应用流式细胞仪测定不同来源CD34＋细胞基因转移效率的实验研究
作者：王存邦 达万明 欧英贤 欧剑锋 白海 张茜
单位：王存邦(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；达万明(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；欧英贤(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；欧剑锋(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
关键词：基因治疗；基因转移；CD34+细胞；流式细胞仪
西北国防医学杂志000214摘要：目的：探讨流式细胞仪测定基因转移效率的可行性，并比较相同实验条件下脐带血和骨髓CD34+细胞中基因转移效率的差别，为基因治疗的临床应用提供方便、有效的靶细胞及基因转移方法。方法：用细胞因子刺激靶细胞，以携带GFP和Neo基因的逆转录病毒载体GCGPXSN实施基因转移，流式细胞仪测定基因转移效率。结果：病毒上清滴度为1.9×105CFU.ml-1，各实验组实施基因转移48 h后，骨髓CD34+细胞中的转移效率分别为2.97%，4.75%，7.80%。脐带血CD34+细胞中的转移效率分别为12.70%，15.50%，17.00%。两者相比P<0.05。各实验组实施基因转移96 h后，骨髓CD34+细胞中的转移效率分别为23.30%，50.50%，35.90%。脐带血CD34+细胞中的转移效率分别为43.50%，76.10%，63.30%。两者相比P<0.01。结论：流式细胞仪可方便准确地测定基因转移效率，脐血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓CD34+细胞基因转移效率。
, 百拇医药
中图分类号：R 457.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0118-03
Study on comparing gene transfer efficiency in human cord blood and bone marrow CD34+ cells using FACS
WANG Cun-bang,DA Wan-ming,OU Ying-xian,et al.(Department of Hematology,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To study the effect of FACS in gene transfer and compare the differences of gene transfer efficiencies between cord blood CD34+ cell and bone marrow CD34+ cell in the same experimental conditions,offer to gene therapy an convenient,efficient target cell.Methods:The target cells were stimulated with cytokine firstly and then made gene transfer with retroviral vector containing GFP gene and Neo gene,determined gene transfer efficiency with flow cytometry.Results:Retroviral titers were 1.9×105CFU*ml-1.Gene transfer efficiencies of cord blood CD34+ cells were 12.70%,15.50%,17.00%,and thosc of bone marrow CD34+ cells were 2.97%,4.75%,7.80%.They had obvious differences (P<0.05),The efficiencies of bone marrow CD34+ cells were 23.30%,50.50%,35.90%.whereas those of cord blood CD34+ cells were 43.50%,76.10%,63.30%.they had obvious differences (P<0.01).Conclusion:FACS may be used as a convenient,efficient method to detect the gene transfer efficiency.Gene transfer efficiency of cord blood CD34+ cells were higher than that of bone marrow CD34+ cells.
, 百拇医药
Key words:Gene therapy; Gene transfer; CD34+ cells; Flow cytometry
已有实验证明SCF，IL-3，IL-6联合应用可提高逆转录病毒载体介导的基因转移效率，且应用含有绿色荧光蛋白(GFP)表达基因和新霉素磷酸转移酶基因(NeoR)的逆转录病毒载体(质粒GCGPXSN)实施基因转移，其基因转移效率可用流式细胞仪测定，其结果与经典方法测定的结果相一致[1]。但人脐血和骨髓的CD34+细胞在相同实验条件下，其基因转移效率相同还是有所差别尚少见报道。本实验研究比较了SCF、IL-3、IL-6等联合应用对人脐带血和骨髓的CD34+细胞基因转移效率的差别，为基因治疗临床应用提供高效的靶细胞。
1 材料和方法
1.1 包装细胞株：已转染逆转录病毒载体GCGPXSN，且经G418筛选到的生产高滴度病毒的包装细胞株PA317-GCGPXSN及检测病毒滴度用细胞株NIH3T3，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠。
, 百拇医药
1.2 病毒上清的制备及病毒滴度测定：将抗性PA317-GCGPXSN包装细胞用DMEM培养至70%～80%汇合，弃上清，换用新鲜培养液培养24 h，收集培养液上清，以NIH3T3细胞株检测病毒滴度[2]，病毒效价＝集落数×上清稀释倍数(CFU.ml-1)。
1.3 基因转移：将脐带血(来自兰州市妇幼保健院健康产妇)和骨髓(来自健康供者)用ficoll(相对密度1.077)梯度离心并制备成2×106.ml-1的细胞悬液，按阴性对照、阳性对照及加不同细胞因子组合分为4个实验组(表1)，分别加rhIL-3，rhIL-6(终浓度均为200 U.ml-1，日本Kirin公司)及rhSCF(终浓度为100 ng.ml-1，军事医学科学院沈培备教授惠赠)，G-CSF(终浓度为100 μg.ml-1，日本Kirin公司)，GM-CSF(终浓度为100 μg.ml-1，美国先灵保雅公司)。在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，离心弃上清。按1.9×105CFU.ml-1实验体系加入病毒上清及终浓度为8 μg.ml-1 polybrene(美国sigma公司)，分别加细胞因子如上述浓度。阴性对照未转染，而以新鲜DMFM完全培养液代替病毒上清。阳性对照组不加细胞因子，而仅以病毒上清及8 μg.ml-1 polybrene转染。继续培养48 h，收集细胞用流式细胞仪检测基因转移效率。同时再用同样方法作第2次转染，培养48 h后，收集细胞检测基因转移效率。
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表1 实验分组 组别
细胞因子
病毒上清
SCF
IL3
IL6
G-CSF
GM-CSF
1
-
-
-
-
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-
-
2
-
-
-
-
-
+
3
+
+
+
-
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-
+
4
+
+
+
+
+
+
1.4 流式细胞术测定基因转移效率：将上述各实验组的脐血及骨髓细胞制备成2×106.ml-1的细胞悬液，用PE(枣红蛋白)标记的抗人CD34+单抗标记，参照检测异硫酸荧光素(FITC)的常规方法(其激光波长475 nm，发射波长490 nm)，按1～4组应用流式细胞仪(FACS calibar、美国BD公司)分别获取细胞10 000个，测定CD34+细胞中所含GFP+细胞的百分率。
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1.5 统计学处理：FACS测定基因转移效率的统计学处理用χ2检验进行。
2 结果
2.1 病毒上清滴度：为1.9×105CFU.ml-1。
2.2 实施基因转移48 h时的转移效率：如表2所示骨髓CD34+细胞实施基因转移48 h后阳性对照组基因转移效率为2.97%，实验组分别为4.75%，7.80%。脐带血CD34+细胞实施基因转移48 h后阳性对照组转移效率为12.70%，实验组分别为15.50%，17.00%，两组相差显著(P<0.05)。
表2 实施基因转移48 h时的转移效率(%) 实验组
脐带血CD34+细胞
, 百拇医药
骨髓CD34+细胞
χ2
1
0
0
2
12.70
2.97
6.555*
3
15.50
4.75
, 百拇医药
6.350*
4
17.00
7.80
3.896*
*P<0.052.3 实施基因转移96 h时的转移效率：如表3所示骨髓CD34+细胞实施基因转移96 h后阳性对照组基因转移效率为23.30%，实验组分别为50.50%，35.90%。脐带血CD34+细胞实施基因转移96 h后阳性对照组转移效率为43.50%，实验组分别为76.10%，63.30%。两组相差尤为显著(P<0.01)。示在相同实验条件下脐带血CD34+细胞较骨髓CD34+细胞有较高的基因转移效率。
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表3 实施基因转移96 h时的转移效率(%) 实验组
脐带血CD34+细胞
骨髓CD34+细胞
χ2
1
0
0
2
43.50
23.30
9.170*
, http://www.100md.com
3
76.10
50.50
14.100*
4
63.30
35.90
15.016*
*P<0.01
3 讨论
随基因治疗设想的提出及基础研究成果的不断涌现，基因转移技术已取得长足进展，动物实验证明，SCF，IL-3，IL-6联合应用能有效地提高逆转录病毒载体介导的造血干细胞基因转移效率[1]，且在不同物种中，同样实验条件下，基因转移效率随物种越高级，转移效率呈趋降趋势[3]，这与不同动物的造血干细胞特性有关，人的造血干细胞中绝大部分处于静止期，在细胞因子的刺激下，可促使其增殖分化，由此提高转移效率。
, 百拇医药
本实验研究所用质粒GCGPXSN中含有GFP表达基因，故基因转移效率的测定可用流式细胞仪来完成[4]，加之用PE标记的抗人CD34+单克隆抗体标记基因转移后的脐血及骨髓CD34+细胞，故可应用FACS测定出各实验组CD34+细胞中所含GFP+细胞的百分比率，由此得出转移效率。且有实验证明此测定结果与经典的GM-CFU培养方法、PCR方法及Sothern blot方法所得结果一致[1]。
实验结果表明，无论脐带血还是骨髓CD34+细胞，重复转染及延长培养时间可使基因转移效率同步增长，而以脐带血CD34+细胞的增长尤为明显，其原因可能是随细胞因子作用时间延长，静止期CD34+细胞更趋于活跃，进入增殖期，由此提高了转移效率[5]，另外。外源基因转入CD34+细胞后的表达需一定的时间，延长培养时间可使GFP的表达量增加，因此实施基因转移96 h的转移效率均高于48 h的转移效率。但随培养时间的延长，转移效率能否进一步提高，尚有待进一步研究。
, 百拇医药
基因转移效率高低的影响因素主要是处于增殖期的靶细胞数量的多少及病毒滴度的高低。在病毒滴度一定的情况下，增殖期靶细胞数量的增加也会使基因转移效率增加[6]。有实验证明，脐带血在细胞因子的刺激下，其CD34+细胞可成倍增加[7]。脐带血与骨髓CD34+细胞相比，可能会更容易进入增殖期。考虑此为脐带血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓CD34+细胞基因转移效率的原因之一。
本实验研究中，SCF/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF联合应用组(实验组4)与SCF/IL-3/IL-6联合应用组(实验组3)相比，基因转移效率略有下降，而较阳性对照组(实验组2)转移效率高，这说明G-CSF，GM-CSF对CD34+细胞有一定的扩增作用，但同时具有促进分化作用。使实验组4中处于增殖期的CD34+细胞较实验组3中处于增殖期的CD34+细胞减少，转移效率较之降低。
, 百拇医药
作者简介：王存邦(1966—)，男，硕士，主治医师
白海(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
张茜(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
参考文献：
[1]王存邦，达万明，冀孟菊，等.细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响[J].中国实验血液学杂志，1998，9：182-186.
[2]Miller AD,Law MF,Verma IM.Generation of helper free an photropic retroviruses that transduce a dominant-acting,methothotrexate-resistant and dihydrofolate reductage gene[J].Mol Cell Biol,1985,5:431-437.
, 百拇医药
[3]王存邦.细胞基因治疗技术及应用[J].国外医学输血及血液学分册，1996，19：228-230.
[4]王存邦，达万明，钱其军，等.流式细胞仪测定小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的实验研究[J].中国激光医学杂志，1999，8：108-110.
[5]Bernad A,Varas F,Gallego JM,et al.Ex vivo expansion and selection of retrovirally transduced bone marrow:an efficient methodology for gene transfer to murine lympho-hematopoietic stem cell[J].Br J Hematol,1994,87:6-17.
[6]Clapp DW.Somatic gene therapy into hematopoietic cells[J].Clin Perinatol,1993,20:155-161.
[7]裴雪涛，王立生，徐 黎，等.造血生长因子对脐带血CD34+细胞的体外扩增作用[J].中华血液学杂志，1996，17：305-307.
收稿日期：1999-11-03 修回：1999-11-25, http://www.100md.com
单位：王存邦(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；达万明(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；欧英贤(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)；欧剑锋(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
关键词：基因治疗；基因转移；CD34+细胞；流式细胞仪
西北国防医学杂志000214摘要：目的：探讨流式细胞仪测定基因转移效率的可行性，并比较相同实验条件下脐带血和骨髓CD34+细胞中基因转移效率的差别，为基因治疗的临床应用提供方便、有效的靶细胞及基因转移方法。方法：用细胞因子刺激靶细胞，以携带GFP和Neo基因的逆转录病毒载体GCGPXSN实施基因转移，流式细胞仪测定基因转移效率。结果：病毒上清滴度为1.9×105CFU.ml-1，各实验组实施基因转移48 h后，骨髓CD34+细胞中的转移效率分别为2.97%，4.75%，7.80%。脐带血CD34+细胞中的转移效率分别为12.70%，15.50%，17.00%。两者相比P<0.05。各实验组实施基因转移96 h后，骨髓CD34+细胞中的转移效率分别为23.30%，50.50%，35.90%。脐带血CD34+细胞中的转移效率分别为43.50%，76.10%，63.30%。两者相比P<0.01。结论：流式细胞仪可方便准确地测定基因转移效率，脐血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓CD34+细胞基因转移效率。
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中图分类号：R 457.2 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0118-03
Study on comparing gene transfer efficiency in human cord blood and bone marrow CD34+ cells using FACS
WANG Cun-bang,DA Wan-ming,OU Ying-xian,et al.(Department of Hematology,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050)
Abstract:Objective:To study the effect of FACS in gene transfer and compare the differences of gene transfer efficiencies between cord blood CD34+ cell and bone marrow CD34+ cell in the same experimental conditions,offer to gene therapy an convenient,efficient target cell.Methods:The target cells were stimulated with cytokine firstly and then made gene transfer with retroviral vector containing GFP gene and Neo gene,determined gene transfer efficiency with flow cytometry.Results:Retroviral titers were 1.9×105CFU*ml-1.Gene transfer efficiencies of cord blood CD34+ cells were 12.70%,15.50%,17.00%,and thosc of bone marrow CD34+ cells were 2.97%,4.75%,7.80%.They had obvious differences (P<0.05),The efficiencies of bone marrow CD34+ cells were 23.30%,50.50%,35.90%.whereas those of cord blood CD34+ cells were 43.50%,76.10%,63.30%.they had obvious differences (P<0.01).Conclusion:FACS may be used as a convenient,efficient method to detect the gene transfer efficiency.Gene transfer efficiency of cord blood CD34+ cells were higher than that of bone marrow CD34+ cells.
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Key words:Gene therapy; Gene transfer; CD34+ cells; Flow cytometry
已有实验证明SCF，IL-3，IL-6联合应用可提高逆转录病毒载体介导的基因转移效率，且应用含有绿色荧光蛋白(GFP)表达基因和新霉素磷酸转移酶基因(NeoR)的逆转录病毒载体(质粒GCGPXSN)实施基因转移，其基因转移效率可用流式细胞仪测定，其结果与经典方法测定的结果相一致[1]。但人脐血和骨髓的CD34+细胞在相同实验条件下，其基因转移效率相同还是有所差别尚少见报道。本实验研究比较了SCF、IL-3、IL-6等联合应用对人脐带血和骨髓的CD34+细胞基因转移效率的差别，为基因治疗临床应用提供高效的靶细胞。
1 材料和方法
1.1 包装细胞株：已转染逆转录病毒载体GCGPXSN，且经G418筛选到的生产高滴度病毒的包装细胞株PA317-GCGPXSN及检测病毒滴度用细胞株NIH3T3，均由上海东方肝胆外科医院钱其军博士惠赠。
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1.2 病毒上清的制备及病毒滴度测定：将抗性PA317-GCGPXSN包装细胞用DMEM培养至70%～80%汇合，弃上清，换用新鲜培养液培养24 h，收集培养液上清，以NIH3T3细胞株检测病毒滴度[2]，病毒效价＝集落数×上清稀释倍数(CFU.ml-1)。
1.3 基因转移：将脐带血(来自兰州市妇幼保健院健康产妇)和骨髓(来自健康供者)用ficoll(相对密度1.077)梯度离心并制备成2×106.ml-1的细胞悬液，按阴性对照、阳性对照及加不同细胞因子组合分为4个实验组(表1)，分别加rhIL-3，rhIL-6(终浓度均为200 U.ml-1，日本Kirin公司)及rhSCF(终浓度为100 ng.ml-1，军事医学科学院沈培备教授惠赠)，G-CSF(终浓度为100 μg.ml-1，日本Kirin公司)，GM-CSF(终浓度为100 μg.ml-1，美国先灵保雅公司)。在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h后，离心弃上清。按1.9×105CFU.ml-1实验体系加入病毒上清及终浓度为8 μg.ml-1 polybrene(美国sigma公司)，分别加细胞因子如上述浓度。阴性对照未转染，而以新鲜DMFM完全培养液代替病毒上清。阳性对照组不加细胞因子，而仅以病毒上清及8 μg.ml-1 polybrene转染。继续培养48 h，收集细胞用流式细胞仪检测基因转移效率。同时再用同样方法作第2次转染，培养48 h后，收集细胞检测基因转移效率。
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表1 实验分组 组别
细胞因子
病毒上清
SCF
IL3
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1.4 流式细胞术测定基因转移效率：将上述各实验组的脐血及骨髓细胞制备成2×106.ml-1的细胞悬液，用PE(枣红蛋白)标记的抗人CD34+单抗标记，参照检测异硫酸荧光素(FITC)的常规方法(其激光波长475 nm，发射波长490 nm)，按1～4组应用流式细胞仪(FACS calibar、美国BD公司)分别获取细胞10 000个，测定CD34+细胞中所含GFP+细胞的百分率。
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1.5 统计学处理：FACS测定基因转移效率的统计学处理用χ2检验进行。
2 结果
2.1 病毒上清滴度：为1.9×105CFU.ml-1。
2.2 实施基因转移48 h时的转移效率：如表2所示骨髓CD34+细胞实施基因转移48 h后阳性对照组基因转移效率为2.97%，实验组分别为4.75%，7.80%。脐带血CD34+细胞实施基因转移48 h后阳性对照组转移效率为12.70%，实验组分别为15.50%，17.00%，两组相差显著(P<0.05)。
表2 实施基因转移48 h时的转移效率(%) 实验组
脐带血CD34+细胞
, 百拇医药
骨髓CD34+细胞
χ2
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*P<0.052.3 实施基因转移96 h时的转移效率：如表3所示骨髓CD34+细胞实施基因转移96 h后阳性对照组基因转移效率为23.30%，实验组分别为50.50%，35.90%。脐带血CD34+细胞实施基因转移96 h后阳性对照组转移效率为43.50%，实验组分别为76.10%，63.30%。两组相差尤为显著(P<0.01)。示在相同实验条件下脐带血CD34+细胞较骨髓CD34+细胞有较高的基因转移效率。
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表3 实施基因转移96 h时的转移效率(%) 实验组
脐带血CD34+细胞
骨髓CD34+细胞
χ2
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43.50
23.30
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76.10
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63.30
35.90
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*P<0.01
3 讨论
随基因治疗设想的提出及基础研究成果的不断涌现，基因转移技术已取得长足进展，动物实验证明，SCF，IL-3，IL-6联合应用能有效地提高逆转录病毒载体介导的造血干细胞基因转移效率[1]，且在不同物种中，同样实验条件下，基因转移效率随物种越高级，转移效率呈趋降趋势[3]，这与不同动物的造血干细胞特性有关，人的造血干细胞中绝大部分处于静止期，在细胞因子的刺激下，可促使其增殖分化，由此提高转移效率。
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本实验研究所用质粒GCGPXSN中含有GFP表达基因，故基因转移效率的测定可用流式细胞仪来完成[4]，加之用PE标记的抗人CD34+单克隆抗体标记基因转移后的脐血及骨髓CD34+细胞，故可应用FACS测定出各实验组CD34+细胞中所含GFP+细胞的百分比率，由此得出转移效率。且有实验证明此测定结果与经典的GM-CFU培养方法、PCR方法及Sothern blot方法所得结果一致[1]。
实验结果表明，无论脐带血还是骨髓CD34+细胞，重复转染及延长培养时间可使基因转移效率同步增长，而以脐带血CD34+细胞的增长尤为明显，其原因可能是随细胞因子作用时间延长，静止期CD34+细胞更趋于活跃，进入增殖期，由此提高了转移效率[5]，另外。外源基因转入CD34+细胞后的表达需一定的时间，延长培养时间可使GFP的表达量增加，因此实施基因转移96 h的转移效率均高于48 h的转移效率。但随培养时间的延长，转移效率能否进一步提高，尚有待进一步研究。
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基因转移效率高低的影响因素主要是处于增殖期的靶细胞数量的多少及病毒滴度的高低。在病毒滴度一定的情况下，增殖期靶细胞数量的增加也会使基因转移效率增加[6]。有实验证明，脐带血在细胞因子的刺激下，其CD34+细胞可成倍增加[7]。脐带血与骨髓CD34+细胞相比，可能会更容易进入增殖期。考虑此为脐带血CD34+细胞的基因转移效率高于骨髓CD34+细胞基因转移效率的原因之一。
本实验研究中，SCF/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF联合应用组(实验组4)与SCF/IL-3/IL-6联合应用组(实验组3)相比，基因转移效率略有下降，而较阳性对照组(实验组2)转移效率高，这说明G-CSF，GM-CSF对CD34+细胞有一定的扩增作用，但同时具有促进分化作用。使实验组4中处于增殖期的CD34+细胞较实验组3中处于增殖期的CD34+细胞减少，转移效率较之降低。
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作者简介：王存邦(1966—)，男，硕士，主治医师
白海(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
张茜(兰州军区兰州总医院血液科，甘肃 兰州 730050)
参考文献：
[1]王存邦，达万明，冀孟菊，等.细胞因子对逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的影响[J].中国实验血液学杂志，1998，9：182-186.
[2]Miller AD,Law MF,Verma IM.Generation of helper free an photropic retroviruses that transduce a dominant-acting,methothotrexate-resistant and dihydrofolate reductage gene[J].Mol Cell Biol,1985,5:431-437.
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[3]王存邦.细胞基因治疗技术及应用[J].国外医学输血及血液学分册，1996，19：228-230.
[4]王存邦，达万明，钱其军，等.流式细胞仪测定小鼠骨髓造血干细胞基因转移效率的实验研究[J].中国激光医学杂志，1999，8：108-110.
[5]Bernad A,Varas F,Gallego JM,et al.Ex vivo expansion and selection of retrovirally transduced bone marrow:an efficient methodology for gene transfer to murine lympho-hematopoietic stem cell[J].Br J Hematol,1994,87:6-17.
[6]Clapp DW.Somatic gene therapy into hematopoietic cells[J].Clin Perinatol,1993,20:155-161.
[7]裴雪涛，王立生，徐 黎，等.造血生长因子对脐带血CD34+细胞的体外扩增作用[J].中华血液学杂志，1996，17：305-307.
收稿日期：1999-11-03 修回：1999-11-25, http://www.100md.com