医科大学学报000211 摘要：采用全细胞膜片钳技术研究β-受体激动剂异丙肾上腺素调节窦房结起搏细胞延迟整 流钾通道信号传递机制。结果发现，采用cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂(H-89)选择性阻断c AMP-依赖性蛋白激酶磷酸化途径后，异丙肾上腺素依赖性Ik激活被抑制，而用选择性蛋 白激酶C抑制剂Bisindolymaleimide(磷酸化途径)后则异丙肾上腺素依赖性Ik激活未能被 抑制。提示异丙肾上腺素调节Ik的信号传递机制主要通过cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)磷 酸化途径。
, 百拇医药
中图法分类号：R971， R322.1
Study on the Signal Transmit Mechanism of β-acceptor Agonist-Isoprenaline Regulating Sinus P-cell Delayed Recti fier Potassium Channels
Zhen Yuqiong Lei Ming
Affiliated Health School of Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：Signal transmit mechanism of β-acceptor agonist-is oprenaline regulating sinus P-cell delayed rectifier potassium channels was st udied by using whole cell patch clamp technique. It was found that the activatio n of isoprenaline-dependent Ik was inhibited by using antagonist (H-89) of cAM P-dependent PKA to block phosphorylation of cAMP-dependence PKA. But the activ ation of isoprenaline-dependent Ik was not inhibited by using selective antagon ist (Bisindolymaleimide I) of PKA C. It was suggested that the signal transmit mechanism of isoprenaline regulating Ik might be mainly contributed to the phosp horylation of cAMP- dependent PKA.
, 百拇医药
Key words：isoprenaline; delayed rectifier potassium channel;sinus P-cell
延迟整流钾通道(Ik)在心肌细胞动作电位复极及窦房结起搏发生中起着十分重要的作用。 虽然有关研究表明调节心肌细胞延迟整流钾通道是β-受体激动剂影响心脏起搏与收缩功能 的重要机制和途径之一[1]，但β-受体激动剂调节窦房结细胞延迟整流钾通道的 信号传递机制仍不清楚。本文拟阐明β-受体激动剂调节窦房结细胞延迟整流钾通道的信号 传递机制。
1 材料与方法
1.1 实验液体
台氏液(mol/L):NaCl 140,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 1.0,glucose 5.5,HEPES 5. 0；用NaOH将pH调至7.4无钙台氏液去CaCl2 1.8。
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KB液(mol/L):KOH 70,KCl 40,L-glutamic acid 50, Taurine 20, KH2PO4 20,MgCl 2 3, glucose 10,HEPES 10,EGTA 0.5，用KOH将pH调至7.4。电极内液(mol/L):KOH 80, K Cl 50,Aspartic,acid 80, MgCl2 1,ATP-Mg 5,Cr-p ditris 2.5,Cr-pdisodium 2.5 ,HEPES 10,EGTA 0.1，用KOH将pH调至7.4。
1.2 试剂
异丙肾上腺素从Sigma Chemical Co.购买。H-89(n-[2-(p-bromocinn amylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide),Bisdolymalei-mide I从Calbiochem -Novabiochem(U.K.)购买。
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1.3 方法
采用Brown氏法[2，3]分离兔窦房结起搏细胞，将500～1000 g新西兰白兔处死后迅 速取出心脏主动脉逆灌37 ℃含氧台氏液5 min,在显微镜下分离窦房结区域组织，将窦房结 组织切成约3 mm×0.5 mm的3～5块长条。在37 ℃含氧无钙台氏液5 min后放入含胶原酶(Si gma I型230 μ/ml)，弹性酶(Sigma IIA型15 μ/ml )温浴30～40 min。取出窦房结组织置K B液4 ℃下保存60 min,用玻璃吸管缓慢吸抽单个窦房结起搏细胞。
在实验中，将细胞置于持续灌流恒温(37 ℃)的台氏液浴槽。
1.4 全细胞膜片钳实验
采用全细胞膜片钳记录单个窦房结起搏细胞有关电活动，采用Narishige(PP-83)电极拉制 器拉制尖端为1～2 μm玻璃电极，阻抗为38 MΩ,Axopatch-ID膜片钳放大器(Axon Instru ments Inc.)用于全细胞膜片钳实验。电信号同步显示在监视器(Philips,PM-3335)和记录 仪(Gould,TA240),数据经AD/DA转换器(CED 1401)转换后存储于计算机(采样频率1 kHz)。CE D (Cambridge Electronic Design)软件用于分析数据。
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1.5 统计分析
所有数据用
±s表示，采用t检验。
2 结果
2.1 异丙肾上腺素对Ik激活特征的影响
将细胞膜电位钳制在-50 mv,Ik从-40增至+50 mv,每次递增10 mv的1000 ms除极刺激方 波激活，分两组，一组为空白对照组，另一组给予20 mol/L异丙肾上腺素，5 min后从单个 窦房结起搏细胞记录Ik电流，发现20 mol/L异丙肾上腺素显著增加Ik电流峰值。图1 示空白对照组和20 mol/L异丙肾上腺素组5 min后窦房结起搏细胞(n=5)的 Ik激活曲 线。激活曲线由经标准化后数据采用Beltzmann方程处理而产生。
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Beltzmann方程为：a=1/[1+explV1/2-Vm1/K]其中a为激活变量，V1 /2为半激活电压，K为斜率常数。空白对照，V1/2和K参数分别为：(-10.4±1.8 ) mv，(12.6±1.5) mv。异丙肾上腺素组，V1/2和K参数分别为：(-23.7±3) mv 和(12.8±1.2) mv。因此，异丙肾上腺素使Ik激活曲线显著左移(-10 mv)，表明在同 一除极电流下将有更多Ik通道被激活。
附图 对照组和异丙肾上腺素组窦房结起搏细胞的Ik激活曲线
2.2 异丙肾上腺素依赖性IK激活的信号传递
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Ik被-40～+50 mv的1000 ms除极方波激活。给予200 mol/L bisindolymaleimideI 5 mi n 后PKC被抑制，加100 mol/L异丙肾上腺素，Ik尾电流峰值曲线示异丙肾上腺素仍使I k尾电流增加(62±21)%，表明选择性抑制PKC对异丙肾上腺素依赖性Ik激活无影响，H-8 9对异丙肾上腺素依赖性Ik激活有影响，给予100 mol/L异丙肾上腺素10 min后再加 10 mol/L H-89(选择性PKA抑制剂)，异丙肾上腺素依赖性Ik激活被抑制，表明异丙肾上 腺素依赖性Ik激活可被选择性抑制PKA逆转。
本研究采用不同的给药顺序，其理由为：①完整的研究应为二种阻断剂均采用顺序一致的IS O激活Ik前或激活Ik后给药，由于二种阻断剂价格昂贵，且本研究采用细胞外给药(二种 阻断剂均为细胞膜可透性)，如采用完整的方案则研究费用高，而采用不同的给药顺序即获 得一样的结果。② H-89为一选择性PKA阻断剂，如H-89能逆转或阻断ISO依赖性Ik激活, 已说明其激活途径为PKA依赖性，采用Bisindolymoleimide I 实际上为一种补充实验。
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3 讨论
β-受体依赖性调节窦房结起搏细胞膜离子通道是心脏自律性和心率调控的重要机制之一 [1]。过去的研究表明，参与心脏窦房结起搏机制的膜离子通道主要有以下几种：延 迟整流钾通道(Ik)参与窦房结起搏细胞动作电位舒张早期自动化除极前1/3相，电压依赖 性内向钙电流(ICa,L,ICa,T)参与舒张早期自动化除极中1/3相，超极化内向电 流(If)则参与早期自动化除极后1/3相[1]。β-受体依赖性调节窦房结起搏细胞 ICa,L,If通道的信号传递途径可通过cAMP-依赖性PKA磷酸化途径和G-蛋白依赖性直接调控机制[1]。本研究通过 采 用选择性cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂和蛋白激酶C抑制剂分别抑制cAMP-依赖性蛋白激酶( PKA)磷酸化途径或蛋白激酶C(PKC)磷酸化途径研究了β-受体激动剂异丙肾上腺素调节Ik 的信号传递机制。结果发现，H-89选择抑制cAMP-依赖性蛋白激酶阻断cAMP-依赖性PKA磷 酸化途径后异 丙 肾上腺素依赖性Ik激活被抑制。而bisindolymaleimide I 选择性阻断PKC磷酸化途径后异 丙 肾上腺素依赖性Ik激活未能被抑制。提示异丙肾上腺素调节Ik信号传递机制主要通过cA MP-依赖性PKA磷酸化途径。
, 百拇医药
镇郁琼，女，1953年生，副主任医师
参考文献
1，Irisawa H, Brown H F, Giles W. Cardiac pacemaking in the sinoatri al node.Physiol Rev, 1993,73:197
2，Lei M, Brown H F. Two components of the delayed rectifier potassi um current, Ik,in rabbit sino-atrial node cells. Experimental Physiology, 199 6,81:725
3，Yuan W. D Protein kinase inhibitor H-89 reverses forskolin simu lation of cardiac L-type calcium current. Am J physiol, 1995,268:C651
(收稿：1999-01-28), http://www.100md.com
单位：镇郁琼(同济医科大学附设卫校生理学教研室，武汉 430030)；雷鸣(Cellular Cardiac Group, Department of Physiology, University of Leeds,Leeds , LS2 9JT.U.K.)
关键词：异丙肾上腺素；延迟整流钾通道；窦房结起搏细胞
同济医科大学学报000211 摘要：采用全细胞膜片钳技术研究β-受体激动剂异丙肾上腺素调节窦房结起搏细胞延迟整 流钾通道信号传递机制。结果发现，采用cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂(H-89)选择性阻断c AMP-依赖性蛋白激酶磷酸化途径后，异丙肾上腺素依赖性Ik激活被抑制，而用选择性蛋 白激酶C抑制剂Bisindolymaleimide(磷酸化途径)后则异丙肾上腺素依赖性Ik激活未能被 抑制。提示异丙肾上腺素调节Ik的信号传递机制主要通过cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)磷 酸化途径。
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中图法分类号：R971， R322.1
Study on the Signal Transmit Mechanism of β-acceptor Agonist-Isoprenaline Regulating Sinus P-cell Delayed Recti fier Potassium Channels
Zhen Yuqiong Lei Ming
Affiliated Health School of Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：Signal transmit mechanism of β-acceptor agonist-is oprenaline regulating sinus P-cell delayed rectifier potassium channels was st udied by using whole cell patch clamp technique. It was found that the activatio n of isoprenaline-dependent Ik was inhibited by using antagonist (H-89) of cAM P-dependent PKA to block phosphorylation of cAMP-dependence PKA. But the activ ation of isoprenaline-dependent Ik was not inhibited by using selective antagon ist (Bisindolymaleimide I) of PKA C. It was suggested that the signal transmit mechanism of isoprenaline regulating Ik might be mainly contributed to the phosp horylation of cAMP- dependent PKA.
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Key words：isoprenaline; delayed rectifier potassium channel;sinus P-cell
延迟整流钾通道(Ik)在心肌细胞动作电位复极及窦房结起搏发生中起着十分重要的作用。 虽然有关研究表明调节心肌细胞延迟整流钾通道是β-受体激动剂影响心脏起搏与收缩功能 的重要机制和途径之一[1]，但β-受体激动剂调节窦房结细胞延迟整流钾通道的 信号传递机制仍不清楚。本文拟阐明β-受体激动剂调节窦房结细胞延迟整流钾通道的信号 传递机制。
1 材料与方法
1.1 实验液体
台氏液(mol/L):NaCl 140,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 1.0,glucose 5.5,HEPES 5. 0；用NaOH将pH调至7.4无钙台氏液去CaCl2 1.8。
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KB液(mol/L):KOH 70,KCl 40,L-glutamic acid 50, Taurine 20, KH2PO4 20,MgCl 2 3, glucose 10,HEPES 10,EGTA 0.5，用KOH将pH调至7.4。电极内液(mol/L):KOH 80, K Cl 50,Aspartic,acid 80, MgCl2 1,ATP-Mg 5,Cr-p ditris 2.5,Cr-pdisodium 2.5 ,HEPES 10,EGTA 0.1，用KOH将pH调至7.4。
1.2 试剂
异丙肾上腺素从Sigma Chemical Co.购买。H-89(n-[2-(p-bromocinn amylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide),Bisdolymalei-mide I从Calbiochem -Novabiochem(U.K.)购买。
, http://www.100md.com
1.3 方法
采用Brown氏法[2，3]分离兔窦房结起搏细胞，将500～1000 g新西兰白兔处死后迅 速取出心脏主动脉逆灌37 ℃含氧台氏液5 min,在显微镜下分离窦房结区域组织，将窦房结 组织切成约3 mm×0.5 mm的3～5块长条。在37 ℃含氧无钙台氏液5 min后放入含胶原酶(Si gma I型230 μ/ml)，弹性酶(Sigma IIA型15 μ/ml )温浴30～40 min。取出窦房结组织置K B液4 ℃下保存60 min,用玻璃吸管缓慢吸抽单个窦房结起搏细胞。
在实验中，将细胞置于持续灌流恒温(37 ℃)的台氏液浴槽。
1.4 全细胞膜片钳实验
采用全细胞膜片钳记录单个窦房结起搏细胞有关电活动，采用Narishige(PP-83)电极拉制 器拉制尖端为1～2 μm玻璃电极，阻抗为38 MΩ,Axopatch-ID膜片钳放大器(Axon Instru ments Inc.)用于全细胞膜片钳实验。电信号同步显示在监视器(Philips,PM-3335)和记录 仪(Gould,TA240),数据经AD/DA转换器(CED 1401)转换后存储于计算机(采样频率1 kHz)。CE D (Cambridge Electronic Design)软件用于分析数据。
, 百拇医药
1.5 统计分析
所有数据用
±s表示，采用t检验。2 结果
2.1 异丙肾上腺素对Ik激活特征的影响
将细胞膜电位钳制在-50 mv,Ik从-40增至+50 mv,每次递增10 mv的1000 ms除极刺激方 波激活，分两组，一组为空白对照组，另一组给予20 mol/L异丙肾上腺素，5 min后从单个 窦房结起搏细胞记录Ik电流，发现20 mol/L异丙肾上腺素显著增加Ik电流峰值。图1 示空白对照组和20 mol/L异丙肾上腺素组5 min后窦房结起搏细胞(n=5)的 Ik激活曲 线。激活曲线由经标准化后数据采用Beltzmann方程处理而产生。
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Beltzmann方程为：a=1/[1+explV1/2-Vm1/K]其中a为激活变量，V1 /2为半激活电压，K为斜率常数。空白对照，V1/2和K参数分别为：(-10.4±1.8 ) mv，(12.6±1.5) mv。异丙肾上腺素组，V1/2和K参数分别为：(-23.7±3) mv 和(12.8±1.2) mv。因此，异丙肾上腺素使Ik激活曲线显著左移(-10 mv)，表明在同 一除极电流下将有更多Ik通道被激活。
附图 对照组和异丙肾上腺素组窦房结起搏细胞的Ik激活曲线
2.2 异丙肾上腺素依赖性IK激活的信号传递
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Ik被-40～+50 mv的1000 ms除极方波激活。给予200 mol/L bisindolymaleimideI 5 mi n 后PKC被抑制，加100 mol/L异丙肾上腺素，Ik尾电流峰值曲线示异丙肾上腺素仍使I k尾电流增加(62±21)%，表明选择性抑制PKC对异丙肾上腺素依赖性Ik激活无影响，H-8 9对异丙肾上腺素依赖性Ik激活有影响，给予100 mol/L异丙肾上腺素10 min后再加 10 mol/L H-89(选择性PKA抑制剂)，异丙肾上腺素依赖性Ik激活被抑制，表明异丙肾上 腺素依赖性Ik激活可被选择性抑制PKA逆转。
本研究采用不同的给药顺序，其理由为：①完整的研究应为二种阻断剂均采用顺序一致的IS O激活Ik前或激活Ik后给药，由于二种阻断剂价格昂贵，且本研究采用细胞外给药(二种 阻断剂均为细胞膜可透性)，如采用完整的方案则研究费用高，而采用不同的给药顺序即获 得一样的结果。② H-89为一选择性PKA阻断剂，如H-89能逆转或阻断ISO依赖性Ik激活, 已说明其激活途径为PKA依赖性，采用Bisindolymoleimide I 实际上为一种补充实验。
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β-受体依赖性调节窦房结起搏细胞膜离子通道是心脏自律性和心率调控的重要机制之一 [1]。过去的研究表明，参与心脏窦房结起搏机制的膜离子通道主要有以下几种：延 迟整流钾通道(Ik)参与窦房结起搏细胞动作电位舒张早期自动化除极前1/3相，电压依赖 性内向钙电流(ICa,L,ICa,T)参与舒张早期自动化除极中1/3相，超极化内向电 流(If)则参与早期自动化除极后1/3相[1]。β-受体依赖性调节窦房结起搏细胞 ICa,L,If通道的信号传递途径可通过cAMP-依赖性PKA磷酸化途径和G-蛋白依赖性直接调控机制[1]。本研究通过 采 用选择性cAMP-依赖性蛋白激酶抑制剂和蛋白激酶C抑制剂分别抑制cAMP-依赖性蛋白激酶( PKA)磷酸化途径或蛋白激酶C(PKC)磷酸化途径研究了β-受体激动剂异丙肾上腺素调节Ik 的信号传递机制。结果发现，H-89选择抑制cAMP-依赖性蛋白激酶阻断cAMP-依赖性PKA磷 酸化途径后异 丙 肾上腺素依赖性Ik激活被抑制。而bisindolymaleimide I 选择性阻断PKC磷酸化途径后异 丙 肾上腺素依赖性Ik激活未能被抑制。提示异丙肾上腺素调节Ik信号传递机制主要通过cA MP-依赖性PKA磷酸化途径。
, 百拇医药
镇郁琼，女，1953年生，副主任医师
参考文献
1，Irisawa H, Brown H F, Giles W. Cardiac pacemaking in the sinoatri al node.Physiol Rev, 1993,73:197
2，Lei M, Brown H F. Two components of the delayed rectifier potassi um current, Ik,in rabbit sino-atrial node cells. Experimental Physiology, 199 6,81:725
3，Yuan W. D Protein kinase inhibitor H-89 reverses forskolin simu lation of cardiac L-type calcium current. Am J physiol, 1995,268:C651
(收稿：1999-01-28), http://www.100md.com