高血压肝阳上亢证的分子机理研究
作者：金益强 胡随瑜 鄢东红 刘爱平 唐发清 肖纯 谌兵来 王勇华
单位：金益强(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；胡随瑜(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；鄢东红(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；刘爱平(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；唐发清(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；肖纯(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
关键词：高血压；肝阳上亢证；酪氨酸羟化酶；分子机理
中国中西医结合杂志000203 内容提要 目的：探讨高血压肝阳上亢证的分子机理。方法：应用高效液相色谱(HPLC)方法检测健康人、高血压病肝阳上亢证及肝肾阴虚证患者血浆去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)含量，并采用Southern Blot方法分析上述3组间酪氨酸羟化酶(TH)基因多态性；用PCR-SSCP方法分析高血压肝阳上亢证TH及单胺氧化酶A和B(MAOA，MAOB)基因相关微卫星多态性改变；同时，采用自发性高血压大鼠(SHR)加灌附子汤方法复制高血压肝阳上亢证动物模型，用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达水平。结果：高血压病肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人组及肝肾阴虚组，其TH基因有显著扩增，且TH微卫星D11S4046中A1型明显增高；SHR肝阳上亢证模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达增强。结论：高血压肝阳上亢证具有TH基因显著扩增、TH mRNA及蛋白质表达增强的特点。提示TH基因的过度表达可能是高血压肝阳上亢证的分子机理。
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Study on Molecular Mechanism of Ganyang Shangkang Syndrome in Hypertension
JIN Yiqiang HU Suiyu YAN Donghong et al
(Institute of Integrated TCM and Western Medicine, Hunan Medical University, Changsha (410008))
Objective: To investigate the molecular mechanism of Ganyang Shangkang (Liver Yang ascending, GYSK) syndrome in hypertension. Methods: The plasma norepinephrine (NE), epinephrine (E) contents in patients with GYSK syndrome or Ganshen Yinxu (Liver and Kidney Yin Deficiency, GSYX) syndrome who were suffered from hypertension, and normal controls were determined by high performance liquid chromatography-electrochemical detector (HPLC-ECD). The polymorphism of tyrosine hydroxylase (TH) gene in the three groups were analyzed by Southern Blot assay. The polymorphism of TH and MAOA， MAOB gene microsatellite in these groups were analyzed by polymerase chain reaction (PCR)-SSCP; meanwhile, the GYSK model by administration of single TCM preparation, Radix Aconiti preparate (RAP) in spontaneous hypertension rats (SHR). The adrenal gland medulla were examined for their TH expression at the protein level after ABC immuno histochemical staining with the TH monoclonal antibody (McAb). The adrenal TH gene mRNA expression was demonstrated by in situ hybridization with the synthesized TH oligonucleic acid probe. The results of immunohistochemistry and in situ hybridization were analyzed with the image analysis system (IAS). Results: The plasma NE, E contents in patients with GYSK were more significantly increased than that in GSYX and normal controls. The TH gene amplified and the type A1 TH microsatellite D11S4046 was increased more remarkably than other groups. The TH mRNA protein expression in their adrenal tissue of the single TCM preparation RAP induced GYSK model in SHR were elevated. Conclusions: The GYSK syndrome of hypertension possesses the character as amplified TH gene and increased TH mRNA and protein. It suggested that the hyperexpression of TH is probably the mechanism of GYSK syndrome in hypertension
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Key words hypertension, Ganyang Shangkang syndrome, tyrosine hydroxylase, molecular mechanism
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，多见于高血压病(1)，其病理生理学基础已有较深入的研究(2，3)，但未见有关该证分子水平研究的报道。本研究在以往研究基础上探讨高血压肝阳上证的分子机理。
临床研究
1 临床资料 病例选自湖南医科大学附属湘雅医院，湖南省隆回县、绥宁县、新宁县、双牌县人民医院1997年10月～1998年5月的门诊和住院患者。采用病证结合方式选择研究对象100例。高血压病诊断标准按文献(4)，中医辨证标准参照文献(5)，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期78例；肝阳上亢证70例，其中男38例，女32例；年龄38～75岁，平均(54.68±12.26)岁；肝肾阴虚证30例，其中男11例，女19例；年龄40～74岁，平均(59.67±8.83)岁；健康对照组选自本院职工及长沙市中心血站首次献血者，共30名，其中男14名，女16名；年龄29～65岁，平均(51.25±8.61)岁；经病史查询、体检、血象、胸透及心、肝、肾检查未发现异常。
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2 方法
2.1 血样采集 受试者于清晨6：00～8：00空腹抽取肘静脉血，抽血前先休息15～30min，禁服影响单胺类代谢的血管活性药物及食物如香蕉、菠萝等。采血5ml，于4℃ 1000r/min离心20min，收集上清，存于-70℃冰箱中待测血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)；同时，另取2ml血用肝素抗凝，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，留作DNA提取。
2.2 NE、E的测定 采用Eisenhofer(6)方法。仪器用高效液相色谱仪(日本岛津公司产，LC-9A型)及电化学检测器(日本岛津公司产，L-ECD-6A型)。
2.3 DNA提取及Southern Blot分析 参照文献(7)。
2.4 高血压病肝阳上亢证酪氨酸羟化酶(TH)及单胺氧化酶(MAO)微卫星多态性分析 采用PCR-SSCP方法，参照文献(8)。
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2.5 统计学处理 计量资料结果用
±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
3 结果
3.1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆NE、E测定结果比较 见表1。说明肝阳上亢证组血浆NE、E明显高于健康人组和肝肾阴虚证组。
表1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆
NE、E测定结果 (pmol/L，±s) 组 别
n
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NE
E
健康人
30
1997.0±139.1
824.2±?61.3
肝阳上亢证
70
3922.4±716.7*△
1365.6±283.8*△
肝肾阴虚证
30
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2271.3±360.3
773.1±135.7
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组TH基因Southern Blot杂交信号经MIAS300图像分析系统分析后结果比较 见表2。说明肝阳上亢证组TH基因扩增信号较其他两组明显增强。
表2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组
TH基因杂交信号 (±s) 组 别
n
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TH cDNA杂交信号扫描
健康人
10
128.63±17.63
肝阳上亢证
27
310.33±24.55*△
肝肾阴虚证
18
187.77±21.03
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
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3.3 TH基因相关微卫星D11S4046位点扩增，检测出3种微卫星多态性A1、A2、A3，见图1。其在肝阳上亢证、肝肾阴虚证和健康人组分布，见表3。说明肝阳上亢证组TH相关微卫星D11S4046中A1型明显增加。
表3 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾
阴虚证组D11S4046多态性分布 组别
n
A1
A2
A3
健康人
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23
12(0.522)*
8(0.348)
3(0.130)
肝阳上亢证
37
26(0.703)
6(0.162)
5(0.135)
肝肾阴虚证
30
11(0.367)*
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10(0.333)
9(0.300)
注：与肝阳上亢证组比较，*P<0.05；( )内为基因频率
图1 TH基因微卫星D11S4046
多态性分3型(A1，A2，A3)
3.4 MAOA基因相关微卫星DXS6810有3种多态性改变B1、B2、B3，见图2。其分布频率在健康人、肝阳上亢证及肝肾阴虚证3组间差异无显著性意义(P>0.05)。
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图2 MAOA基因微卫星DXS6810
多态性分3型(B1，B2，B3)
3.5 MAOB基因相关微卫星DXS993亦有3种基因型，见图3。3组间分布频率差异无显著性意义(P>0.05)。
图3 MAOB基因微卫星DXS993
多态性分3型(C1，C2，C3)
实验研究
1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物中心。
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2 中药及制备 (1)附子汤：由单味制附子20g煎两次后，将药液合并浓缩为每毫升药液含0.1g生药。(2)潜阳方：由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。煎两次后将药液合并浓缩为每毫升药液含1g生药。
3 主要试剂及仪器 试剂：酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒：购自华美生物工程公司。NE、E、DHBA(内标)标准品均购自Sigma公司；微卫星引物设计均采用网上查阅：http://www.gdb.org/gdb-bin/genera。仪器：超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
4 方法
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4.1 自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的复制 选用SHR加灌附子汤的方法造模(9)，每天20ml/kg体重灌胃，相当每天生药2g/kg体重，共4周。
4.2 动物分组与给药方法 (1)正常对照组(简称正常组，10只)：正常Wistar大鼠，普通饲养，不做处理。(2)自发性高血压组(简称SHR，8只)：SHR灌蒸馏水6周。(3)附子汤造模组(简称肝阳上亢组，8只)：SHR灌服附子汤4周，造模后不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。(4)潜阳方治疗组(简称潜阳方组，10只)：SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始灌服中药潜阳方2周，每日灌服潜阳方煎剂20ml/kg，相当每天生药20g/kg体重，按动物体表面积系数折算，相当70kg成人临床剂量的1.9倍。
4.3 观测项目及检测方法
4.3.1 实验动物肾上腺组织TH蛋白质测定 采用免疫组织化学方法，参照文献(10)。
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4.3.2 实验动物肾上腺组织TH mRNA表达 采用原位杂交方法，参照文献(11)。以上Southern Blot与TH mRNA及蛋白质表达结果均用MIAS-300型图像分析系统进行分析。
4.4 统计学处理 计量资料结果用±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。
5 结果
5.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表4。灰度值是图像分析系统中用来表示图像透光率的参数。细胞内阳性产物浓度(或杂交信号)越高(深)，则透光率越低，灰度值亦低，反之则越大。肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，均具有显著性差异(P<0.05)。表明肝阳上亢组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，说明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平下降。
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表4 各组TH免疫组化阳性产物浓度灰度值比较 (±s) 组 别
n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
正 常
5
63.67±6.48
SHR
5
35.27±4.88**
肝阳上亢
, 百拇医药 5
24.96±8.34**
潜阳方
5
50.96±5.29*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.01
5.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表5。肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组、SHR组及潜阳方组，均有显著性差异(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，TH mRNA下降。
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表5 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (±s) 组 别
n
TH原位杂交信号灰度值
正 常
5
72.85±6.17
SHR
5
35.98±6.21**
肝阳上亢
5
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22.16±1.48**
潜阳方
5
48.89±6.03*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.05
讨论
肝阳上亢证是中医肝病的主要证型之一，历代医家论理精详，平肝潜阳治法，方、药广泛应用于临床；本证的现代研究近10余年已取得很大进展，发现其病理生理学基础为外周交感—肾上腺髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆NE、E含量的增高(2)。儿茶酚胺(CA)包括NE、E、DA，在CA合成过程中，TH是起决定作用的限速酶，调节NE、E的合成。NE、E的含量间接反应TH活性，TH是高血压病因学的候选基因(12)。儿茶酚胺的分解则主要在MAOA和MAOB的作用下完成。本研究结果进一步验证了肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人及肝肾阴虚证患者(P<0.05)；同时，经采用Southern Blot分析高血压病患者TH基因多态性，结果显示高血压病肝阳上亢证患者TH基因有明显扩增(P<0.05)。
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微卫星(Microsatellite)即短串联重复序列(short tandem repeat, STR)，在人类基因组中广泛存在，约占真核生物基因组的5%，其基本单位是l～8bp的串联重复，多在基因编码区、内含子及非翻译区附近。人基因组中STR有(GT)n、(CA)n、(GA)n、(AA)n、(GG)n、(CAA)n和(CGG)n等，其中以(CA)n、(GT)n重复序列最多，大约分布着5～10万个散在的具有高度多态杂合性并符合孟德尔遗传的STR，即每30～60kb DNA就存在一个(CA)或(GT)重复序列，STR的产生一般认为是由于DNA复制和修复过程中DNA滑移及细胞分裂过程中染色体不等交换的结果。本研究选用(gdb)基因标准库中微卫星标志，D11S4046为酪氨酸羟化酶基因内含的微卫星标志，DXS6810及DXS993为单胺氧化酶内含的微卫星标志。D11S4046位于11pter-11qter为二核苷酸重复序列，扩增片段最小长度为187bp；DXS6810为四核苷酸重复，杂合度暂时不清楚，扩增最小片段为209bp；DXS993位于Xp11.4～Xp11.3之间，为(CT)n重复，杂合度为0.7921，扩增最长片段为312bp及292bp。本研究发现肝阳上亢证TH基因内含的微卫星D11S4046中A1型明显高于肝肾阴虚证组及健康人组；而MAOA与MAOB基因内含的微卫星标志在上述3组间无显著性差异，说明肝阳上亢证与TH有关，与MAOA及MAOB则关系不大。
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本研究所复制的SHR肝阳上亢证模型具有血压稳定升高，易激惹程度增加，饮水量增加，旋转时间缩短，痛阈降低，肾小动脉硬化等近似人类高血压病肝阳上亢证的特征(9)；取不同组动物的肾上腺组织用免疫组织化学方法和原位杂交法进行TH基因表达研究，结果显示肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物增高；TH基因原位杂交信号明显增强，说明该模型肾上腺组织TH mRNA及蛋白质水平均明显增加，进一步验证了肝阳上亢证与TH的关系。
因此，依据上述各点，笔者认为高血压肝阳上亢证的形成是因TH基因扩增导致TH基因mRNA及蛋白质过度表达，引起TH活性增加，使血浆NE、E增加所致，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢证形成的分子机理，今后拟采取异病同证方式选择研究对象，进一步深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39670890)
谌兵来(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
, 百拇医药
王勇华(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
参考文献
1.陈国林，李 炜，胡随瑜，等.通过肝阳上亢证的辨证标准探讨证的研究方法.中国医药学报 1988；3(5)∶67—68.
2.金益强，黎杏群，陈国林，等.肝阳上亢证本质研究.中西医结合杂志 1988；8(3)∶136—140.
3.胡随瑜，刘湘华，刘尚明.经颅多谱勒超声扫描术对肝阳上亢证患者辨证诊断的初步评价.湖南医科大学学报 1997；22(2)∶131—133.
4.戴自英主编.实用内科学.第9版.北京：人民卫生出版社，1993∶1176—1177.
5.陈国林，潘其明，赵玉秋，等.中医肝病证候临床辨证标准的研究.中国医药学报 1990；5(1)∶66—73.
, 百拇医药
6.Eisenhofer G, Goldstein DS, Stult R, et al. Simutaneous Liq-uid Chromatographic determination of 3,4-dihydroxypheny-lglycal, catecholamines, and 3,4-dihydroxyphenylalamine in plasma, and their response to inhibition of monoamine oxidase. Clin Chem 1986;32(11)∶2030—2033.
7.姜 泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996∶137—139.
8.刘爱平，胡立宪.微卫星多态性检测时银染色和同位素技术比较.湖南医科大学学报 1996；21(2)∶169—171.
9.鄢东红，金益强，肖 纯，等.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制.湖南中医学院学报 1999；19(4)∶37—39.
, 百拇医药
10.王 键，鞠 躬.大鼠垂体前叶中的TH-，ChAT-免疫阳性神经纤维.中国组织化学与细胞化学杂志 1997；6(2)∶129—132.
11.Dumas S, Pequignot JM, Ghilini G, et al. Plasticity of tyrosine hydroxylase gene expression in the rat nucleus tractus solitarius after ventilatory acclimatization to hypoxia. Mol Brain Res 1996；40∶188—194.
12.Sharma P, Hingorani A, Jia H, et al. Positive association of tyrosine hydroxylase microsatellite marker to essential hypertension. Hypertension 1998;32(4)∶676—682.
(收稿：1999-10-20 修回：1999-11-02), http://www.100md.com
单位：金益强(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；胡随瑜(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；鄢东红(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；刘爱平(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；唐发清(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))；肖纯(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
关键词：高血压；肝阳上亢证；酪氨酸羟化酶；分子机理
中国中西医结合杂志000203 内容提要 目的：探讨高血压肝阳上亢证的分子机理。方法：应用高效液相色谱(HPLC)方法检测健康人、高血压病肝阳上亢证及肝肾阴虚证患者血浆去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)含量，并采用Southern Blot方法分析上述3组间酪氨酸羟化酶(TH)基因多态性；用PCR-SSCP方法分析高血压肝阳上亢证TH及单胺氧化酶A和B(MAOA，MAOB)基因相关微卫星多态性改变；同时，采用自发性高血压大鼠(SHR)加灌附子汤方法复制高血压肝阳上亢证动物模型，用免疫组织化学方法和原位杂交法分别测定该模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达水平。结果：高血压病肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人组及肝肾阴虚组，其TH基因有显著扩增，且TH微卫星D11S4046中A1型明显增高；SHR肝阳上亢证模型肾上腺组织TH蛋白质及mRNA表达增强。结论：高血压肝阳上亢证具有TH基因显著扩增、TH mRNA及蛋白质表达增强的特点。提示TH基因的过度表达可能是高血压肝阳上亢证的分子机理。
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Study on Molecular Mechanism of Ganyang Shangkang Syndrome in Hypertension
JIN Yiqiang HU Suiyu YAN Donghong et al
(Institute of Integrated TCM and Western Medicine, Hunan Medical University, Changsha (410008))
Objective: To investigate the molecular mechanism of Ganyang Shangkang (Liver Yang ascending, GYSK) syndrome in hypertension. Methods: The plasma norepinephrine (NE), epinephrine (E) contents in patients with GYSK syndrome or Ganshen Yinxu (Liver and Kidney Yin Deficiency, GSYX) syndrome who were suffered from hypertension, and normal controls were determined by high performance liquid chromatography-electrochemical detector (HPLC-ECD). The polymorphism of tyrosine hydroxylase (TH) gene in the three groups were analyzed by Southern Blot assay. The polymorphism of TH and MAOA， MAOB gene microsatellite in these groups were analyzed by polymerase chain reaction (PCR)-SSCP; meanwhile, the GYSK model by administration of single TCM preparation, Radix Aconiti preparate (RAP) in spontaneous hypertension rats (SHR). The adrenal gland medulla were examined for their TH expression at the protein level after ABC immuno histochemical staining with the TH monoclonal antibody (McAb). The adrenal TH gene mRNA expression was demonstrated by in situ hybridization with the synthesized TH oligonucleic acid probe. The results of immunohistochemistry and in situ hybridization were analyzed with the image analysis system (IAS). Results: The plasma NE, E contents in patients with GYSK were more significantly increased than that in GSYX and normal controls. The TH gene amplified and the type A1 TH microsatellite D11S4046 was increased more remarkably than other groups. The TH mRNA protein expression in their adrenal tissue of the single TCM preparation RAP induced GYSK model in SHR were elevated. Conclusions: The GYSK syndrome of hypertension possesses the character as amplified TH gene and increased TH mRNA and protein. It suggested that the hyperexpression of TH is probably the mechanism of GYSK syndrome in hypertension
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Key words hypertension, Ganyang Shangkang syndrome, tyrosine hydroxylase, molecular mechanism
肝阳上亢证是中医肝病主要证型之一，多见于高血压病(1)，其病理生理学基础已有较深入的研究(2，3)，但未见有关该证分子水平研究的报道。本研究在以往研究基础上探讨高血压肝阳上证的分子机理。
临床研究
1 临床资料 病例选自湖南医科大学附属湘雅医院，湖南省隆回县、绥宁县、新宁县、双牌县人民医院1997年10月～1998年5月的门诊和住院患者。采用病证结合方式选择研究对象100例。高血压病诊断标准按文献(4)，中医辨证标准参照文献(5)，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期78例；肝阳上亢证70例，其中男38例，女32例；年龄38～75岁，平均(54.68±12.26)岁；肝肾阴虚证30例，其中男11例，女19例；年龄40～74岁，平均(59.67±8.83)岁；健康对照组选自本院职工及长沙市中心血站首次献血者，共30名，其中男14名，女16名；年龄29～65岁，平均(51.25±8.61)岁；经病史查询、体检、血象、胸透及心、肝、肾检查未发现异常。
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2 方法
2.1 血样采集 受试者于清晨6：00～8：00空腹抽取肘静脉血，抽血前先休息15～30min，禁服影响单胺类代谢的血管活性药物及食物如香蕉、菠萝等。采血5ml，于4℃ 1000r/min离心20min，收集上清，存于-70℃冰箱中待测血浆去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)；同时，另取2ml血用肝素抗凝，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，留作DNA提取。
2.2 NE、E的测定 采用Eisenhofer(6)方法。仪器用高效液相色谱仪(日本岛津公司产，LC-9A型)及电化学检测器(日本岛津公司产，L-ECD-6A型)。
2.3 DNA提取及Southern Blot分析 参照文献(7)。
2.4 高血压病肝阳上亢证酪氨酸羟化酶(TH)及单胺氧化酶(MAO)微卫星多态性分析 采用PCR-SSCP方法，参照文献(8)。
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2.5 统计学处理 计量资料结果用
±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。3 结果
3.1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆NE、E测定结果比较 见表1。说明肝阳上亢证组血浆NE、E明显高于健康人组和肝肾阴虚证组。
表1 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组血浆
NE、E测定结果 (pmol/L，
±s) 组 别n
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NE
E
健康人
30
1997.0±139.1
824.2±?61.3
肝阳上亢证
70
3922.4±716.7*△
1365.6±283.8*△
肝肾阴虚证
30
, 百拇医药
2271.3±360.3
773.1±135.7
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
3.2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组TH基因Southern Blot杂交信号经MIAS300图像分析系统分析后结果比较 见表2。说明肝阳上亢证组TH基因扩增信号较其他两组明显增强。
表2 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾阴虚证组
TH基因杂交信号 (
±s) 组 别n
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TH cDNA杂交信号扫描
健康人
10
128.63±17.63
肝阳上亢证
27
310.33±24.55*△
肝肾阴虚证
18
187.77±21.03
注：与健康人组比较，*P<0.05；与肝肾阴虚证组比较，△P<0.05
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3.3 TH基因相关微卫星D11S4046位点扩增，检测出3种微卫星多态性A1、A2、A3，见图1。其在肝阳上亢证、肝肾阴虚证和健康人组分布，见表3。说明肝阳上亢证组TH相关微卫星D11S4046中A1型明显增加。
表3 健康人组、肝阳上亢证组及肝肾
阴虚证组D11S4046多态性分布 组别
n
A1
A2
A3
健康人
, 百拇医药
23
12(0.522)*
8(0.348)
3(0.130)
肝阳上亢证
37
26(0.703)
6(0.162)
5(0.135)
肝肾阴虚证
30
11(0.367)*
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10(0.333)
9(0.300)
注：与肝阳上亢证组比较，*P<0.05；( )内为基因频率
图1 TH基因微卫星D11S4046
多态性分3型(A1，A2，A3)
3.4 MAOA基因相关微卫星DXS6810有3种多态性改变B1、B2、B3，见图2。其分布频率在健康人、肝阳上亢证及肝肾阴虚证3组间差异无显著性意义(P>0.05)。
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图2 MAOA基因微卫星DXS6810
多态性分3型(B1，B2，B3)
3.5 MAOB基因相关微卫星DXS993亦有3种基因型，见图3。3组间分布频率差异无显著性意义(P>0.05)。
图3 MAOB基因微卫星DXS993
多态性分3型(C1，C2，C3)
实验研究
1 实验动物 正常Wistar大鼠10只，雌雄各半。3月龄，体重180～210g。由湖南医科大学实验动物中心提供；自发性高血压大鼠36只，雌雄各半，3月龄，体重180～210g，购自北京中国医学科学院阜外心血管病医院实验动物中心。
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2 中药及制备 (1)附子汤：由单味制附子20g煎两次后，将药液合并浓缩为每毫升药液含0.1g生药。(2)潜阳方：由石决明、钩藤、黄芩、桑寄生、葛根、川牛膝等组成。煎两次后将药液合并浓缩为每毫升药液含1g生药。
3 主要试剂及仪器 试剂：酪氨酸羟化酶单克隆抗体(一抗，鼠抗)：购自德国宝灵曼公司；TH寡核苷酸探针：由上海生物工程公司合成，其序列为：5’-CCTGCTTGGCATCCTGCTCTGAGA-3’；即用型ABC试剂盒：购自华美生物工程公司。NE、E、DHBA(内标)标准品均购自Sigma公司；微卫星引物设计均采用网上查阅：http://www.gdb.org/gdb-bin/genera。仪器：超低温冰箱(SANYO牌，日本产)；恒温冷冻切片机(SLEEMAINZ型，德国产)；高速台式离心机(5415C型，德国产)；显微镜(Olympus型，日本产)；图像分析系统(MIAS-300型，美国产)。
4 方法
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4.1 自发性高血压大鼠(SHR)肝阳上亢证模型的复制 选用SHR加灌附子汤的方法造模(9)，每天20ml/kg体重灌胃，相当每天生药2g/kg体重，共4周。
4.2 动物分组与给药方法 (1)正常对照组(简称正常组，10只)：正常Wistar大鼠，普通饲养，不做处理。(2)自发性高血压组(简称SHR，8只)：SHR灌蒸馏水6周。(3)附子汤造模组(简称肝阳上亢组，8只)：SHR灌服附子汤4周，造模后不予治疗，从第5周开始灌服蒸馏水2周。(4)潜阳方治疗组(简称潜阳方组，10只)：SHR大鼠，灌服附子汤4周，第5周开始灌服中药潜阳方2周，每日灌服潜阳方煎剂20ml/kg，相当每天生药20g/kg体重，按动物体表面积系数折算，相当70kg成人临床剂量的1.9倍。
4.3 观测项目及检测方法
4.3.1 实验动物肾上腺组织TH蛋白质测定 采用免疫组织化学方法，参照文献(10)。
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4.3.2 实验动物肾上腺组织TH mRNA表达 采用原位杂交方法，参照文献(11)。以上Southern Blot与TH mRNA及蛋白质表达结果均用MIAS-300型图像分析系统进行分析。
4.4 统计学处理 计量资料结果用
±s表示，各组间比较采用方差分析及q检验，所有检验在SPSS统计软件包上完成，计数资料比较用χ2检验。5 结果
5.1 各组大鼠TH免疫组化阳性产物灰度扫描结果 见表4。灰度值是图像分析系统中用来表示图像透光率的参数。细胞内阳性产物浓度(或杂交信号)越高(深)，则透光率越低，灰度值亦低，反之则越大。肝阳上亢组灰度值最低，明显低于正常组及潜阳方组，均具有显著性差异(P<0.05)。表明肝阳上亢组TH免疫组化阳性产物最浓，即抗TH强阳性，说明TH蛋白水平明显增高；而经潜阳方治疗后，TH免疫组化阳性产物降低，TH蛋白水平下降。
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表4 各组TH免疫组化阳性产物浓度灰度值比较 (
±s) 组 别n
TH免疫组化阳性产物浓度灰度值
正 常
5
63.67±6.48
SHR
5
35.27±4.88**
肝阳上亢
, 百拇医药 5
24.96±8.34**
潜阳方
5
50.96±5.29*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.01
5.2 各组大鼠TH原位杂交信号灰度扫描结果 见表5。肝阳上亢组TH基因原位杂交信号灰度值最低，明显低于正常组、SHR组及潜阳方组，均有显著性差异(P<0.05)；说明肝阳上亢组TH基因mRNA表达最强，TH基因mRNA明显上升，经中药潜阳方治疗后，TH mRNA下降。
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表5 各组大鼠TH原位杂交信号灰度值比较 (
±s) 组 别n
TH原位杂交信号灰度值
正 常
5
72.85±6.17
SHR
5
35.98±6.21**
肝阳上亢
5
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22.16±1.48**
潜阳方
5
48.89±6.03*△
注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与肝阳上亢组比较，△P<0.05
讨论
肝阳上亢证是中医肝病的主要证型之一，历代医家论理精详，平肝潜阳治法，方、药广泛应用于临床；本证的现代研究近10余年已取得很大进展，发现其病理生理学基础为外周交感—肾上腺髓质功能亢进，主要病理环节为外周血浆NE、E含量的增高(2)。儿茶酚胺(CA)包括NE、E、DA，在CA合成过程中，TH是起决定作用的限速酶，调节NE、E的合成。NE、E的含量间接反应TH活性，TH是高血压病因学的候选基因(12)。儿茶酚胺的分解则主要在MAOA和MAOB的作用下完成。本研究结果进一步验证了肝阳上亢证患者血浆NE、E含量明显高于健康人及肝肾阴虚证患者(P<0.05)；同时，经采用Southern Blot分析高血压病患者TH基因多态性，结果显示高血压病肝阳上亢证患者TH基因有明显扩增(P<0.05)。
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微卫星(Microsatellite)即短串联重复序列(short tandem repeat, STR)，在人类基因组中广泛存在，约占真核生物基因组的5%，其基本单位是l～8bp的串联重复，多在基因编码区、内含子及非翻译区附近。人基因组中STR有(GT)n、(CA)n、(GA)n、(AA)n、(GG)n、(CAA)n和(CGG)n等，其中以(CA)n、(GT)n重复序列最多，大约分布着5～10万个散在的具有高度多态杂合性并符合孟德尔遗传的STR，即每30～60kb DNA就存在一个(CA)或(GT)重复序列，STR的产生一般认为是由于DNA复制和修复过程中DNA滑移及细胞分裂过程中染色体不等交换的结果。本研究选用(gdb)基因标准库中微卫星标志，D11S4046为酪氨酸羟化酶基因内含的微卫星标志，DXS6810及DXS993为单胺氧化酶内含的微卫星标志。D11S4046位于11pter-11qter为二核苷酸重复序列，扩增片段最小长度为187bp；DXS6810为四核苷酸重复，杂合度暂时不清楚，扩增最小片段为209bp；DXS993位于Xp11.4～Xp11.3之间，为(CT)n重复，杂合度为0.7921，扩增最长片段为312bp及292bp。本研究发现肝阳上亢证TH基因内含的微卫星D11S4046中A1型明显高于肝肾阴虚证组及健康人组；而MAOA与MAOB基因内含的微卫星标志在上述3组间无显著性差异，说明肝阳上亢证与TH有关，与MAOA及MAOB则关系不大。
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本研究所复制的SHR肝阳上亢证模型具有血压稳定升高，易激惹程度增加，饮水量增加，旋转时间缩短，痛阈降低，肾小动脉硬化等近似人类高血压病肝阳上亢证的特征(9)；取不同组动物的肾上腺组织用免疫组织化学方法和原位杂交法进行TH基因表达研究，结果显示肝阳上亢组大鼠TH免疫组化阳性产物增高；TH基因原位杂交信号明显增强，说明该模型肾上腺组织TH mRNA及蛋白质水平均明显增加，进一步验证了肝阳上亢证与TH的关系。
因此，依据上述各点，笔者认为高血压肝阳上亢证的形成是因TH基因扩增导致TH基因mRNA及蛋白质过度表达，引起TH活性增加，使血浆NE、E增加所致，TH基因的过度表达可能是肝阳上亢证形成的分子机理，今后拟采取异病同证方式选择研究对象，进一步深入研究。
国家自然科学基金资助项目(No.39670890)
谌兵来(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
, 百拇医药
王勇华(湖南医科大学附属湘雅医院中西医结合研究所(长沙 410008))
参考文献
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(收稿：1999-10-20 修回：1999-11-02), http://www.100md.com