缺血再灌注大鼠肝组织细胞核NF-κ B提取
作者：徐钧 牛勃 王惠珍 解军 吴玲
单位：徐钧(山西医科大学第一临床医学院普外科 太原 030001)；牛勃(山西医科大学生物化学教研室)；王惠珍(山西医科大学生物化学教研室)；解军(山西医科大学生物化学教研室)；吴玲(太原市卫生防疫站稽查科)
关键词：大鼠；肝；核蛋白类
山西医科大学学报000260 摘要： 应用液氮快速冷冻组织破碎技术，将缺血再灌注大鼠肝组织破碎，去除组织细胞碎片。应用高盐溶液提取法、高速离心法分离纯化大鼠肝组织核蛋白。提取物经凝胶滞留电泳分析其NF-κ B成分，结果满意。该方法的建立，为进一步研究核转录因子活性及其调控基因的表达提供了基础。
中图分类号： Q756 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0190-02
, 百拇医药
NF-κB(nuclear transcription factor κB)是一个重要的细胞核转录因子，它能影响和控制多种基因的表达调控[1]。提取核蛋白是研究 NF-κB 转录活性的一个关键步骤，只有获得符合研究要求纯度的核蛋白，才能进一步研究核蛋白中的转录因子与特异基因序列的结合作用。核蛋白提取时，材料来源很多。我们针对大鼠肝细胞组织的特点，制定了快速提取方案。
1 实验材料
1.1 动物：250 g雄性Wistar大鼠。
1.2 试剂及材料 实验试剂均为分析纯级，购于邦定公司。benzamidine,pepstatin,leupeptin,aprotinit购于Sigma公司。
缓冲液 A：(0.6%NP-40，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L HEPES(pH7.9)，1 mmol/L PMSF)。缓冲液 B:(25% glycerol,20 mmol/L HEPES(pH 7.9),420 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L Mg2Cl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，2 mmol/L benzamidine,5 mg/L pepstatin,5 mg/L leupeptin,5 mg/L aprotinit).
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 缺血再灌注大鼠肝组织的获得 取250 g雄性Wistar大鼠，建立肝脏缺血模型[2]，分别再灌注1 h、2 h后，取肝组织，保存于-70℃待用。
2.2 核蛋白提取 取500 mg肝组织，冻于液氮中。隔铝泊纸捣碎。用5 ml 缓冲液 A 溶解粉末，用15 ml Dounce匀浆器匀浆5次。转入15 ml管中离心，0℃，2 000 r/min，30 s，弃未破碎组织。上清液在冰中放置5 min，离心，0℃，5 000 γ/min。核提取物用500 μl 缓冲液 B重悬。放置冰浴20 min。然后转入微量离心管，离心0℃，12 000 r/min，25 min。保留上清液，分装，存于-70℃，待用。
2.3 核蛋白提取物蛋白含量测定 分别取缺血再灌注大鼠肝组织及正常对照大鼠肝组织的核提取物0.1 ml按照Coomassie Brilliant Blue法进行蛋白含量测定。以BSA为标准，制作蛋白标准曲线[3]。
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2.4 凝胶滞留电泳 取核蛋白提取物3 μl，与γ-P32标记的 NF-κB 寡核苷酸探针结合，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离NF-κB探针复合物，电泳2 h，然后-70℃自显影48 h[4]。
3 结果
3.1 核蛋白提取物的蛋白含量分析 标准曲线方程 Y＝0.012X-0.375，R2＝0.976 4。见表1。核蛋白提取凝胶滞留电泳见图1。
表1 大鼠肝组织核蛋白提取物蛋白含量分析 组别
OD595nm
蛋白浓度(g/L)
正常对照
, 百拇医药
0.07
0.21
缺血再灌注(1 h)
0.33
1.00
缺血再灌注(2 h)
0.38
1.15
3.2 凝胶滞留电泳分析核提取物成分见图1。
1.正常对照大鼠肝组织；2.缺血再灌注1h大鼠肝组织；
, 百拇医药 3.缺血再灌注2 h大鼠肝组织
图1 大鼠肝组织核蛋白提取物凝胶滞留电泳图
4 讨论
NF-κB是一种重要的核转录因子，它能影响IL-1，TNF-α，ICAM-1等细胞因子及粘附分子的基因表达[1，5]。在器官、组织的损伤及损伤修复中起重要作用。研究转录因子的首要环节就是核蛋白的提取。只有得到具有活性的核蛋白才能进一步研究核蛋白成分及生物学活性。本工作改进了常用的超声溶解提取法，利用液氮冷冻破碎技术，有效破碎、分离了大鼠肝组织细胞核，使操作省时、简便、快捷。本结果经凝胶滞留电泳分析测定，提取物中含有符合实验要求的DNA结合蛋白NF-κB。本方法适合大量肝组织样品的提取，及进一步对样品中核因子活性的分析研究。
作者简介：徐钧，男，1967年10月生，硕士，主治医师
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] Baldwin AS, Verma IM. The NF-κ B and I-κ B protein:new discoveries and insight[J].Annu Rev Immunol，1995，66：225～287.
[2] 熊成龙，吴在德. 常温肝脏缺血再灌注损伤防治的实验研究[J]. 中国病理生理杂志， 1998， 14(1)： 35～38.
[3] 李建武. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京：北京大学出版社，1994.174～176.
[4] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京：高等教育出版社，1993.479.
[5] May MJ,Ghosh S.Signal transduction through NF-κ B[J].Immunol Today， 1998， 19：80～88.
收稿日期：2000-03-30, 百拇医药
单位：徐钧(山西医科大学第一临床医学院普外科 太原 030001)；牛勃(山西医科大学生物化学教研室)；王惠珍(山西医科大学生物化学教研室)；解军(山西医科大学生物化学教研室)；吴玲(太原市卫生防疫站稽查科)
关键词：大鼠；肝；核蛋白类
山西医科大学学报000260 摘要： 应用液氮快速冷冻组织破碎技术，将缺血再灌注大鼠肝组织破碎，去除组织细胞碎片。应用高盐溶液提取法、高速离心法分离纯化大鼠肝组织核蛋白。提取物经凝胶滞留电泳分析其NF-κ B成分，结果满意。该方法的建立，为进一步研究核转录因子活性及其调控基因的表达提供了基础。
中图分类号： Q756 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0190-02
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NF-κB(nuclear transcription factor κB)是一个重要的细胞核转录因子，它能影响和控制多种基因的表达调控[1]。提取核蛋白是研究 NF-κB 转录活性的一个关键步骤，只有获得符合研究要求纯度的核蛋白，才能进一步研究核蛋白中的转录因子与特异基因序列的结合作用。核蛋白提取时，材料来源很多。我们针对大鼠肝细胞组织的特点，制定了快速提取方案。
1 实验材料
1.1 动物：250 g雄性Wistar大鼠。
1.2 试剂及材料 实验试剂均为分析纯级，购于邦定公司。benzamidine,pepstatin,leupeptin,aprotinit购于Sigma公司。
缓冲液 A：(0.6%NP-40，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L HEPES(pH7.9)，1 mmol/L PMSF)。缓冲液 B:(25% glycerol,20 mmol/L HEPES(pH 7.9),420 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L Mg2Cl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，2 mmol/L benzamidine,5 mg/L pepstatin,5 mg/L leupeptin,5 mg/L aprotinit).
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2 方法
2.1 缺血再灌注大鼠肝组织的获得 取250 g雄性Wistar大鼠，建立肝脏缺血模型[2]，分别再灌注1 h、2 h后，取肝组织，保存于-70℃待用。
2.2 核蛋白提取 取500 mg肝组织，冻于液氮中。隔铝泊纸捣碎。用5 ml 缓冲液 A 溶解粉末，用15 ml Dounce匀浆器匀浆5次。转入15 ml管中离心，0℃，2 000 r/min，30 s，弃未破碎组织。上清液在冰中放置5 min，离心，0℃，5 000 γ/min。核提取物用500 μl 缓冲液 B重悬。放置冰浴20 min。然后转入微量离心管，离心0℃，12 000 r/min，25 min。保留上清液，分装，存于-70℃，待用。
2.3 核蛋白提取物蛋白含量测定 分别取缺血再灌注大鼠肝组织及正常对照大鼠肝组织的核提取物0.1 ml按照Coomassie Brilliant Blue法进行蛋白含量测定。以BSA为标准，制作蛋白标准曲线[3]。
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2.4 凝胶滞留电泳 取核蛋白提取物3 μl，与γ-P32标记的 NF-κB 寡核苷酸探针结合，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离NF-κB探针复合物，电泳2 h，然后-70℃自显影48 h[4]。
3 结果
3.1 核蛋白提取物的蛋白含量分析 标准曲线方程 Y＝0.012X-0.375，R2＝0.976 4。见表1。核蛋白提取凝胶滞留电泳见图1。
表1 大鼠肝组织核蛋白提取物蛋白含量分析 组别
OD595nm
蛋白浓度(g/L)
正常对照
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0.07
0.21
缺血再灌注(1 h)
0.33
1.00
缺血再灌注(2 h)
0.38
1.15
3.2 凝胶滞留电泳分析核提取物成分见图1。
1.正常对照大鼠肝组织；2.缺血再灌注1h大鼠肝组织；
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图1 大鼠肝组织核蛋白提取物凝胶滞留电泳图
4 讨论
NF-κB是一种重要的核转录因子，它能影响IL-1，TNF-α，ICAM-1等细胞因子及粘附分子的基因表达[1，5]。在器官、组织的损伤及损伤修复中起重要作用。研究转录因子的首要环节就是核蛋白的提取。只有得到具有活性的核蛋白才能进一步研究核蛋白成分及生物学活性。本工作改进了常用的超声溶解提取法，利用液氮冷冻破碎技术，有效破碎、分离了大鼠肝组织细胞核，使操作省时、简便、快捷。本结果经凝胶滞留电泳分析测定，提取物中含有符合实验要求的DNA结合蛋白NF-κB。本方法适合大量肝组织样品的提取，及进一步对样品中核因子活性的分析研究。
作者简介：徐钧，男，1967年10月生，硕士，主治医师
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参考文献：
[1] Baldwin AS, Verma IM. The NF-κ B and I-κ B protein:new discoveries and insight[J].Annu Rev Immunol，1995，66：225～287.
[2] 熊成龙，吴在德. 常温肝脏缺血再灌注损伤防治的实验研究[J]. 中国病理生理杂志， 1998， 14(1)： 35～38.
[3] 李建武. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京：北京大学出版社，1994.174～176.
[4] 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京：高等教育出版社，1993.479.
[5] May MJ,Ghosh S.Signal transduction through NF-κ B[J].Immunol Today， 1998， 19：80～88.
收稿日期：2000-03-30, 百拇医药