猪神经元胞体和轴突神经细丝组分的初步分析
作者：钱振宇 周迎春 李一鸣 邓洁 王建枝
单位：钱振宇 周迎春 李一鸣(同济医科大学九三级七年制， 武汉 430030)；邓洁 王建枝(同济医科大学基础医学院病理生理学教研室， 武汉 430030)
关键词：神经细丝；亚基；磷酸化
同济医科大学学报000208 摘要：从猪神经元胞体和轴突中分离提取了神经细丝 (NF)，对它们各自进行了电泳以分析其亚基构成并进行磷酸化程度定量分析，结果表明NF 分子由大中小三种亚基构成，胞体和轴突两种NF的磷酸化程度存在显著性差异。这一方法将 对阐明某些神经元退行性变疾病的机理提供有用的线索。
中图法分类号：R322.85, R741
Preliminary Analysis of Porcine Cytostic and Axonal Neurofilaments
, http://www.100md.com
Qian Zhenyu, Zhou Yingchun, Li Yiming et al
(Seven-Year Class of Grade 93, Tongji Medical Universi ty, Wuhan 430030)
Abstract：Both neurofilaments (NF) isolated from the porcine neural cell bodies and axons were subjected to the analysis on their constitutional subunits by usi ng electrophoresis and the quantified phosphate content respectively. The result showed that NF consisted of three subunits with three different molecular weigh t. There was significant difference in phosphate contents between the two NF. Th e method may offer helpful clues to clarify some degeneration diseases of the ne ural system.
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Key words：neurofilament; subunit; phosphate content
神经细丝(NF)是一种中间丝，参与构成细胞骨架[1～2]。其分子由三种亚基构成，分子量分别是68 kD、110 kD和140 kD，称为低分子量神经细丝(NF-L )、中分子量 神经细丝(NF-M )、高分子量神经细丝(NF-H)，由位于C端的尾区决定它们的不同，并 且其N端的头区和C端的尾区是磷酸化的位点[2]。为探讨神经元退行性变疾 病与神经细丝亚基组成和磷酸化程度的关系,我们分别研究了正常猪胞体和轴突两 种NF的亚基构成和磷酸化程度。
1 材料与方法
1.1 材料
选取健康成年家猪5只，体重和雌雄不拘，颈动脉放血处死后快速取其新鲜大脑共5个和 脊髓共5条，装入容器置于冰水混合物中保存。 NF提取所用试剂购自美国Sigma公司，其余 的为国产分析纯试剂。
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1.2 NF提取
小心剥离大脑表面的灰质，按1∶1重量比加入解聚缓冲液，制成匀浆，依Iqbal[1 ]的体外组装法提取神经元胞体NF；脊髓也按1∶1重量比加入轴突漂浮缓冲夜，制成匀浆 ，依Iqbal[1]轴突漂浮法提取轴突NF，以上过程都控制在0～4℃的环境中进行。 所得的样品各分成10份，都收集保存在解聚缓冲液中。全过程未使用含磷试剂，并且每一步 都排除了可能的磷污染。
1.3 NF亚基的分析
采用SDS-PAG垂直板电泳[3]，分离胶交联浓度为10%，pH=8.8，浓缩胶交联 度为3%，pH =6.8，以考马斯亮蓝作蛋白质染色剂，采用牛血清白蛋白作分子量标准。
1.4 磷酸化的测定
, 百拇医药
样品蛋白质的磷酸化程度以每克样品蛋白质中所含多少克磷元素表示。
1.5 样品蛋白质含量的测定
将牛血清白蛋白配制成不同浓度的溶液，按改良的Lowry 法[4]加入试剂反应生成 有颜色的化合物，进而确定蛋白质浓度-吸光度关系曲线。蛋白质浓度以μg / μl 表示。 将所得的10份样品再各自等分成两组，其中一组适当稀释再于上述反应后测定其吸光度。
1.6 样品磷酸化含量的测定
配置不同浓度的KH2PO4溶液，换算成μg 磷/250 μl，按Hess法[5]加入试剂 反应生成有色化合物，进而确定磷酸盐浓度-吸光度关系曲线。蛋白质中所含磷以有机磷形 式存在，须将所得样品高温灰化后方可按上法测得磷酸盐浓度。此时将所得样品的第二组高 温灰化，制成无机磷溶液测定其吸光度。磷酸化程度将以μg磷/μg蛋白质表示。
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2 结果
样品电泳结果如图1，轴突NF样品电泳结果为条带A、B，分子中含NF-L、NF-M、NF-H 3 种亚基，还含有分子量约为50 kD的杂质蛋白质；胞体则为条带C，分子中仅含NF-L亚基， 未发现杂质蛋白质。磷酸化程度测定中，吸光度-磷酸盐浓度和吸光度-蛋白质浓度在0～4 .0 μg/μl范围呈线性关系。经回归分析所得直线方程前者为y=0.453 664x-0.001 29，后者为y=0.215 5x+0.005375，两种NF磷元素含量如表1，经统计学分析后表明 两种NF磷酸化程度存在显著性差异，且轴突NF>胞体NF。
图1 NF样品电泳图谱
表1 两种NF样品蛋白质浓度和样品磷酸化后磷酸OD/蛋白质浓度之值 样 品
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样品蛋白质含量(C)
OD磷酸盐/C
胞体NF
0.35±0.25
0.0159±0.0196
轴突NF
2.43±1.25
0.0592±0.0245
3 讨论
神经细丝分子由上述三种亚基构成已得到证实，而且国外有通过免疫组织化学研究关于两种NF磷酸化程度不同的报道[6]，这里我们则对分离所得的NF样品的磷酸化程度进行 了初步定量分析，进一步证实该报道。经转基因动物研究表明，NF对神经元轴突的形成及其 稳定性的维持起着重要的作用，尾区磷酸化则影响该作用[7～8]。质谱分 析结果已表明： 正常个体神经元胞体NF呈低磷酸化状态，而轴突则呈高磷酸化状态，但在某些神经元退行性 变疾病状态下，如老年性痴呆，胞体NF也被异常过度磷酸化[6]，本研究已得出通 过化学 方法定量地测定两种NF总体磷酸化程度是可行的，因此对NF各区段磷酸化程度作出定量分析 也认为可行，并可进一步对诸如各区段磷酸化程度与其构象和功能之间的关系等问题作定量 研究，为阐明这些神经元退行性变疾病的机理提供线索。但实验方法还有待进一步改进，如 从数据来看，样品磷酸化测定，尤其胞体的结果，离散度较大，说明重复性不理想。究其原 因，可能是测量仪器精密度不够，不能满足微量样品，也可能是操作过程中分组、灰化、配 制微量溶液等误差所致。另外，样品中含杂质蛋白质，虽然电泳图谱表明其在两样品中是一 致的，因而不影响本次磷酸化测定的总体结果，但会影响以后更精密的测定，现初步考虑可 用色谱法纯化。
, http://www.100md.com
钱振宇，男，1974 年生，九三级 七年制学生
参考文献
1，Iqbal K, Zaidi T, Thompson C H et al. Alzheimer paired helical filament; Bulk isolation ,solubility and protein composition. Acta Neuropathol, 1984,62:167
2，Harison C. Pant Neurofilament Phosphorylation. Biochem Cell Bio,1995 , 73: 575
3，Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of ba cteriophag T4. Nature, 1970,227:680
, 百拇医药
4，Bensadown A, Weinstein D. Assay of proteins in the presence of i nterfering materials. Analy Biochem,1976,70:606
5，Hess H H M, Derr J E. Assay of in organic and organic phosphorous in the 0.1～5 nmole range. Analy Biochem, 1975,83:607
6，Sternberg N H, Sternberrrg L A, Ulrich F. Aberrant neurofilament pho sphoration in Alzheimer Disease. Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:4274
7，Roy Quinlan，Chris Hutchson，Birt Git Lane. Intermediate filament pr otein. Protein Profile, 1994,1: 787
8，Harish C. Pant and veranna neurofilament phoaphorylation. Biochem C ell Biol, 1995, 73: 586
(收稿：1999-03-05), http://www.100md.com
单位：钱振宇 周迎春 李一鸣(同济医科大学九三级七年制， 武汉 430030)；邓洁 王建枝(同济医科大学基础医学院病理生理学教研室， 武汉 430030)
关键词：神经细丝；亚基；磷酸化
同济医科大学学报000208 摘要：从猪神经元胞体和轴突中分离提取了神经细丝 (NF)，对它们各自进行了电泳以分析其亚基构成并进行磷酸化程度定量分析，结果表明NF 分子由大中小三种亚基构成，胞体和轴突两种NF的磷酸化程度存在显著性差异。这一方法将 对阐明某些神经元退行性变疾病的机理提供有用的线索。
中图法分类号：R322.85, R741
Preliminary Analysis of Porcine Cytostic and Axonal Neurofilaments
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Qian Zhenyu, Zhou Yingchun, Li Yiming et al
(Seven-Year Class of Grade 93, Tongji Medical Universi ty, Wuhan 430030)
Abstract：Both neurofilaments (NF) isolated from the porcine neural cell bodies and axons were subjected to the analysis on their constitutional subunits by usi ng electrophoresis and the quantified phosphate content respectively. The result showed that NF consisted of three subunits with three different molecular weigh t. There was significant difference in phosphate contents between the two NF. Th e method may offer helpful clues to clarify some degeneration diseases of the ne ural system.
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Key words：neurofilament; subunit; phosphate content
神经细丝(NF)是一种中间丝，参与构成细胞骨架[1～2]。其分子由三种亚基构成，分子量分别是68 kD、110 kD和140 kD，称为低分子量神经细丝(NF-L )、中分子量 神经细丝(NF-M )、高分子量神经细丝(NF-H)，由位于C端的尾区决定它们的不同，并 且其N端的头区和C端的尾区是磷酸化的位点[2]。为探讨神经元退行性变疾 病与神经细丝亚基组成和磷酸化程度的关系,我们分别研究了正常猪胞体和轴突两 种NF的亚基构成和磷酸化程度。
1 材料与方法
1.1 材料
选取健康成年家猪5只，体重和雌雄不拘，颈动脉放血处死后快速取其新鲜大脑共5个和 脊髓共5条，装入容器置于冰水混合物中保存。 NF提取所用试剂购自美国Sigma公司，其余 的为国产分析纯试剂。
, http://www.100md.com
1.2 NF提取
小心剥离大脑表面的灰质，按1∶1重量比加入解聚缓冲液，制成匀浆，依Iqbal[1 ]的体外组装法提取神经元胞体NF；脊髓也按1∶1重量比加入轴突漂浮缓冲夜，制成匀浆 ，依Iqbal[1]轴突漂浮法提取轴突NF，以上过程都控制在0～4℃的环境中进行。 所得的样品各分成10份，都收集保存在解聚缓冲液中。全过程未使用含磷试剂，并且每一步 都排除了可能的磷污染。
1.3 NF亚基的分析
采用SDS-PAG垂直板电泳[3]，分离胶交联浓度为10%，pH=8.8，浓缩胶交联 度为3%，pH =6.8，以考马斯亮蓝作蛋白质染色剂，采用牛血清白蛋白作分子量标准。
1.4 磷酸化的测定
, 百拇医药
样品蛋白质的磷酸化程度以每克样品蛋白质中所含多少克磷元素表示。
1.5 样品蛋白质含量的测定
将牛血清白蛋白配制成不同浓度的溶液，按改良的Lowry 法[4]加入试剂反应生成 有颜色的化合物，进而确定蛋白质浓度-吸光度关系曲线。蛋白质浓度以μg / μl 表示。 将所得的10份样品再各自等分成两组，其中一组适当稀释再于上述反应后测定其吸光度。
1.6 样品磷酸化含量的测定
配置不同浓度的KH2PO4溶液，换算成μg 磷/250 μl，按Hess法[5]加入试剂 反应生成有色化合物，进而确定磷酸盐浓度-吸光度关系曲线。蛋白质中所含磷以有机磷形 式存在，须将所得样品高温灰化后方可按上法测得磷酸盐浓度。此时将所得样品的第二组高 温灰化，制成无机磷溶液测定其吸光度。磷酸化程度将以μg磷/μg蛋白质表示。
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2 结果
样品电泳结果如图1，轴突NF样品电泳结果为条带A、B，分子中含NF-L、NF-M、NF-H 3 种亚基，还含有分子量约为50 kD的杂质蛋白质；胞体则为条带C，分子中仅含NF-L亚基， 未发现杂质蛋白质。磷酸化程度测定中，吸光度-磷酸盐浓度和吸光度-蛋白质浓度在0～4 .0 μg/μl范围呈线性关系。经回归分析所得直线方程前者为y=0.453 664x-0.001 29，后者为y=0.215 5x+0.005375，两种NF磷元素含量如表1，经统计学分析后表明 两种NF磷酸化程度存在显著性差异，且轴突NF>胞体NF。
图1 NF样品电泳图谱
表1 两种NF样品蛋白质浓度和样品磷酸化后磷酸OD/蛋白质浓度之值 样 品
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样品蛋白质含量(C)
OD磷酸盐/C
胞体NF
0.35±0.25
0.0159±0.0196
轴突NF
2.43±1.25
0.0592±0.0245
3 讨论
神经细丝分子由上述三种亚基构成已得到证实，而且国外有通过免疫组织化学研究关于两种NF磷酸化程度不同的报道[6]，这里我们则对分离所得的NF样品的磷酸化程度进行 了初步定量分析，进一步证实该报道。经转基因动物研究表明，NF对神经元轴突的形成及其 稳定性的维持起着重要的作用，尾区磷酸化则影响该作用[7～8]。质谱分 析结果已表明： 正常个体神经元胞体NF呈低磷酸化状态，而轴突则呈高磷酸化状态，但在某些神经元退行性 变疾病状态下，如老年性痴呆，胞体NF也被异常过度磷酸化[6]，本研究已得出通 过化学 方法定量地测定两种NF总体磷酸化程度是可行的，因此对NF各区段磷酸化程度作出定量分析 也认为可行，并可进一步对诸如各区段磷酸化程度与其构象和功能之间的关系等问题作定量 研究，为阐明这些神经元退行性变疾病的机理提供线索。但实验方法还有待进一步改进，如 从数据来看，样品磷酸化测定，尤其胞体的结果，离散度较大，说明重复性不理想。究其原 因，可能是测量仪器精密度不够，不能满足微量样品，也可能是操作过程中分组、灰化、配 制微量溶液等误差所致。另外，样品中含杂质蛋白质，虽然电泳图谱表明其在两样品中是一 致的，因而不影响本次磷酸化测定的总体结果，但会影响以后更精密的测定，现初步考虑可 用色谱法纯化。
, http://www.100md.com
钱振宇，男，1974 年生，九三级 七年制学生
参考文献
1，Iqbal K, Zaidi T, Thompson C H et al. Alzheimer paired helical filament; Bulk isolation ,solubility and protein composition. Acta Neuropathol, 1984,62:167
2，Harison C. Pant Neurofilament Phosphorylation. Biochem Cell Bio,1995 , 73: 575
3，Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of ba cteriophag T4. Nature, 1970,227:680
, 百拇医药
4，Bensadown A, Weinstein D. Assay of proteins in the presence of i nterfering materials. Analy Biochem,1976,70:606
5，Hess H H M, Derr J E. Assay of in organic and organic phosphorous in the 0.1～5 nmole range. Analy Biochem, 1975,83:607
6，Sternberg N H, Sternberrrg L A, Ulrich F. Aberrant neurofilament pho sphoration in Alzheimer Disease. Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:4274
7，Roy Quinlan，Chris Hutchson，Birt Git Lane. Intermediate filament pr otein. Protein Profile, 1994,1: 787
8，Harish C. Pant and veranna neurofilament phoaphorylation. Biochem C ell Biol, 1995, 73: 586
(收稿：1999-03-05), http://www.100md.com