内源性表皮生长因子促进深二度烫伤创面愈合的实验研究
作者：刘毅 陈璧
单位：刘毅(兰州军区兰州总医院烧伤整形科，甘肃 兰州 730050)；陈璧(第四军医大学西京医院烧伤外科，陕西 西安 710032)
关键词：烫伤；创面愈合；表皮生长因子
西北国防医学杂志000212 摘要：目的：了解内源性表皮生长因子(EGF)对深二度烫伤创面愈合的作用。方法：采用病理学的技术和方法，分别从大体、组织与细胞水平对比观察摘除(B组)与不摘除(A组)颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程。结果：A组创面愈合率高于B组，其创面愈合时间较B组提前1～3 d；创周表皮细胞增殖也较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌胶原纤维的功能。结论：内源性EGF具有促进小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。了解内源性表皮生长因子(EGF)对深二度烫伤创面愈合的作用。方法：采用病理学的技术和方法，分别从大体、组织与细胞水平对比观察摘除(B组)与不摘除(A组)颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程。结果：A组创面愈合率高于B组，其创面愈合时间较B组提前1～3 d；创周表皮细胞增殖也较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌胶原纤维的功能。结论：内源性EGF具有促进小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。
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中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0112-04
Experimental study about enhancement of endogenous epidermal growth factor on the healing of deep second degree scald wounds in mice
LIU Yi,CHEN Bi.(1.Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050;2.The 4th Military Medical University,710032)
Abstract:Objective:To understand the effect of endogenous epidermal growth factor(EGF) on the healing of deep second degree scald wounds in mice.Methods:The process of deep second degree scald wound healing were comparatively observed in group A(normal mice)and in group B(both submaxillary glands removed)on the level of macropathology,histopathology and cytopathology respectively.Results:Wound healing rate in group A was higher than that in group B and the wound healing time was 1～3 days earlier in group A.More active proliferation of epidermic cells around wounds showed in group A.The function of fibroblasts in wounds,collagen synthesis and secretion,were more vigorous in group A than those in group B.Conclusion:Endogenous EGF could accelerate the healing of deep second degree scald wound in mice.
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Key words:Scald; Wound healing; Epidermal growth factor(EGF)
外源性表皮生长因子(EGF)具有促进深二度烧/烫伤创面愈合的作用已为大量的实验与临床研究所证实[1，2]。近来的研究表明：内源性EGF在外伤创面愈合中具有一定的促进作用[3，4]。但对于深二度烧/烫伤创面愈合，内源性EGF是否也具有同样的作用尚少见文献报道。本实验从创面组织病理学的角度，比较观察了摘除与不摘除颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程，旨在了解内源性EGF对小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物：雄性Balb/c小鼠96只(第四军医大学实验动物中心提供)，体重(20±2) g，实验前1 d脱毛，混合饲料单笼饲养。
, 百拇医药 1.2 实验动物分组：实验动物分为A和B组，每组48只，其中B组于烫伤前7 d行双侧颌下腺摘除术。
1.3 模型建立：采用恒温恒压电烫仪[5]，以80℃，8 s，0.5 kg为致伤条件，在小鼠背部造成直径2.5 cm的深二度烫伤创面；创面经冷疗后打包包扎，定期换药。
1.4 取材与标本处理：分别于烫伤前及烫伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d，每组6只，拉颈活杀取材。
1.4.1 HE染色、VG染色标本：于创面右上象限取材，自肉膜深面连同创周0.5 cm皮肤一起取下，标本大小为0.3 cm×1.0 cm，用10%中性缓冲福尔马林液固定。
1.4.2 电镜标本：于创面左上象限取材，用利刃自创缘切取宽1 mm组织，并修剪成1 mm×2 mm大小，置3%戊二醛混合固定液中固定。
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1.5 观察指标
1.5.1 创面愈合情况及愈合时间：取材前肉眼观察创面情况并记录之。
1.5.2 创面愈合率：创面旁放置一标尺，照相，将创面图象资料输入微机，用图象分析软件PHOTO SHOP予以分析，取得数据。
1.5.3 光镜观察：标本经石蜡包埋、脱水浸蜡、切片，分别行HE染色及VG染色后用普通光镜观察：①创面愈合过程中的创面组织病理；②创面愈合过程中成纤维细胞数：每一切片记录5个不同视野(40×10)中的成纤维细胞数量，计算其平均值。
1.5.4 电镜观察：锇酸后固定2 h，常规漂洗脱水，环氧树脂包埋，切厚片定位，超薄切片(0.5 μm)，铅染色液染色，透射电镜观察。
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1.6 数据处理：所得数据采用方差分析和t检验处理。
2 结果
2.1 创面愈合情况与愈合时间：伤后创面均呈灰白色，稍肿胀，与周围正常组织分界清楚，创面局部皮肤伸展性明显降低，韧性增加。A组：伤后3 d创面呈黄白色，局部干燥，肿胀消退；伤后5～7 d创面较前缩小；伤后10 d痂皮基本完整，表面粗糙，呈浅黄色，创面进一步缩小，揭去痂皮，创缘可见浅白色菲薄上皮组织；伤后14 d创面明显缩小，痂皮变厚变硬，呈浅黄褐色，但仍完整，揭去痂皮，见大部分创面已上皮化，创面呈花斑状；伤后21～23 d，痂皮与创面分离，创面完全被上皮覆盖；伤后28 d，局部皮肤呈浅红色，触之较硬，出现散在、分布不均匀的被毛。B组：其愈合过程基本同上，但创面完成上皮化的时间较A组晚1～3 d。A、B两组创面愈合时间分别为(22.00±0.89) d与(24.67±0.81) d。
2.2 创面愈合率：致伤后创面面积为4.91 cm2，伤后23 dA组创面均愈合，愈合率达100%，B组创面至伤后26 d其愈合率方达100%(图1)。
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图1 创面愈合率(
±s，n＝4)
2.3 光镜观察
2.3.1 HE染色与VG染色：伤后1 d，两组均显示表皮及真皮浅层凝固性坏死，轮廓尚存；真皮深层毛囊结构尚好；纤维结缔组织结构疏松，其间散在扩张充血的毛细血管及大量中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。伤后3 d，A组创周表皮及毛囊上皮出现轻度反应性增生。伤后5 d，纤维结缔组织与毛细血管呈小灶性增生；A组创周表皮反应性增生，角质层增厚，棘细胞层增生肥厚，上皮钉突下伸；B组创周表皮出现轻度增生。伤后7 d，A组纤维结缔组织及毛细血管呈片状显著增生，其间散在中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，创周表皮增生肥厚；B组创周表皮反应性增生，角质层增厚，部分创面棘细胞层增生，可见少量上皮钉突下伸，纤维结缔组织及毛细血管呈层状增生。伤后10～14 d，两组创周表皮增生较前更明显。伤后21 d，A组创面表面覆盖薄层鳞状上皮，纤维结缔组织厚度较前薄，但结构致密；B组创面覆盖不连续薄层鳞状上皮，纤维结缔组织也较前变薄。伤后28 d，A组表皮肥厚，角化过度，颗粒细胞层约6～8层，棘细胞层约5～8层，上皮钉突下伸，真皮层纤维结缔组织排列致密，毛细血管少见；B组创面为连续鳞状上皮所覆盖，厚度较前增加，可见上皮钉突下伸，真皮层纤维结缔组织致密，毛细血管也不多见。
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2.3.2 成纤维细胞数：A、B两组伤后各时间点成纤维细胞数均与正常对照组有显著差异(P<0.05)；A组与B组相比，伤后14 d两组存在差异(P<0.05)(图2)。
图2 创面愈合过程中成纤维细胞数
2.3.3 电镜观察：A组：伤后7 d，表皮细胞仅1～2层，其形态扁长不规则，核与胞浆结构与正常表皮细胞基本相同；成纤维细胞数量增多，大小不一；细胞核肥大，呈椭圆型或不规则状，核染色质丰富，浓密成块，核仁清楚；胞浆中粗面内质网发达，核糖体增多，线粒体肿大且数量增加；部分成纤维细胞显示内质网扩张，胞浆中及周围有多量胶元纤维分布；巨噬细胞及中性粒细胞吞噬功能活跃，胞质中有较多溶酶体分布。伤后14 d，表皮细胞层变厚，细胞间隙如常，可见桥粒连接；核呈圆形，核染色质较正常丰富，核仁清楚；胞浆中内质网扩张，线粒体肿大且数量增多，并可见较多糖元颗粒；多数成纤维细胞仍呈现旺盛的分泌合成功能，部分细胞体积变小，胞浆中内质网及核糖体减少，但可见呈束状排列的胶元原纤维；胞外胶元纤维密集，分布紊乱，纤维表面可见明暗交替的周期性纹理；伤后21 d，表皮层厚度与正常相仿，表面可见薄层角质，其下分布着大小不一的透明脂质体，细胞排列有序，间隙清楚，桥粒连接多见，并可见半桥粒连接；基底细胞核圆，染色质丰富，核仁清楚；胞浆中内质网与线粒体数量多，并见多量糖原颗粒与张力原纤维；成纤维细胞数量稍减少，核呈圆或椭圆形，其结构与正常皮肤近似；胞浆中内质网、线粒体及核糖体数量均减少，无明显胶元成分可见，少数成纤维细胞呈典型凋亡形态改变，并可见凋亡小体；胶元纤维致密，排列无规律，其间可见小片状胶元溶解区。B组：伤后7 d，可见数量较少的单层表皮细胞，核呈圆或椭圆，染色质量适中，分布如常，核仁清楚，胞浆中细胞器数量与正常表皮细胞无明显差别；成纤维细胞超微结构显示内质网、核糖体及线粒体数量较对照多，胞质中可见少量胶元成分，但胞外胶元纤维欠密集，排列无序；巨噬细胞与中性粒细胞数目较多。伤后14 d，表皮细胞2～3层，细胞间隙正常，有桥粒连接；成纤维细胞也显示较旺盛的合成功能，胞外胶元分布紊乱，并可见胶元溶解灶。伤后21 d，表皮细胞3～4层，形态同A组；成纤维细胞形态与A组相似。
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3 讨论
组织修复的基本过程受多肽生长因子的调控。生长因子不仅影响炎症细胞与组织修复细胞的趋化活性，同时也调控着修复细胞的增殖与分化。此外，还通过直接与间接方式控制细胞外基质的合成与分解代谢[6]。大量的实验和临床应用研究已经证明外源性EGF具有确切的促进创面愈合作用。Noguchi[7]发现：接受颌下腺摘除术的小鼠其创面愈合速度较未切除者明显减慢，此时若在局部应用EGF(1μg*ml-1)，则创面愈合速度会恢复到对照组水平。由此表明，内源性EGF在创面愈合中也具有一定的促进作用，并再次证实了外源性EGF的作用。
深二度烧/烫伤创面的修复也遵循创面修复的一般规律，经历炎症反应、细胞增殖和细胞外基质合成以及再上皮化等相互关联的过程。其涉及局部活性生长因子、一系列血清酶、循环血小板与单核细胞、组织巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮细胞、局部组织微循环及其交互作用。由于深二度烧/烫伤创面具有坏死组织痂皮形成与脱痂等不同于一般创面的特点，目前初步认为外源性EGF同样具有促进烧/烫伤创面愈合的作用；至于内源性EGF在深二度烫伤创面愈合中发挥什么作用至今尚少见文献报道。颌下腺乃小鼠合成与分泌内源性EGF的主要器官，小鼠内源性EGF的80%来自颌下腺，因此，颌下腺摘除术已成为目前公认的研究内源性EGF体内作用的实验手段[7，8]。故本实验通过对比观察摘除与不摘除颌下腺的深二度烫伤创面愈合过程中大体—组织—细胞水平的改变，探索了内源性EGF在深二度烫伤创面愈合过程中的作用。
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实验结果显示：A组在创面愈合过程中各时间点的平均剩余创面面积均小于B组，创面愈合率则高于B组，其实验动物创面愈合时间较B组提前1～3 d。两组在伤后1～3 d的创面组织病理学改变相似，均可见坏死的真皮胶元纤维肿胀、融合，原纤维结构消失；痂下组织充血水肿，其间有大量中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润，并以坏死组织与存活组织之间较为集中，其中巨噬细胞显示出异常活跃的吞噬功能。成纤维细胞数量由于局部真皮组织损伤而较正常皮肤(A组32.2±4.6；B组29.80±7.16)显著减少(A组14.80±3.42；B组15.00±4.06)，两组间无明显差异(P>0.05)。A、B两组分别于伤后3 d和5 d进入细胞增殖状态，并于伤后5 d其成纤维细胞数量较对照组明显增加(P<0.01)，伤后14 d其细胞数量均达到最高值，继而于伤后21 d下降至A组84.00±8.80，B组82.60±5.77，两组间除伤后14 d外，其余各时间点细胞数量无明显差别(P>0.05)。A组自伤后3 d即可见创周皮缘表皮及毛囊上皮出现轻度反应性增生，并逐渐增强，至伤后21 d创面完全被薄层鳞状上皮覆盖，伤后28 d其表皮厚度较正常皮肤明显肥厚，并可见假上皮瘤样增生现象，而真皮层较正常皮肤薄，但组织结构无明显差别，这也许就是为什么小鼠深二度烫伤创面愈合后无增生性瘢痕形成而局部却有高于皮面类似增生性瘢痕的硬结存在的原因；B组于伤后5 d开始出现创周表皮反应性增生，伤后21 d创面由不连续薄层鳞状上皮覆盖，至伤后28 d创面完全上皮化，其细胞层数明显少于A组，但多于正常皮肤。电镜检查发现伤后7～14 d，A组创周表皮细胞增殖较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌功能，细胞内有较多胶元原纤维分布，细胞外有大量胶元纤维沉积。
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众所周知，表皮细胞与成纤维细胞均为EGF的靶细胞，其表面拥有数万个表皮生长因子受体(EGFR)[9]，EGF发挥其生物学作用的关键是首先与靶细胞表面EGFR的具有酪氨酸蛋白激酶活性的结构域结合，借助蛋白激酶对其胞内底物相应残基的磷酸化来实现将EGF的信号转化为细胞内信号。因此，小鼠体内合成EGF的主要器官颌下腺被切除后体内EGF含量大大下降，使表皮细胞和成纤维细胞结合EGF的数量减少，从而导致表皮细胞增殖及成纤维细胞合成胶元的功能减弱，并由此而影响到创面胶元的沉积与肉芽组织的形成，延缓了创面再上皮化进程，使创面愈合的速度减慢。本实验结果表明：在小鼠深二度烫伤创面愈合过程中，内源性EGF在刺激创面成纤维细胞及创缘表皮细胞增殖，从而促进胶原纤维的合成与分泌及创面再上皮化中具有一定作用。
作者简介：刘毅(1964—)，男，博士，副主任医师
参考文献：
[1]Reim M,Kehrer T,Lund M.Clinical application of epidermal growth factor in patients with most severe eye burns[J].Ophthal,1988,197(4):179-184.
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[2]Singh G,Foster CS.Epidermal growth factor in alkali burns corneal epithelial wound healing[J].Am J Ophthal,1987,103(6):302-307.
[3]Olsen PS,Poulsen SS,Thorkelsen K.Effect of sialoadenectomy and synthetic human urogastrone on healing of chronic gastric ulcers in rats[J].Gut,1986,27:1443-1448.
[4]Wingren U,Brown TH,Watkins BM.Delayed gastric ulcer healing after extirpation of submandibular glands is sex-dependent[J].Scand J Gastroenterol,1989,124:1102-1107.
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[5]刘 毅，陈 璧，于 晟.烧(烫)伤动物模型的建立.西北国防医学杂志[J].1999，20(2)：126-128.
[6]付小兵，盛志勇.软组织创伤修复基础研究的现状与展望[J].解放军医学杂志，1997，22(1)：12-13.
[7]Dimitry MD,Brian DR,John ET.Growth factors in porcine full and partial thickness burn repair[J].Am J Pathol,1995,147(5):1261-1277.
[8]刘俊龙，张素贞，孙家玲.表皮生长因子的制备和促进伤口愈合的实验研究[J].第二军医大学学报，1991，12(2)：132-135.
[9]Anne B,Jeffrey MD,Craig D.Epidermal growth factor increases granulation tissue formation dose dependently[J].J Surg Res,1987,43(2):322-328.
收稿日期：1999-11-16 修回：1999-12-02, 百拇医药
单位：刘毅(兰州军区兰州总医院烧伤整形科，甘肃 兰州 730050)；陈璧(第四军医大学西京医院烧伤外科，陕西 西安 710032)
关键词：烫伤；创面愈合；表皮生长因子
西北国防医学杂志000212 摘要：目的：了解内源性表皮生长因子(EGF)对深二度烫伤创面愈合的作用。方法：采用病理学的技术和方法，分别从大体、组织与细胞水平对比观察摘除(B组)与不摘除(A组)颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程。结果：A组创面愈合率高于B组，其创面愈合时间较B组提前1～3 d；创周表皮细胞增殖也较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌胶原纤维的功能。结论：内源性EGF具有促进小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。了解内源性表皮生长因子(EGF)对深二度烫伤创面愈合的作用。方法：采用病理学的技术和方法，分别从大体、组织与细胞水平对比观察摘除(B组)与不摘除(A组)颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程。结果：A组创面愈合率高于B组，其创面愈合时间较B组提前1～3 d；创周表皮细胞增殖也较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌胶原纤维的功能。结论：内源性EGF具有促进小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。
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中图分类号：R 644 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)02-0112-04
Experimental study about enhancement of endogenous epidermal growth factor on the healing of deep second degree scald wounds in mice
LIU Yi,CHEN Bi.(1.Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730050;2.The 4th Military Medical University,710032)
Abstract:Objective:To understand the effect of endogenous epidermal growth factor(EGF) on the healing of deep second degree scald wounds in mice.Methods:The process of deep second degree scald wound healing were comparatively observed in group A(normal mice)and in group B(both submaxillary glands removed)on the level of macropathology,histopathology and cytopathology respectively.Results:Wound healing rate in group A was higher than that in group B and the wound healing time was 1～3 days earlier in group A.More active proliferation of epidermic cells around wounds showed in group A.The function of fibroblasts in wounds,collagen synthesis and secretion,were more vigorous in group A than those in group B.Conclusion:Endogenous EGF could accelerate the healing of deep second degree scald wound in mice.
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Key words:Scald; Wound healing; Epidermal growth factor(EGF)
外源性表皮生长因子(EGF)具有促进深二度烧/烫伤创面愈合的作用已为大量的实验与临床研究所证实[1，2]。近来的研究表明：内源性EGF在外伤创面愈合中具有一定的促进作用[3，4]。但对于深二度烧/烫伤创面愈合，内源性EGF是否也具有同样的作用尚少见文献报道。本实验从创面组织病理学的角度，比较观察了摘除与不摘除颌下腺小鼠深二度烫伤创面的愈合过程，旨在了解内源性EGF对小鼠深二度烫伤创面愈合的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物：雄性Balb/c小鼠96只(第四军医大学实验动物中心提供)，体重(20±2) g，实验前1 d脱毛，混合饲料单笼饲养。
, 百拇医药 1.2 实验动物分组：实验动物分为A和B组，每组48只，其中B组于烫伤前7 d行双侧颌下腺摘除术。
1.3 模型建立：采用恒温恒压电烫仪[5]，以80℃，8 s，0.5 kg为致伤条件，在小鼠背部造成直径2.5 cm的深二度烫伤创面；创面经冷疗后打包包扎，定期换药。
1.4 取材与标本处理：分别于烫伤前及烫伤后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d和21 d，每组6只，拉颈活杀取材。
1.4.1 HE染色、VG染色标本：于创面右上象限取材，自肉膜深面连同创周0.5 cm皮肤一起取下，标本大小为0.3 cm×1.0 cm，用10%中性缓冲福尔马林液固定。
1.4.2 电镜标本：于创面左上象限取材，用利刃自创缘切取宽1 mm组织，并修剪成1 mm×2 mm大小，置3%戊二醛混合固定液中固定。
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1.5 观察指标
1.5.1 创面愈合情况及愈合时间：取材前肉眼观察创面情况并记录之。
1.5.2 创面愈合率：创面旁放置一标尺，照相，将创面图象资料输入微机，用图象分析软件PHOTO SHOP予以分析，取得数据。
1.5.3 光镜观察：标本经石蜡包埋、脱水浸蜡、切片，分别行HE染色及VG染色后用普通光镜观察：①创面愈合过程中的创面组织病理；②创面愈合过程中成纤维细胞数：每一切片记录5个不同视野(40×10)中的成纤维细胞数量，计算其平均值。
1.5.4 电镜观察：锇酸后固定2 h，常规漂洗脱水，环氧树脂包埋，切厚片定位，超薄切片(0.5 μm)，铅染色液染色，透射电镜观察。
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1.6 数据处理：所得数据采用方差分析和t检验处理。
2 结果
2.1 创面愈合情况与愈合时间：伤后创面均呈灰白色，稍肿胀，与周围正常组织分界清楚，创面局部皮肤伸展性明显降低，韧性增加。A组：伤后3 d创面呈黄白色，局部干燥，肿胀消退；伤后5～7 d创面较前缩小；伤后10 d痂皮基本完整，表面粗糙，呈浅黄色，创面进一步缩小，揭去痂皮，创缘可见浅白色菲薄上皮组织；伤后14 d创面明显缩小，痂皮变厚变硬，呈浅黄褐色，但仍完整，揭去痂皮，见大部分创面已上皮化，创面呈花斑状；伤后21～23 d，痂皮与创面分离，创面完全被上皮覆盖；伤后28 d，局部皮肤呈浅红色，触之较硬，出现散在、分布不均匀的被毛。B组：其愈合过程基本同上，但创面完成上皮化的时间较A组晚1～3 d。A、B两组创面愈合时间分别为(22.00±0.89) d与(24.67±0.81) d。
2.2 创面愈合率：致伤后创面面积为4.91 cm2，伤后23 dA组创面均愈合，愈合率达100%，B组创面至伤后26 d其愈合率方达100%(图1)。
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图1 创面愈合率(
±s，n＝4)2.3 光镜观察
2.3.1 HE染色与VG染色：伤后1 d，两组均显示表皮及真皮浅层凝固性坏死，轮廓尚存；真皮深层毛囊结构尚好；纤维结缔组织结构疏松，其间散在扩张充血的毛细血管及大量中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。伤后3 d，A组创周表皮及毛囊上皮出现轻度反应性增生。伤后5 d，纤维结缔组织与毛细血管呈小灶性增生；A组创周表皮反应性增生，角质层增厚，棘细胞层增生肥厚，上皮钉突下伸；B组创周表皮出现轻度增生。伤后7 d，A组纤维结缔组织及毛细血管呈片状显著增生，其间散在中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，创周表皮增生肥厚；B组创周表皮反应性增生，角质层增厚，部分创面棘细胞层增生，可见少量上皮钉突下伸，纤维结缔组织及毛细血管呈层状增生。伤后10～14 d，两组创周表皮增生较前更明显。伤后21 d，A组创面表面覆盖薄层鳞状上皮，纤维结缔组织厚度较前薄，但结构致密；B组创面覆盖不连续薄层鳞状上皮，纤维结缔组织也较前变薄。伤后28 d，A组表皮肥厚，角化过度，颗粒细胞层约6～8层，棘细胞层约5～8层，上皮钉突下伸，真皮层纤维结缔组织排列致密，毛细血管少见；B组创面为连续鳞状上皮所覆盖，厚度较前增加，可见上皮钉突下伸，真皮层纤维结缔组织致密，毛细血管也不多见。
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2.3.2 成纤维细胞数：A、B两组伤后各时间点成纤维细胞数均与正常对照组有显著差异(P<0.05)；A组与B组相比，伤后14 d两组存在差异(P<0.05)(图2)。
图2 创面愈合过程中成纤维细胞数
2.3.3 电镜观察：A组：伤后7 d，表皮细胞仅1～2层，其形态扁长不规则，核与胞浆结构与正常表皮细胞基本相同；成纤维细胞数量增多，大小不一；细胞核肥大，呈椭圆型或不规则状，核染色质丰富，浓密成块，核仁清楚；胞浆中粗面内质网发达，核糖体增多，线粒体肿大且数量增加；部分成纤维细胞显示内质网扩张，胞浆中及周围有多量胶元纤维分布；巨噬细胞及中性粒细胞吞噬功能活跃，胞质中有较多溶酶体分布。伤后14 d，表皮细胞层变厚，细胞间隙如常，可见桥粒连接；核呈圆形，核染色质较正常丰富，核仁清楚；胞浆中内质网扩张，线粒体肿大且数量增多，并可见较多糖元颗粒；多数成纤维细胞仍呈现旺盛的分泌合成功能，部分细胞体积变小，胞浆中内质网及核糖体减少，但可见呈束状排列的胶元原纤维；胞外胶元纤维密集，分布紊乱，纤维表面可见明暗交替的周期性纹理；伤后21 d，表皮层厚度与正常相仿，表面可见薄层角质，其下分布着大小不一的透明脂质体，细胞排列有序，间隙清楚，桥粒连接多见，并可见半桥粒连接；基底细胞核圆，染色质丰富，核仁清楚；胞浆中内质网与线粒体数量多，并见多量糖原颗粒与张力原纤维；成纤维细胞数量稍减少，核呈圆或椭圆形，其结构与正常皮肤近似；胞浆中内质网、线粒体及核糖体数量均减少，无明显胶元成分可见，少数成纤维细胞呈典型凋亡形态改变，并可见凋亡小体；胶元纤维致密，排列无规律，其间可见小片状胶元溶解区。B组：伤后7 d，可见数量较少的单层表皮细胞，核呈圆或椭圆，染色质量适中，分布如常，核仁清楚，胞浆中细胞器数量与正常表皮细胞无明显差别；成纤维细胞超微结构显示内质网、核糖体及线粒体数量较对照多，胞质中可见少量胶元成分，但胞外胶元纤维欠密集，排列无序；巨噬细胞与中性粒细胞数目较多。伤后14 d，表皮细胞2～3层，细胞间隙正常，有桥粒连接；成纤维细胞也显示较旺盛的合成功能，胞外胶元分布紊乱，并可见胶元溶解灶。伤后21 d，表皮细胞3～4层，形态同A组；成纤维细胞形态与A组相似。
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3 讨论
组织修复的基本过程受多肽生长因子的调控。生长因子不仅影响炎症细胞与组织修复细胞的趋化活性，同时也调控着修复细胞的增殖与分化。此外，还通过直接与间接方式控制细胞外基质的合成与分解代谢[6]。大量的实验和临床应用研究已经证明外源性EGF具有确切的促进创面愈合作用。Noguchi[7]发现：接受颌下腺摘除术的小鼠其创面愈合速度较未切除者明显减慢，此时若在局部应用EGF(1μg*ml-1)，则创面愈合速度会恢复到对照组水平。由此表明，内源性EGF在创面愈合中也具有一定的促进作用，并再次证实了外源性EGF的作用。
深二度烧/烫伤创面的修复也遵循创面修复的一般规律，经历炎症反应、细胞增殖和细胞外基质合成以及再上皮化等相互关联的过程。其涉及局部活性生长因子、一系列血清酶、循环血小板与单核细胞、组织巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮细胞、局部组织微循环及其交互作用。由于深二度烧/烫伤创面具有坏死组织痂皮形成与脱痂等不同于一般创面的特点，目前初步认为外源性EGF同样具有促进烧/烫伤创面愈合的作用；至于内源性EGF在深二度烫伤创面愈合中发挥什么作用至今尚少见文献报道。颌下腺乃小鼠合成与分泌内源性EGF的主要器官，小鼠内源性EGF的80%来自颌下腺，因此，颌下腺摘除术已成为目前公认的研究内源性EGF体内作用的实验手段[7，8]。故本实验通过对比观察摘除与不摘除颌下腺的深二度烫伤创面愈合过程中大体—组织—细胞水平的改变，探索了内源性EGF在深二度烫伤创面愈合过程中的作用。
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实验结果显示：A组在创面愈合过程中各时间点的平均剩余创面面积均小于B组，创面愈合率则高于B组，其实验动物创面愈合时间较B组提前1～3 d。两组在伤后1～3 d的创面组织病理学改变相似，均可见坏死的真皮胶元纤维肿胀、融合，原纤维结构消失；痂下组织充血水肿，其间有大量中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润，并以坏死组织与存活组织之间较为集中，其中巨噬细胞显示出异常活跃的吞噬功能。成纤维细胞数量由于局部真皮组织损伤而较正常皮肤(A组32.2±4.6；B组29.80±7.16)显著减少(A组14.80±3.42；B组15.00±4.06)，两组间无明显差异(P>0.05)。A、B两组分别于伤后3 d和5 d进入细胞增殖状态，并于伤后5 d其成纤维细胞数量较对照组明显增加(P<0.01)，伤后14 d其细胞数量均达到最高值，继而于伤后21 d下降至A组84.00±8.80，B组82.60±5.77，两组间除伤后14 d外，其余各时间点细胞数量无明显差别(P>0.05)。A组自伤后3 d即可见创周皮缘表皮及毛囊上皮出现轻度反应性增生，并逐渐增强，至伤后21 d创面完全被薄层鳞状上皮覆盖，伤后28 d其表皮厚度较正常皮肤明显肥厚，并可见假上皮瘤样增生现象，而真皮层较正常皮肤薄，但组织结构无明显差别，这也许就是为什么小鼠深二度烫伤创面愈合后无增生性瘢痕形成而局部却有高于皮面类似增生性瘢痕的硬结存在的原因；B组于伤后5 d开始出现创周表皮反应性增生，伤后21 d创面由不连续薄层鳞状上皮覆盖，至伤后28 d创面完全上皮化，其细胞层数明显少于A组，但多于正常皮肤。电镜检查发现伤后7～14 d，A组创周表皮细胞增殖较B组活跃，创面成纤维细胞较B组呈现出更旺盛的合成与分泌功能，细胞内有较多胶元原纤维分布，细胞外有大量胶元纤维沉积。
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众所周知，表皮细胞与成纤维细胞均为EGF的靶细胞，其表面拥有数万个表皮生长因子受体(EGFR)[9]，EGF发挥其生物学作用的关键是首先与靶细胞表面EGFR的具有酪氨酸蛋白激酶活性的结构域结合，借助蛋白激酶对其胞内底物相应残基的磷酸化来实现将EGF的信号转化为细胞内信号。因此，小鼠体内合成EGF的主要器官颌下腺被切除后体内EGF含量大大下降，使表皮细胞和成纤维细胞结合EGF的数量减少，从而导致表皮细胞增殖及成纤维细胞合成胶元的功能减弱，并由此而影响到创面胶元的沉积与肉芽组织的形成，延缓了创面再上皮化进程，使创面愈合的速度减慢。本实验结果表明：在小鼠深二度烫伤创面愈合过程中，内源性EGF在刺激创面成纤维细胞及创缘表皮细胞增殖，从而促进胶原纤维的合成与分泌及创面再上皮化中具有一定作用。
作者简介：刘毅(1964—)，男，博士，副主任医师
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收稿日期：1999-11-16 修回：1999-12-02, 百拇医药