QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的影响
作者：王丽娟 贾彦 张沈丽 孟文芳 邱丽萍 李金鸣
单位：王丽娟(齐齐哈尔医学院药理教研室，齐齐哈尔，161042)；王丽娟 贾彦 张沈丽 孟文芳 邱丽萍 李金鸣(中国医科大学基础医学院药理学教研室，沈阳 110001)
关键词：QT，钙离子电流，充血性心力衰竭，膜片钳制技术
中国海洋药物000203 摘要 应用全细胞膜片钳制技术观察了QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流(ICa)的影响。结果显示：QT能明显增加心室肌细胞的Ca2+内流，使ICa增大。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响。在指令电位0 mV时，浓度为500mg.L-1、1g.L-1、2g.L-1的QT分别使ICa增加9.5%、29.3%和52.3%(分别P<0.10、P<0.05、P<0.01)，EC50约1g.L-1。QT对ICa的作用具有可复性。上述结果揭示：QT以电压依赖和浓度依赖的方式增加心肌细胞的Ca2+内流，此作用可能是其治疗充血性心力衰竭的机制之一。
, 百拇医药
EFFECTS OF CHITOSAN ON CALCIUM CURRENT IN SINGLE VENTRICULAR CELLS OF GUINEA PIGS
Wang Lijuan，Jia Yan，Zhang Shenli,et al
(Department of Pharmacology, China Medical University, Shenyang 110001)
ABSTRACT With patch clamp method,the effects of QT on slow inward calcium current(ICa) were investigated in single ventricular cells of guinea pigs. QT 0.5、1.0、2.0g.L-1reased ICa by 9.5%、29.3% and 52.3%,respectively, EC50and maximal effective concentration was near 1.0g.L-1and 2.5g.L-1.QT reased ICa in a dose-and voltage-dependent mode, but had little effect on reversal potential.Those results show QT can open the calaium channel of ventricular cells.
, 百拇医药
KEY WORDS QT calcium current (ICa)，Congestive heart failure (CHF)，Patch clamp method.
QT(暂用此代号)，主要来自于海洋生物蟹和虾的壳中，是一种天然高分子多聚糖，能溶于水。近年来的研究表明，本类高分子物质具有抗菌、解毒、调节免疫功能、促进组织修复等作用，在治疗烧伤、创伤、抗肿瘤等方面具有明显的疗效[1、2]。临床试用还发现QT对治疗心衰有一定疗效，但机制尚不清楚，本文应用全细胞膜片钳制技术观察了QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞分离
豚鼠，体重325±38g，雌雄兼用。用戊巴比妥钠(50mg.kg-1)麻醉后开胸，在人工呼吸机辅助下行主动脉插管，迅速取出心脏，置于Langandoff灌流装置上，在37℃恒温及供氧条件下，先用普通台氏液及无钙台氏液分别灌流5min，然后换成含胶原酶(Yakult,Japan,4mg/40ml)的无钙台氏液循环灌流10～20min,再用KB液冲洗终止消化。取下心脏，剪碎心室肌并稍加振荡，经滤过、离心、弃去上清液，便制得单一心室肌细胞，将制得的心肌细胞置于KB液中保存备用。
, 百拇医药
1.2 溶液及药品
台氏液(mmol.L-1)：NaCl 143,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 0.5,NaH2PO4 0.25,HEPES 5,Glucose 5,NaOH 24.4。无钙台氏液是将台氏液中的CaCl2去除配制而成。KB液的组成(mmol.L-1)：KOH 70，L-Glutamic Acid 50,KCl 40,Taurine 20,KH2PO4 20,MgCl2 3,Glucose 10,HEPES 10,GEDTA 0.5。细胞内液组成(mmol.L-1)：K-asp 49.89,KCl 30.07,KH2PO4 25,HEPES 20.12,GEDTA 0.999,KOH 29.95,MgCl2 1,CaCl2 0.2,ATP-Na2 6.8。含Cs+台氏液：加CsCl于台氏液中，使其浓度为3mmol.L-1。QT配成2.5%母液备用。
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1.3 Ica的记录
采用全细胞方式膜片钳制方法记录Ica。用含3mmol.L-1CsCl的台氏液进行灌流，将心肌细胞放于浴槽内，静止10min后用尖端直径2～3μm的膜片电极进行千兆封接，并形成全细胞记录方式，用CEZ-2200膜片钳放大器使保护电位为-30mV，用SEN-7103电子刺激器使刺激时间为300ms，刺激间隔6s；用S-8300步阶脉冲发器使指令电位为-20～+60mV，间隔10mV。观察并用PIG-6201连续摄影机摄影记录，数据以
±s表示，通过t检验比较给药前后Ica变化的显著性。
2 结果
2.1 QT对ICa作用的电压依赖性
, 百拇医药
在上述条件下引出一慢内向离子电流，此电流可被Nifedipine 所阻断，证明其为ICa。实验中以Cs+阻断Ik[3]，观察到ICa在-20mV时已经被激活，在OmV时达最大值，通过I—V关系曲线可以看出，ICa随着指令电位的变化而发生规律性的变化，其反转电位大约为+60mV。在各指令电压下，不同浓度的QT均能明显地增加ICa，在峰电流电压下此作用最明显，但对其反转电位无明显影响(图1)。
图1 QT对钙离子电流的影响
A-B：给药前，lg.L-1 QT灌流期间的电流轨迹C：I-V关系曲线.●给药前，▲lg.L-1 QT.
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2.2 QT对ICa作用的浓度依赖性
QT对ICa的作用具有明显的浓度依赖关系(图2)。在指令电压OmV时，500g.L-1的QT使ICa增加9.5%(由1.03±0.15nA增至1.13±0.19nA,P<0.10，n＝3)，1g.L-1的QT使ICa增加29.3%(从0.99±0.15nA增至1.28±0.22nA,P<0.05，n=4),从量效曲线可以推测，QT对ICa作用的最大效应浓度为约2.5g.L-1,EC50约为1g.L-1。
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图2 QT与标准化Ica间的浓度-效应关系
●平均值，I标准差，由连续曲线测得EC50为lg.L-1
2.3 QT对ICa作用的可复性
QT对ICa的作用经冲洗可基本恢复至给药前的水平。2g.L-1的QT作用5min后，ICa由0.88nA增至1.18nA(n=2),经台氏液冲洗3min,ICa降至1.08nA,10min后ICa降至0.93nA(图3为其中的1例)。
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图3 QT减小Ica作用的可复性
保持电位-30mV，指令电位0mV, a:给药前 b:lg.L-1QT作用3min c:冲洗后5min.
3 讨论
充血性心力衰竭是一种多原因导致的心血管系统疾病，严重地威胁着患者的生命，其血流动力学表现为心脏不能射出足量血液以满足全身组织的需要。充血性心力衰竭时，心肌收缩力减弱，心输出量不足是导致心衰的重要因素。Ca2+在心肌兴奋一收缩耦联中的作用至关重要[4]。临床试用的结果发现QT具有明显的强心作用，可缓解充血性心衰的临床症状。本研究结果证明了QT能增加心肌细胞的Ca2+内流，使细胞内Ca2+增加，加强心肌细胞的兴奋—收缩耦联，使心肌收缩力加强，改善心衰时的血流动力学状态；另外，研究中还发现，QT尚能抑制心肌细胞的K+外流，故认为QT治疗心衰的作用可能与多种机制有关，而QT的其他作用及作用机制还有待进一步研究。
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QT是天然的生物高分子物质，对人体无毒、无害，来源丰富，价格低廉，故在临床应用上有着广泛的前景。
参考文献
[1]马克娴.甲壳胺人工皮在烧伤创面的作用.云南医药，1991，12(5)：279
[2]刘良明.甲壳素在创伤愈合中的应用前景.国外医学(军事医学分册) 1991，2：29
[3]Lijima T, Irisawa H and Kameyama M. Membrane currents and their modification by acetylachline in isolated single atrial cells of the guinea pigs, J physiol(Lond),1985,359:485
[4]张万年.心力衰竭(见金惠铭主编).病理生理学，第四版，北京：人民卫生出版社，1996：160—176
收稿时间：99-11-15, 百拇医药
单位：王丽娟(齐齐哈尔医学院药理教研室，齐齐哈尔，161042)；王丽娟 贾彦 张沈丽 孟文芳 邱丽萍 李金鸣(中国医科大学基础医学院药理学教研室，沈阳 110001)
关键词：QT，钙离子电流，充血性心力衰竭，膜片钳制技术
中国海洋药物000203 摘要 应用全细胞膜片钳制技术观察了QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流(ICa)的影响。结果显示：QT能明显增加心室肌细胞的Ca2+内流，使ICa增大。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响。在指令电位0 mV时，浓度为500mg.L-1、1g.L-1、2g.L-1的QT分别使ICa增加9.5%、29.3%和52.3%(分别P<0.10、P<0.05、P<0.01)，EC50约1g.L-1。QT对ICa的作用具有可复性。上述结果揭示：QT以电压依赖和浓度依赖的方式增加心肌细胞的Ca2+内流，此作用可能是其治疗充血性心力衰竭的机制之一。
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Wang Lijuan，Jia Yan，Zhang Shenli,et al
(Department of Pharmacology, China Medical University, Shenyang 110001)
ABSTRACT With patch clamp method,the effects of QT on slow inward calcium current(ICa) were investigated in single ventricular cells of guinea pigs. QT 0.5、1.0、2.0g.L-1reased ICa by 9.5%、29.3% and 52.3%,respectively, EC50and maximal effective concentration was near 1.0g.L-1and 2.5g.L-1.QT reased ICa in a dose-and voltage-dependent mode, but had little effect on reversal potential.Those results show QT can open the calaium channel of ventricular cells.
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KEY WORDS QT calcium current (ICa)，Congestive heart failure (CHF)，Patch clamp method.
QT(暂用此代号)，主要来自于海洋生物蟹和虾的壳中，是一种天然高分子多聚糖，能溶于水。近年来的研究表明，本类高分子物质具有抗菌、解毒、调节免疫功能、促进组织修复等作用，在治疗烧伤、创伤、抗肿瘤等方面具有明显的疗效[1、2]。临床试用还发现QT对治疗心衰有一定疗效，但机制尚不清楚，本文应用全细胞膜片钳制技术观察了QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞分离
豚鼠，体重325±38g，雌雄兼用。用戊巴比妥钠(50mg.kg-1)麻醉后开胸，在人工呼吸机辅助下行主动脉插管，迅速取出心脏，置于Langandoff灌流装置上，在37℃恒温及供氧条件下，先用普通台氏液及无钙台氏液分别灌流5min，然后换成含胶原酶(Yakult,Japan,4mg/40ml)的无钙台氏液循环灌流10～20min,再用KB液冲洗终止消化。取下心脏，剪碎心室肌并稍加振荡，经滤过、离心、弃去上清液，便制得单一心室肌细胞，将制得的心肌细胞置于KB液中保存备用。
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1.2 溶液及药品
台氏液(mmol.L-1)：NaCl 143,KCl 5.4,CaCl2 1.8,MgCl2 0.5,NaH2PO4 0.25,HEPES 5,Glucose 5,NaOH 24.4。无钙台氏液是将台氏液中的CaCl2去除配制而成。KB液的组成(mmol.L-1)：KOH 70，L-Glutamic Acid 50,KCl 40,Taurine 20,KH2PO4 20,MgCl2 3,Glucose 10,HEPES 10,GEDTA 0.5。细胞内液组成(mmol.L-1)：K-asp 49.89,KCl 30.07,KH2PO4 25,HEPES 20.12,GEDTA 0.999,KOH 29.95,MgCl2 1,CaCl2 0.2,ATP-Na2 6.8。含Cs+台氏液：加CsCl于台氏液中，使其浓度为3mmol.L-1。QT配成2.5%母液备用。
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1.3 Ica的记录
采用全细胞方式膜片钳制方法记录Ica。用含3mmol.L-1CsCl的台氏液进行灌流，将心肌细胞放于浴槽内，静止10min后用尖端直径2～3μm的膜片电极进行千兆封接，并形成全细胞记录方式，用CEZ-2200膜片钳放大器使保护电位为-30mV，用SEN-7103电子刺激器使刺激时间为300ms，刺激间隔6s；用S-8300步阶脉冲发器使指令电位为-20～+60mV，间隔10mV。观察并用PIG-6201连续摄影机摄影记录，数据以
±s表示，通过t检验比较给药前后Ica变化的显著性。2 结果
2.1 QT对ICa作用的电压依赖性
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在上述条件下引出一慢内向离子电流，此电流可被Nifedipine 所阻断，证明其为ICa。实验中以Cs+阻断Ik[3]，观察到ICa在-20mV时已经被激活，在OmV时达最大值，通过I—V关系曲线可以看出，ICa随着指令电位的变化而发生规律性的变化，其反转电位大约为+60mV。在各指令电压下，不同浓度的QT均能明显地增加ICa，在峰电流电压下此作用最明显，但对其反转电位无明显影响(图1)。
图1 QT对钙离子电流的影响
A-B：给药前，lg.L-1 QT灌流期间的电流轨迹C：I-V关系曲线.●给药前，▲lg.L-1 QT.
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2.2 QT对ICa作用的浓度依赖性
QT对ICa的作用具有明显的浓度依赖关系(图2)。在指令电压OmV时，500g.L-1的QT使ICa增加9.5%(由1.03±0.15nA增至1.13±0.19nA,P<0.10，n＝3)，1g.L-1的QT使ICa增加29.3%(从0.99±0.15nA增至1.28±0.22nA,P<0.05，n=4),从量效曲线可以推测，QT对ICa作用的最大效应浓度为约2.5g.L-1,EC50约为1g.L-1。
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图2 QT与标准化Ica间的浓度-效应关系
●平均值，I标准差，由连续曲线测得EC50为lg.L-1
2.3 QT对ICa作用的可复性
QT对ICa的作用经冲洗可基本恢复至给药前的水平。2g.L-1的QT作用5min后，ICa由0.88nA增至1.18nA(n=2),经台氏液冲洗3min,ICa降至1.08nA,10min后ICa降至0.93nA(图3为其中的1例)。
, http://www.100md.com
图3 QT减小Ica作用的可复性
保持电位-30mV，指令电位0mV, a:给药前 b:lg.L-1QT作用3min c:冲洗后5min.
3 讨论
充血性心力衰竭是一种多原因导致的心血管系统疾病，严重地威胁着患者的生命，其血流动力学表现为心脏不能射出足量血液以满足全身组织的需要。充血性心力衰竭时，心肌收缩力减弱，心输出量不足是导致心衰的重要因素。Ca2+在心肌兴奋一收缩耦联中的作用至关重要[4]。临床试用的结果发现QT具有明显的强心作用，可缓解充血性心衰的临床症状。本研究结果证明了QT能增加心肌细胞的Ca2+内流，使细胞内Ca2+增加，加强心肌细胞的兴奋—收缩耦联，使心肌收缩力加强，改善心衰时的血流动力学状态；另外，研究中还发现，QT尚能抑制心肌细胞的K+外流，故认为QT治疗心衰的作用可能与多种机制有关，而QT的其他作用及作用机制还有待进一步研究。
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QT是天然的生物高分子物质，对人体无毒、无害，来源丰富，价格低廉，故在临床应用上有着广泛的前景。
参考文献
[1]马克娴.甲壳胺人工皮在烧伤创面的作用.云南医药，1991，12(5)：279
[2]刘良明.甲壳素在创伤愈合中的应用前景.国外医学(军事医学分册) 1991，2：29
[3]Lijima T, Irisawa H and Kameyama M. Membrane currents and their modification by acetylachline in isolated single atrial cells of the guinea pigs, J physiol(Lond),1985,359:485
[4]张万年.心力衰竭(见金惠铭主编).病理生理学，第四版，北京：人民卫生出版社，1996：160—176
收稿时间：99-11-15, 百拇医药