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编号:10497138
河豚卵巢提取物对小鼠免疫功能的影响及抑瘤初探
http://www.100md.com 《中国海洋药物》 2000年第2期
     作者:余萍 刘艳如 林曦

    单位:余萍 刘艳如 林曦(福建师范大学高分子研究所生物高分子研究室,福州 350007)

    关键词:河豚卵巢提取物,吞噬作用,凝集作用,溶血作用,抑瘤作用

    中国海洋药物000208 摘要 研究发现河豚卵巢提取物具有一定的免疫功能和生物活性。动物实验结果表明:注射不同浓度的提取物可明显增加小鼠脾脏和胸腺的重量(P<0.01);提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数(P<0.01)及提高由SRBC致敏的血凝素抗体的效价(P<0.01);对小鼠外周血清溶血素的生成无明显影响(P>0.05)。由此推测该提取物对免疫系统的不同环节,作用不同。且在一定剂量下对小鼠实体瘤S180的抑制率为45.8%。

    EFFECT OF EXTRACT FROM FUGUS OVARY ON IMMUNE FUNCTION OF MICE AND EARLY STUDY OF ITS′ INHIBITIVE EFFECT FOR SARCOMA
, 百拇医药
    Yu Ping,Liu Yanru,Lin Xi

    (Biopolymer lab,Institute of Polymer Science, Fujian Teachers′ University, Fuzhou 350007)

    ABSTRACT The immunologic function and bioactivity of extract from fugu ovary has been studied.Given ip different dose of extract, the spleen and thymus weight of mice (P<0.01),phagocytic rate and phagocytic index (P<0.01)were increased significantly (P<0.01).Meanwhile the serum agglutinin antibody valence immuned by SRBC was increased significantly (P<0.01),and the serum hemolysin was no significantly (P<0.05).The results show that extract from fugu ovary has different effects on different linkage of the immunologic system.And in a certain dosage, for solid form of sarcoma S180 of mice,its′ inhibiting rate is 45.0%.
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    KEY WORDS Extract from fugus ovary,Phagocytic function,Agglutination,Hemolysis,Inhibitive effect for sarcoma

    河豚特别是东方鱼 屯属Fugu的种类在远东地区自古视为一种美味佳肴。鱼肉营养丰富,但内脏含有剧毒,系小分子非蛋白神经毒素。目前研究较多的有:“除毒河豚肝油对小鼠免疫功能增强作用的观察”[1];“除毒河豚肝油对于抗淋巴细胞血清所致小鼠模型的免疫增强作用”[2]等。而有关从河豚卵巢提取得到的有效成分对小鼠具有增强免疫功能和一定的抑瘤效果的研究未见报道。本文就此进行初步的研究和探讨。

    1 材料

    1.1 河豚卵巢提取物: 定量取冷冻的河豚巢切碎后用水浸泡,24h后过滤,反复3~4次,合并滤液,煮沸,除去凝固蛋白和结缔组织,得到提取原液。将此液通过弱酸性阳离子交换树脂和中性活性炭等柱处理,采用化学定性方法检测,收集有效馏份,调pH微碱性,析出淡红色粉末,干燥后保存。
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    1.2 小鼠: 昆明种,体重20±2g,雌雄不分,由福建省医科大学动物房提供。

    1.3 鸡红细胞CRBC (chicken red blood cell): 市售健康公鸡,抽取静脉血,按常规方法制备CRBC悬液。

    1.4 绵羊红细胞SRBC(sheep red blood cell): 由南京军区总院动物房提供健康绵羊,抽取颈静脉血,按常规方法制备SRBC悬液。

    1.5 补体: 由福建省动物调配公司提供豚鼠,抽取心血制备血清。经常规处理作为实验的补体来源。

    1.6 小鼠S180实体瘤: 由福建医学科学研究所肿瘤室提供。

    1.7 其它化学试剂:均为国产分析纯。

, 百拇医药     2 方法和结果

    2.1对小鼠腹腔巨噬细胞(M)吞噬功能的影响

    昆明种小鼠25只,将其随机分为4组,其中1组为对照组。各实验组每天皮下注射给药0.2ml/只,浓度分别为2.72、3.14、3.72mg/ml的提取物,对照组注射等体积生理盐水。于第5d末次给药后,用无菌基础牛肉培养液作诱发剂(牛肉培养液:蛋白胨1g,牛肉膏0.3g,氯化钠0.5g,加蒸馏水至100ml,15磅20min灭菌备用),腹腔注射1ml/只,24h后腹腔注射2%CRBC0.5cm/只,1h后脱颈椎致死,立即腹腔注射无菌生理盐水2ml/只,轻揉腹部,然后吸取腹腔内液体0.5ml涂片(平行两片),干燥,固定,经Giemsa-Wright染色后镜检计算吞噬百分率与吞噬指数[3]结果见表1。

    表1 对小鼠腹腔Mψ吞噬功能的影响(±s) 组 别
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    剂量

    (mg/kg×d)

    鼠数量

    (只)

    吞噬率

    (%)

    吞噬指数

    对照组

    实验组Ⅰ

    实验组Ⅱ

    实验组Ⅲ

    27.2×5

    31.4×5
, 百拇医药
    37.2×5

    7

    6

    6

    6

    39.3±13.3

    48.5±16.0*

    60.0±23.0**

    67.8±18.8***

    1.42±0.26

    1.48±0.18

    1.73±0.21*
, 百拇医药
    2.33±0.23**

    与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001

    实验结果表明,3种剂量的河豚卵巢提取物都能够提高小鼠腹腔Mψ吞噬CRBC的吞噬率及吞噬指数,尤以第Ⅲ剂量组最为显著。

    2.2 对小鼠免疫器官重量的影响

    昆明种小鼠28只,随机分为4组,其中1组为对照组,小鼠给药剂量同2.1。各组每天腹腔注射提取液0.2ml/只,对照组则注射等体积生理盐水。连续给药5d,各组动物于末次给药后24h眼眶放血处死,取胸腺、脾脏,用滤纸吸干水分后即在分析天平上称重。计算脏器系数[3]。结果见表2。

    表2 对小鼠脾、胸腺重量的影响(n=7,±s) 组 别
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    剂 量

    (mg/kg×d)

    脾重/体重

    (mg/10g)

    增加百分率

    (%)

    胸腺重/体重

    (mg/10g)

    增加百分率

    (%)

    对照组

    实验组Ⅰ

    实验组Ⅱ
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    实验组Ⅲ

    27.2×5

    31.4×5

    37.2×5

    15.6±6.8

    24.8±7.2**

    20.9±3.4

    18.4±5.6

    58.97

    33.97

    17.95

    25.7±2.5
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    29.8±4.0*

    30.6±7.5**

    28.3±4.8

    15.95

    19.07

    10.12

    与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01

    实验结果表明,实验组Ⅰ、Ⅱ脾重和胸腺重都比对照组有不同程度的提高,而实验组Ⅲ无变化。且实验组Ⅰ低剂量对脾重提高最显著,实验组Ⅱ中剂量对胸腺重量提高最显著。说明在该浓度下河豚卵巢提取物能显著增加正常小鼠的脾指数和胸腺指数。

    2.3 对致敏小鼠血清溶血素生成的影响
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    昆明种小鼠30只,体重20±2g左右,雌雄各半。分为3组,两组实验组给药剂量分别为27.2mg/kg和37.2mg/kg。连续给药8d。各组动物均于首日腹腔注射给药后第5d腹腔注射10%的SRBC 0.2ml免疫,于末次给药后24h摘眼球取血。分离血清,每组小鼠血清混合于一试管中,用生理盐水对倍稀释(1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320),然后取不同稀释度的血清1ml于试管中,对照组以生理盐水1ml,放入冰浴中,依次加入10%SRBC 0.25ml,1:10稀释的豚鼠血清1ml,37℃保温20min,冰浴终止反应。离心,取上清液1ml,加都氏液3ml(都氏液:碳酸氢钠1.0g、氰化钾0.05g、高铁氰化钾0.2g、蒸馏水加至1000ml)混匀,10min后用53W型分光光度计于波长540nm处测A540值。另设半数溶血管,取5%SRBC 0.25ml,加都氏液至4ml,离心,上清液于波长540nm处比色,该吸收值即为SRBC半数溶血时吸收值。结果以HC50表示[4]。见表3
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    表3 对小鼠血清溶血素生成的影响(n=10,±s) 组 别

    剂 量

    (mg/kg×d)

    HC50

    对照组

    实验组Ⅰ

    实验组Ⅱ

    27.2×8

    37.2×8

    43.05±14.35

    50.44±18.48*
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    54.90±18.30*

    与对照组比较:*P>0.05

    实验结果表明,河豚卵巢提取物对小鼠外周血清溶血素的生成无明显影响。

    2.4 对致敏小鼠血凝素抗体的影响

    上述小鼠血清溶血素生成实验的小鼠血清取0.2ml,置56℃水浴中灭活30min,在微量血凝测定板孔内,用生理盐水按两倍稀释法将该血清稀释成不同浓度,各孔0.05ml,然后在每孔内加1%SRBC 0.05ml(一个浓度平行两孔),在微型振荡机上振摇1min后置37℃培养,1h后观察血球凝集程度,计算抗体积数[4]。结果见表4。

    表4 对小鼠B细胞产生抗体功能的影响(n=10,±s) 组 别
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    剂 量

    (mg/kg×d)

    血凝素抗体积数

    对照组

    实验组Ⅰ

    实验组Ⅱ

    27.2×8

    37.2×8

    65.0±11.2

    81.0±16.3

    115.0±26.5**

    与对照组比较:*P<0.01 **P<0.001
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    实验结果表明,用药组血凝素抗体积数与对照组比较差异显著。说明河豚卵巢提取物具有增强小鼠B细胞产生抗体的功能。

    2.5 对小鼠实体瘤S180的抑制作用

    选择肿瘤旺盛无溃破的荷瘤小鼠眼眶放血处死,用酒精消毒,在灭菌条件下剥离肿瘤,按1:3比例加入无菌生理盐水,用组织匀浆器制成细胞悬液待用。昆明种小鼠40只,体重为20±2g,于腋下接种瘤细胞悬液0.2ml/只,接种24h后随机分组。各实验组每天腹腔注射0.2ml/只,浓度分别为2.72、3.14mg/ml的提取物。阳性对照组每天注射环磷酰胺,浓度为2.0mg/ml,对照组每天注射等体积生理盐水,连续10d。停药24h后各组动物称重,解剖剥离瘤块,称瘤重,计算抑瘤率。并分离摘取脾脏、胸腺,称重,计算每10g体重的脾脏及胸腺重量。并作统计学处理。结果见表5。

    表5 对小鼠实体瘤S180的抑制作用(n=10,±s) 组 别
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    剂 量

    (mg/kg×d)

    体重变化

    (g)

    瘤重

    (g)

    抑制率

    (%)

    胸腺指数

    脾脏指数

    (mg/10g)

    对照组

    环磷酰胺组
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    实验组Ⅰ

    实验组Ⅱ

    20×10

    27.2×10

    31.4×10

    +2.90

    +1.70

    +2.40

    +2.05

    3.0±0.83

    0.97±0.48**

    2.24±0.42
, 百拇医药
    1.65±0.35*

    67.7

    25.3

    45.0

    25.0±9.3

    18.0±3.0**

    23.0±4.6

    28.0±3.5

    25.0±7.2

    19.0±5.3**

    26.0±4.7
, 百拇医药
    25.6±9.8

    与对照组比较:*P<0.05 **P<0.01

    实验结果表明,河豚卵巢提取物在一定的剂量下对小鼠实体瘤S180有抑制作用。与对照组比较,差异有显著意义,但对荷瘤小鼠的体重、胸腺、脾脏无明显影响。环磷酰胺组抑瘤率高,却显著减轻荷瘤小鼠的脾脏、胸腺重量,并影响体重增长。

    3 讨论

    巨噬细胞作为机体抗肿瘤和杀灭入侵病原微生物的效应细胞,在抗体的免疫系统中处于特殊的地位。上述实验结果表明,小鼠经皮下注射河豚卵巢提取物,其腹腔内巨噬细胞的吞噬功能有明显增强。给药组和对照组比较,吞噬百分率与吞噬指数均有显著差异,既提高有吞噬能力的巨噬细胞数,也提高单个巨噬细胞吞噬CRBC的数目。且在药物毒性剂量以内,提取物剂量愈大,其效果愈显著。同时,河豚卵巢提取物对小鼠的免疫器官也产生影响,但不随剂量的增加而相应增加。以低、中剂量效果较显著,说明在一定剂量范围内,河豚卵巢提取物具有提高小鼠的非特异性免疫的功能。
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    参与特异性体液免疫的抗体有多种类型免疫球蛋白,皆由B淋巴细胞接受抗原信息后分化增殖为浆细胞所产生的。小鼠血凝素抗体测定结果表明,给药组与对照组抗体积数比较,有较明显的差异(P<0.001)。表明河豚卵巢提取物对小鼠参与特异性体液免疫的抗体,即脾细胞内B淋巴细胞产生IgG能力有增强作用。但同时做的血清溶血素生成实验,效果却不显著。一般在抗原刺激下,B细胞和T细胞的免疫应答,需要TH细胞(helper T cell)和TS细胞(suppressor T cell)的共同调节以适应机体的需要。河豚卵巢提取物含有何种有效成分以及如何作用于TH细胞和TS细胞需进一步研究。

    河豚卵巢提取物对小鼠实体瘤S180在一定浓度范围内有一定的抑制作用,且对免疫器官无明显影响,说明继续深入研究对其它肿瘤是否抑制及抑制机制是什么有一定的意义。

    福建省科委资助项目(编号:96-2-34)

    参考文献

    [1]舒萍华,谭剑萍,卫寄英,等.除毒河豚肝油对小鼠免疫功能增强作用的观察.海洋药物1983;8(4):194

    [2]舒萍华,卫寄英,邹德生,等.除毒河豚肝油对于抗淋巴细胞血清所致小鼠模型的免疫增强作用.海洋药物1985;15(3):7

    [3]湖南医学院主编:药理学实验指导.湖南医学院印刷1979

    [4]徐淑云,卞如濂,陈修主编.药理实验方法学.北京人民卫生出版社,1982, 百拇医药