SFE-HPLC测定银杏叶粗提物中黄酮类化合物的含量
作者：佳红 柳正良
单位：第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433
关键词：超临界流体萃取法；银杏叶粗提物；黄酮类化合物；HPLC法
中草药000212摘 要 采用超临界流体萃取法提取银杏叶粗提物中总黄酮苷，确定最佳萃取条件为：压力41 364 Pa；温度60 ℃；静态萃取时间4 min；动态萃取体积4 mL；改性剂加入量0.2 mL乙醇；用HPLC测定含量，结果表明：本法简便快速，萃取完全，为银杏叶粗提物的分离、纯化、测定提供了一种有效可靠的方法。
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的叶子，经现代药理和临床研究表明[1]，银杏叶提取物可软化血管，增加冠状动脉血流量，对心绞痛，脑血管疾病具有显著疗效，并广泛用于临床。而黄酮类化合物为其主要有效成分之一，其制剂质量通过测定黄酮含量来控制[2，3]。传统的提取方法均采用有机溶剂提取，费时且残留有害溶剂，超临界流体萃取(SFE)因其特有的高选择性、高效性及低毒害的优点，在中草药的提取方面具有广泛应用[4～6]。我们采用SFE技术萃取银杏叶粗提物中的黄酮类成分，用HPLC测定含量，提取效率高，杂质少，具有一定的优点。
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1 试剂与仪器
1.1 仪器：ISCO 100DX,100DM泵，SFX2-10M超临界流体萃取仪(美国ISCO公司)，Waters高效液相色谱仪(美国Waters),NEC powermate 433电子计算机(日本NEC公司)
1.2 试剂：槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所)，山柰素对照品(Sigma公司)，CO2(99%)(上海酒精总厂)，甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：μ BondapakTM C18(300 mm×3.9 mm，Waters)；流动相：甲醇-0.4%磷酸(60∶40)；流速：1 mL/min；检测波长：266 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。
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2.2 对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品12.70 mg，山柰素对照品10.01 mg，分别加甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，即为对照溶液。
2.3 供试品溶液的制备：精密称取银杏叶粗提物20 mg，装入萃取池中，加入0.2 mL乙醇，在41 364 Pa、温度60 ℃下，静态萃取4 min，动态萃取4 mL，以乙醇为接收液，萃取完毕定容至10 mL，然后将萃取液置于50 mL烧瓶中，加入1.5 mL 25%盐酸溶液，混匀，水浴回流30 min，迅速冷却至室温，然后转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.4 标准曲线的绘制：精取槲皮素对照品溶液(1.270 mg/mL)2.5，5，10，20，40 μL，置于1 mL容量瓶中，依次加入山柰素对照品溶液(1.000 mg/mL)2.5，5，10，20，40 μL，加甲醇至刻度，混匀后分别进样测定，以峰面积(A)对进样浓度(C)进行回归，回归方程为：A槲皮素=67 596.7C+58 380，r=0.999 9(n=5)；A山柰素=68 601C-568 6，r=0.999 7(n=5)。
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1-槲皮素 2-山柰素
图1 提取物水解液的色谱图
2.5 加样回收率试验：精密称取银杏叶粗提物(约20 mg)，6份，各精密加入槲皮素和山柰素对照品25，50 μg，按样品分析方法操作，计算回收率，测定结果见表1。
表1 回收率试验结果
加入25 μg(n=3)
加入50 μg(n=3)
回收率(%)
RSD(%)
回收率(%)
RSD(%)
, 百拇医药
槲皮素
98.36
3.52
96.23
2.41
山柰素
97.20
2.86
94.81
3.27
2.6 重现性试验：按样品测定方法，对银杏叶粗提物进行5次平行试验，结果分别为RSD槲皮素=4.13%(n=5)；RSD山柰素=5.24%(n=5)。
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2.7 样品测定：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液适量，进样，按上述色谱条件测定，以外标法计算含量，结果槲皮素含量为0.609 mg，山柰素含量为0.472 mg；总黄酮苷含量=2.64×山柰素+2.51×槲皮素=2.78 mg。
3 讨论
3.1 超临界流体萃取条件的选择
3.1.1 萃取压力的选择：超临界CO2流体在一定的温度下，密度和介电常数可随压力增大而增加，但不呈线性相关。到达某一压力后，溶解能力随压力增加而变化不大。我们在27 576～44 811 Pa之间，每隔3 447 Pa萃取一个样品，结果见图2，从图中发现采用41 364 Pa压力较好。
3.1.2 改性剂的选择：超临界CO2流体的极性较弱，难以萃取出极性较强的物质，因此通过加入极性改性剂提高萃取效率，经试验采用乙醇为改性剂，无毒且萃取效率高；同时对其加入量进行考察，结果见图2，从图中可见采用加入0.2 mL乙醇为最佳。
, 百拇医药
3.1.3 萃取温度的选择：在一定的压力下，温度升高，溶质的蒸气压升高，溶解度增加，但升高温度，CO2流体密度变小，溶解能力下降，对55 ℃～70 ℃间每隔5 ℃萃取一个样品，结果见图3，从图中可见以60 ℃时萃取效果较好。
3.1.4 动态萃取体积的影响：固定其它因数，分别选择3，3.5，4，4.5，5 mL流体体积进行考察，发现4 mL流体萃取较适宜，结果见图2。
3.1.5 静态萃取时间的影响：整个萃取过程同时存在溶质的传导和扩散，适宜的静态萃取时间有利于溶质的溶解，考察2，3，4，5，6 min静态萃取时间对结果的影响，结果见图2。
A-压力 B-加入改性剂 C-温度 D-动态萃取体积 E-静态萃取时间
图2 各条件对萃取总黄酮苷量的影响
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综上萃取的最佳条件为：压力41 364 Pa；温度60 ℃；改性剂 0.2 mL乙醇；动态萃取体积4 mL；静态萃取时间4 min。
3.2 对样品的水解，经试验：10 mL的萃取液加入1.5 mL 25 %盐酸液水解30 min，水解完全。
3.3 在我们所测的样品中，未发现异鼠李素的存在。
3.4 采用本法测定银杏叶粗提物中黄酮苷的含量，方法简便，快速，重现性好。
3.5 文献报道[7]在测定槲皮素和山柰素时有拖尾现象，本文的色谱条件两者分离度好，峰形对称，杂质无干扰。
参考文献
1，Beek T A. J Chromatogr,1991,543:375.
, 百拇医药
2，Hasler A, et al. J Chromatogr,1992,605(1):41
3，栗晓黎，等.药物分析杂志，1998，18(3)：186
4，Chester T L, et al. Anal Chem, 1994,66:106
5，Jerry W K. J Chromatogr Sci,1990,28(1):9
6，Sanagi M M, et al. J Chromatogr Sci,1993,31(1):20
7，谢大年，等.色谱，1994，12(5)：384
(1999-02-04 收稿), http://www.100md.com
单位：第二军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433
关键词：超临界流体萃取法；银杏叶粗提物；黄酮类化合物；HPLC法
中草药000212摘 要 采用超临界流体萃取法提取银杏叶粗提物中总黄酮苷，确定最佳萃取条件为：压力41 364 Pa；温度60 ℃；静态萃取时间4 min；动态萃取体积4 mL；改性剂加入量0.2 mL乙醇；用HPLC测定含量，结果表明：本法简便快速，萃取完全，为银杏叶粗提物的分离、纯化、测定提供了一种有效可靠的方法。
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的叶子，经现代药理和临床研究表明[1]，银杏叶提取物可软化血管，增加冠状动脉血流量，对心绞痛，脑血管疾病具有显著疗效，并广泛用于临床。而黄酮类化合物为其主要有效成分之一，其制剂质量通过测定黄酮含量来控制[2，3]。传统的提取方法均采用有机溶剂提取，费时且残留有害溶剂，超临界流体萃取(SFE)因其特有的高选择性、高效性及低毒害的优点，在中草药的提取方面具有广泛应用[4～6]。我们采用SFE技术萃取银杏叶粗提物中的黄酮类成分，用HPLC测定含量，提取效率高，杂质少，具有一定的优点。
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1 试剂与仪器
1.1 仪器：ISCO 100DX,100DM泵，SFX2-10M超临界流体萃取仪(美国ISCO公司)，Waters高效液相色谱仪(美国Waters),NEC powermate 433电子计算机(日本NEC公司)
1.2 试剂：槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所)，山柰素对照品(Sigma公司)，CO2(99%)(上海酒精总厂)，甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：μ BondapakTM C18(300 mm×3.9 mm，Waters)；流动相：甲醇-0.4%磷酸(60∶40)；流速：1 mL/min；检测波长：266 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。
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2.2 对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品12.70 mg，山柰素对照品10.01 mg，分别加甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，即为对照溶液。
2.3 供试品溶液的制备：精密称取银杏叶粗提物20 mg，装入萃取池中，加入0.2 mL乙醇，在41 364 Pa、温度60 ℃下，静态萃取4 min，动态萃取4 mL，以乙醇为接收液，萃取完毕定容至10 mL，然后将萃取液置于50 mL烧瓶中，加入1.5 mL 25%盐酸溶液，混匀，水浴回流30 min，迅速冷却至室温，然后转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.4 标准曲线的绘制：精取槲皮素对照品溶液(1.270 mg/mL)2.5，5，10，20，40 μL，置于1 mL容量瓶中，依次加入山柰素对照品溶液(1.000 mg/mL)2.5，5，10，20，40 μL，加甲醇至刻度，混匀后分别进样测定，以峰面积(A)对进样浓度(C)进行回归，回归方程为：A槲皮素=67 596.7C+58 380，r=0.999 9(n=5)；A山柰素=68 601C-568 6，r=0.999 7(n=5)。
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1-槲皮素 2-山柰素
图1 提取物水解液的色谱图
2.5 加样回收率试验：精密称取银杏叶粗提物(约20 mg)，6份，各精密加入槲皮素和山柰素对照品25，50 μg，按样品分析方法操作，计算回收率，测定结果见表1。
表1 回收率试验结果
加入25 μg(n=3)
加入50 μg(n=3)
回收率(%)
RSD(%)
回收率(%)
RSD(%)
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槲皮素
98.36
3.52
96.23
2.41
山柰素
97.20
2.86
94.81
3.27
2.6 重现性试验：按样品测定方法，对银杏叶粗提物进行5次平行试验，结果分别为RSD槲皮素=4.13%(n=5)；RSD山柰素=5.24%(n=5)。
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2.7 样品测定：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液适量，进样，按上述色谱条件测定，以外标法计算含量，结果槲皮素含量为0.609 mg，山柰素含量为0.472 mg；总黄酮苷含量=2.64×山柰素+2.51×槲皮素=2.78 mg。
3 讨论
3.1 超临界流体萃取条件的选择
3.1.1 萃取压力的选择：超临界CO2流体在一定的温度下，密度和介电常数可随压力增大而增加，但不呈线性相关。到达某一压力后，溶解能力随压力增加而变化不大。我们在27 576～44 811 Pa之间，每隔3 447 Pa萃取一个样品，结果见图2，从图中发现采用41 364 Pa压力较好。
3.1.2 改性剂的选择：超临界CO2流体的极性较弱，难以萃取出极性较强的物质，因此通过加入极性改性剂提高萃取效率，经试验采用乙醇为改性剂，无毒且萃取效率高；同时对其加入量进行考察，结果见图2，从图中可见采用加入0.2 mL乙醇为最佳。
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3.1.3 萃取温度的选择：在一定的压力下，温度升高，溶质的蒸气压升高，溶解度增加，但升高温度，CO2流体密度变小，溶解能力下降，对55 ℃～70 ℃间每隔5 ℃萃取一个样品，结果见图3，从图中可见以60 ℃时萃取效果较好。
3.1.4 动态萃取体积的影响：固定其它因数，分别选择3，3.5，4，4.5，5 mL流体体积进行考察，发现4 mL流体萃取较适宜，结果见图2。
3.1.5 静态萃取时间的影响：整个萃取过程同时存在溶质的传导和扩散，适宜的静态萃取时间有利于溶质的溶解，考察2，3，4，5，6 min静态萃取时间对结果的影响，结果见图2。
A-压力 B-加入改性剂 C-温度 D-动态萃取体积 E-静态萃取时间
图2 各条件对萃取总黄酮苷量的影响
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综上萃取的最佳条件为：压力41 364 Pa；温度60 ℃；改性剂 0.2 mL乙醇；动态萃取体积4 mL；静态萃取时间4 min。
3.2 对样品的水解，经试验：10 mL的萃取液加入1.5 mL 25 %盐酸液水解30 min，水解完全。
3.3 在我们所测的样品中，未发现异鼠李素的存在。
3.4 采用本法测定银杏叶粗提物中黄酮苷的含量，方法简便，快速，重现性好。
3.5 文献报道[7]在测定槲皮素和山柰素时有拖尾现象，本文的色谱条件两者分离度好，峰形对称，杂质无干扰。
参考文献
1，Beek T A. J Chromatogr,1991,543:375.
, 百拇医药
2，Hasler A, et al. J Chromatogr,1992,605(1):41
3，栗晓黎，等.药物分析杂志，1998，18(3)：186
4，Chester T L, et al. Anal Chem, 1994,66:106
5，Jerry W K. J Chromatogr Sci,1990,28(1):9
6，Sanagi M M, et al. J Chromatogr Sci,1993,31(1):20
7，谢大年，等.色谱，1994，12(5)：384
(1999-02-04 收稿), http://www.100md.com