66例氨基糖甙类抗生素致聋患者的线粒体DNA1555位突变检测
作者：陈观明 傅四清 滕云 葛新 王晓珊 胡晓峰 崔永华
单位：陈观明 葛新 王晓珊 崔永华(同济医科大学附属同济医院耳鼻喉科， 武汉 430030)；傅四清 滕云 胡晓峰(同济医科大学医学遗传研究室， 武汉 430030)
关键词：氨基糖甙类抗生素致聋；线粒体DNA；突变
同济医科大学学报000221 摘要：目前认为mtDNAA1555G突变与氨基糖甙类抗生素 致聋(AAID)有关。通过调查采集了66例AAID病例，采外周血作PCR-RFLP分析，对照 组为30例正常人，分析mtDNAA1555G突变在AAID中的作用。研究发现：66例AAID患者中，14 例具有A1555G突变，而其余的52例和对照组均无此突变。这表明mtDNAA1555G突变是人体对 氨基糖甙类抗生素遗传易感性的分子基础之一，基因和环境因素的相互作用可能在AAID的发 生中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号：R978.1， R329.2， R394
Detection of Mitochondrial DNA Mutatio n at nt1555 in 66 Patients with Aminoglycoside Antibiotic-induced Deafness
Chen Guanming, Fu Siqing, Teng Yun et al
Department of Otolaryngology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：Sixty cases of aminoglycoside antibiotics-induced dea fness (AAID) were selected. The peripheral blood was taken from the patients to be subjected to PCR-RFLP assay. Thirty normal subjectes served as control group . The role of mtDNAA1555G mutation in the pathogenesis of AAID was studied. The A1555G mutation was found in 14 deaf patients but not in the remaining 52 patie nts or in the 30 control subjects. These data indicate that the A1555G mutation is one of the molecular basis for human hypersensitivity to aminoglycoside antib iotics. It is likely that the interaction of genes (nuclear and mitochondria) wi th environmental factor plays an important role in the development of deafness.
, 百拇医药
Key words：aminoglycoside antibiotics-induced deafness; mitoch ondrial DNA; mutation
1993年Prezant等[1]在一个阿拉伯-以色列家系中首先发现了非综合征性耳聋患者 中mtDNA12SrRNA 基因上核苷酸第1555A→G突变，Usami等[2]对表现为氨基糖甙类 抗生素中毒性听力损失的5个日本家庭进行了遗传学和临床观察，发现受检的32人中有28人 存在核苷酸1555位的mtDNA突变。国内张丽珊等[3]、袁慧军等[4]报告了 此类耳聋的遗传学分析。我们通过调查，采集了66例氨基糖甙类抗生素致聋(AAID)病例进行 mtDNA1555位突变检测。
1 对象与方法
1.1 对象
, http://www.100md.com
我们对武汉市一聋和襄樊市聋校学生进行调查、采集病史，包括耳聋的发病年龄、如何发现 、耳聋的诱因、程度、进展情况，用药史，既往有无腮腺炎、脑膜炎、麻疹、猩红热等病史 ，有无近亲婚配史。对确诊为氨基糖甙类抗生素致聋者66例采外周血标本作分析，同时采30 例正常人外周血作对照。
1.2 DNA提取
按常规方法从病例组、对照组外周血中提取细胞总DNA(内含线粒体DNA)。
1.3 引物及PCR扩增
(H链)5′-GCTAAACCCCTACGCATTTAT
ATAG-3′(L链)5′-GCTTTGTGTTAAGCTAC
ACTCT GG-3′由上海生工公司合成。50 μl反应体积中，DNA样品0.5 μg，10×buffer 5 μl，d NTP 200 μmol/L，TaqDNA聚合酶2 U，引物各25 pmol。PCR反应参数为94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s循环35次，72 ℃延伸10 min，产物为100 bp(1525～1 624)，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
, 百拇医药
1.4 Bsm Al酶切
取10～15 μl扩增产物，在20 μl总反应体积中加12 U BsmAl酶，37 ℃消化过夜。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
用60 g/L聚丙烯酰胺凝胶和1×TBE电泳缓冲液，每孔加样5～6 μl，置于4 ℃，250 V恒定电 压持续4 h左右。
1.6 硝酸银染色
小心取出聚丙烯酰胺凝胶，在固定液(950 ml/L乙醇55 ml+冰乙酸2.5 ml+蒸馏水450 ml) 中固定6～8 min，用水冲洗。重复固定一次后，在2 g/L AgNO3溶液中染色10 min左右， 冲洗2～3次。然后在显色液(NaOH 7.5 g+甲醛5.4 ml+蒸馏水500 ml)中显色，见带纹清晰 时即用终止液(3.75 g NaHCO3+蒸馏水500 ml)终止显色。小心取出凝胶放至透明玻璃纸 上，在白色或日光灯背景下显示棕黑色条带。照相或干胶后长期保存，供分析。
, 百拇医药
2 结果
外周血细胞mtDNA 100 bp PCR扩增片段经Bsm Al酶切，在66例患者中，有14例酶切后仍为10 0 bp一条带，其余52例及对照组酶切后均产生80 bp和20 bp两条带(图1)。根据Hutchin等 [5]报道，mtDNA核苷酸A1555G突变导致Bsm Al酶切位点消失，说明在66例患者中有 14例发生突变，而其余52例和正常对照均无此突变。
图1 两例AAID患者的PCR-RFLP检测结果
1.pBR322DNA/HaeⅢ分子量标准；
2，5.正常对照；3，4.AAID患者
3 讨论
, http://www.100md.com
通过对66例AAID患者mtDNA1555位突变的检测，我们发现其中有14例存在A1555G突变，约占21%。据报道上海地区氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)诱导的耳聋中mtDNA1555位突变至少占30%，而美国AAID患者中，只发现 有15%左右存在mtDNA1555位突变[6]。这种差异可能是美国只有在严重的住院感染 时才使用AmAn的缘故。然而，为何本研究中其余的52例AAID患者不具有该突变，而国外也 报道有该突变而听力正常的个体呢[2]？这说明AAID的发生除与mtDNA突变有关外， 还有其他因素：①核基因。必须注意到氧化磷酸化过程中的5个酶复合物是由mtDNA和核DNA 共同编码的，而且mtDNA的复制转录和翻译过程中所需要的几十种酶均由核DNA编码，因此线 粒体突变的表达受到核基因的一定限制。②环境因素。AmAn的作用只是触发了mtDNA1555突 变的表现，也许存在其它尚未认识的环境因素也能影响该突变的表达。因此AAID的发生可能 是环境因素、线粒体DNA与核DNA三者共同作用的结果。
, http://www.100md.com
空间结构分析和细胞生物学研究已证实了mtDNA1555突变在AAID病因上的作用[7]。 A1555G突变的检出为临床医生预测AmAn个体易感性提供了可能性，该突变阳性个体及其母系 家属应避免使用AmAn。我们的研究表明：mtDNA1555G突变只是导致个体对AmAn遗传易感性的 分子基础之一。因此对AAID遗传易感性的预测单独进行A1555G突变的检测是不够的，还必须 与mtDNA其它突变位点的检测结合起来，由于AmAn与mtDNA的结合位点在12S和16SrRNA基因上 ，我们拟对其中两例AAID患者进行mtDNA12S和16S rRNA基因全序列分析，如能发现新的突变 位点，将是对AAID病因学研究的丰富，也可为AmAn易感致聋的预防和基因诊断提供理论依据 。
(感谢本校医学遗传研究室刘希贤教授对本工作的指导!)
陈观明，男，1962年生，主治医师
参考文献
, http://www.100md.com
1，Prezant T R,Agapian J V,Bohlman M S et al.Mitochondrial ribosoma l RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafn ess.Nat Get,1993,4:289
2，Usami S,Abe S,Kasai M et al. Genetic and clinic features of sens orineural hearing loss associated with the 1555 mitochondrial mutation.Laryngosc ope,1997,107:483
3，张丽珊，张志平，周晓雷等. 三例氨基糖甙类抗生素致聋患者的线粒体DNA 测序分析. 遗传，1996，18：(6)：3
, http://www.100md.com 4，袁慧军，姜泗长，杨伟炎等. 氨基糖甙类抗生素致聋家系线粒体DNA1555G点 突变分析. 中华耳鼻喉科杂志，1998，33(2)：67
5，Hutchin T,Haworth L,Higashi K et al.A molecular basis for human hypersensitivity to aminoglycoside antibiotics.Nucleic Acids Res,1993,21:417 4
6，王为未. 线粒体DNA突变和听力丧失. 国外医学遗传学分册，1999，22(2)： 69
7，Inoue K,Takai D,Soejima A et al. Mutation mtDNA at 1555 A to G i n 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondial translation to streptomy cin can be co-transferred to rho O Hela cells. Biochem Biophys Res Commun,1996, 223:496
(收稿：1999-05-28), 百拇医药
单位：陈观明 葛新 王晓珊 崔永华(同济医科大学附属同济医院耳鼻喉科， 武汉 430030)；傅四清 滕云 胡晓峰(同济医科大学医学遗传研究室， 武汉 430030)
关键词：氨基糖甙类抗生素致聋；线粒体DNA；突变
同济医科大学学报000221 摘要：目前认为mtDNAA1555G突变与氨基糖甙类抗生素 致聋(AAID)有关。通过调查采集了66例AAID病例，采外周血作PCR-RFLP分析，对照 组为30例正常人，分析mtDNAA1555G突变在AAID中的作用。研究发现：66例AAID患者中，14 例具有A1555G突变，而其余的52例和对照组均无此突变。这表明mtDNAA1555G突变是人体对 氨基糖甙类抗生素遗传易感性的分子基础之一，基因和环境因素的相互作用可能在AAID的发 生中起重要作用。
, 百拇医药
中图法分类号：R978.1， R329.2， R394
Detection of Mitochondrial DNA Mutatio n at nt1555 in 66 Patients with Aminoglycoside Antibiotic-induced Deafness
Chen Guanming, Fu Siqing, Teng Yun et al
Department of Otolaryngology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：Sixty cases of aminoglycoside antibiotics-induced dea fness (AAID) were selected. The peripheral blood was taken from the patients to be subjected to PCR-RFLP assay. Thirty normal subjectes served as control group . The role of mtDNAA1555G mutation in the pathogenesis of AAID was studied. The A1555G mutation was found in 14 deaf patients but not in the remaining 52 patie nts or in the 30 control subjects. These data indicate that the A1555G mutation is one of the molecular basis for human hypersensitivity to aminoglycoside antib iotics. It is likely that the interaction of genes (nuclear and mitochondria) wi th environmental factor plays an important role in the development of deafness.
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Key words：aminoglycoside antibiotics-induced deafness; mitoch ondrial DNA; mutation
1993年Prezant等[1]在一个阿拉伯-以色列家系中首先发现了非综合征性耳聋患者 中mtDNA12SrRNA 基因上核苷酸第1555A→G突变，Usami等[2]对表现为氨基糖甙类 抗生素中毒性听力损失的5个日本家庭进行了遗传学和临床观察，发现受检的32人中有28人 存在核苷酸1555位的mtDNA突变。国内张丽珊等[3]、袁慧军等[4]报告了 此类耳聋的遗传学分析。我们通过调查，采集了66例氨基糖甙类抗生素致聋(AAID)病例进行 mtDNA1555位突变检测。
1 对象与方法
1.1 对象
, http://www.100md.com
我们对武汉市一聋和襄樊市聋校学生进行调查、采集病史，包括耳聋的发病年龄、如何发现 、耳聋的诱因、程度、进展情况，用药史，既往有无腮腺炎、脑膜炎、麻疹、猩红热等病史 ，有无近亲婚配史。对确诊为氨基糖甙类抗生素致聋者66例采外周血标本作分析，同时采30 例正常人外周血作对照。
1.2 DNA提取
按常规方法从病例组、对照组外周血中提取细胞总DNA(内含线粒体DNA)。
1.3 引物及PCR扩增
(H链)5′-GCTAAACCCCTACGCATTTAT
ATAG-3′(L链)5′-GCTTTGTGTTAAGCTAC
ACTCT GG-3′由上海生工公司合成。50 μl反应体积中，DNA样品0.5 μg，10×buffer 5 μl，d NTP 200 μmol/L，TaqDNA聚合酶2 U，引物各25 pmol。PCR反应参数为94 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s循环35次，72 ℃延伸10 min，产物为100 bp(1525～1 624)，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
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1.4 Bsm Al酶切
取10～15 μl扩增产物，在20 μl总反应体积中加12 U BsmAl酶，37 ℃消化过夜。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
用60 g/L聚丙烯酰胺凝胶和1×TBE电泳缓冲液，每孔加样5～6 μl，置于4 ℃，250 V恒定电 压持续4 h左右。
1.6 硝酸银染色
小心取出聚丙烯酰胺凝胶，在固定液(950 ml/L乙醇55 ml+冰乙酸2.5 ml+蒸馏水450 ml) 中固定6～8 min，用水冲洗。重复固定一次后，在2 g/L AgNO3溶液中染色10 min左右， 冲洗2～3次。然后在显色液(NaOH 7.5 g+甲醛5.4 ml+蒸馏水500 ml)中显色，见带纹清晰 时即用终止液(3.75 g NaHCO3+蒸馏水500 ml)终止显色。小心取出凝胶放至透明玻璃纸 上，在白色或日光灯背景下显示棕黑色条带。照相或干胶后长期保存，供分析。
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2 结果
外周血细胞mtDNA 100 bp PCR扩增片段经Bsm Al酶切，在66例患者中，有14例酶切后仍为10 0 bp一条带，其余52例及对照组酶切后均产生80 bp和20 bp两条带(图1)。根据Hutchin等 [5]报道，mtDNA核苷酸A1555G突变导致Bsm Al酶切位点消失，说明在66例患者中有 14例发生突变，而其余52例和正常对照均无此突变。
图1 两例AAID患者的PCR-RFLP检测结果
1.pBR322DNA/HaeⅢ分子量标准；
2，5.正常对照；3，4.AAID患者
3 讨论
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通过对66例AAID患者mtDNA1555位突变的检测，我们发现其中有14例存在A1555G突变，约占21%。据报道上海地区氨基糖甙类抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)诱导的耳聋中mtDNA1555位突变至少占30%，而美国AAID患者中，只发现 有15%左右存在mtDNA1555位突变[6]。这种差异可能是美国只有在严重的住院感染 时才使用AmAn的缘故。然而，为何本研究中其余的52例AAID患者不具有该突变，而国外也 报道有该突变而听力正常的个体呢[2]？这说明AAID的发生除与mtDNA突变有关外， 还有其他因素：①核基因。必须注意到氧化磷酸化过程中的5个酶复合物是由mtDNA和核DNA 共同编码的，而且mtDNA的复制转录和翻译过程中所需要的几十种酶均由核DNA编码，因此线 粒体突变的表达受到核基因的一定限制。②环境因素。AmAn的作用只是触发了mtDNA1555突 变的表现，也许存在其它尚未认识的环境因素也能影响该突变的表达。因此AAID的发生可能 是环境因素、线粒体DNA与核DNA三者共同作用的结果。
, http://www.100md.com
空间结构分析和细胞生物学研究已证实了mtDNA1555突变在AAID病因上的作用[7]。 A1555G突变的检出为临床医生预测AmAn个体易感性提供了可能性，该突变阳性个体及其母系 家属应避免使用AmAn。我们的研究表明：mtDNA1555G突变只是导致个体对AmAn遗传易感性的 分子基础之一。因此对AAID遗传易感性的预测单独进行A1555G突变的检测是不够的，还必须 与mtDNA其它突变位点的检测结合起来，由于AmAn与mtDNA的结合位点在12S和16SrRNA基因上 ，我们拟对其中两例AAID患者进行mtDNA12S和16S rRNA基因全序列分析，如能发现新的突变 位点，将是对AAID病因学研究的丰富，也可为AmAn易感致聋的预防和基因诊断提供理论依据 。
(感谢本校医学遗传研究室刘希贤教授对本工作的指导!)
陈观明，男，1962年生，主治医师
参考文献
, http://www.100md.com
1，Prezant T R,Agapian J V,Bohlman M S et al.Mitochondrial ribosoma l RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafn ess.Nat Get,1993,4:289
2，Usami S,Abe S,Kasai M et al. Genetic and clinic features of sens orineural hearing loss associated with the 1555 mitochondrial mutation.Laryngosc ope,1997,107:483
3，张丽珊，张志平，周晓雷等. 三例氨基糖甙类抗生素致聋患者的线粒体DNA 测序分析. 遗传，1996，18：(6)：3
, http://www.100md.com 4，袁慧军，姜泗长，杨伟炎等. 氨基糖甙类抗生素致聋家系线粒体DNA1555G点 突变分析. 中华耳鼻喉科杂志，1998，33(2)：67
5，Hutchin T,Haworth L,Higashi K et al.A molecular basis for human hypersensitivity to aminoglycoside antibiotics.Nucleic Acids Res,1993,21:417 4
6，王为未. 线粒体DNA突变和听力丧失. 国外医学遗传学分册，1999，22(2)： 69
7，Inoue K,Takai D,Soejima A et al. Mutation mtDNA at 1555 A to G i n 12S rRNA gene and hypersusceptibility of mitochondial translation to streptomy cin can be co-transferred to rho O Hela cells. Biochem Biophys Res Commun,1996, 223:496
(收稿：1999-05-28), 百拇医药