Th1/Th2细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的作用
作者：姜荣龙 卢桥生 郭亚兵 侯金林 冯筱榕 章廉 骆抗先 富宁
单位：姜荣龙(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；卢桥生(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；郭亚兵(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；侯金林(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；冯筱榕(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
关键词：慢性HBV感染；白细胞介素-4；干扰素-γ
第一军医大学学报000217 摘要：目的 了解慢性HBV感染者外周血单核细胞(PBMC)中CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ的表达情况，以测定Th0/Th1/Th2 细胞的百分数，探明Th1、Th2细胞在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离PBMC，在PMA、ionomycin、莫能菌素的刺激下，采用流式细胞检测(FACS)对慢性HBV感染者PBMC中CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ表达进行分析。结果 正常对照组，2.3%～18.6%的CD4+T细胞为Th1细胞，0.9%～9.2%为Th2细胞；在慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞中，以Th0细胞居多；而Th1细胞则随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而明显增多，在炎症活动明显的慢性乙型肝炎患者中，Th1细胞百分数明显高于炎症活动呈静止状态的慢性乙型肝炎；Th2细胞在慢性HBV感染的不同阶段则较为恒定，但明显高于对照组。结论 Th1细胞与炎症活动呈正相关，Th2细胞可能与HBV感染的慢性化相关联。
, 百拇医药
中图分类号：R392.12; R512.62 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0103-03
Role of T helper cells in chronic hepatitis B virus infection
JIANG Rong-long，LU Qiao-sheng，GUO Ya-bing，HOU Jin-lin，FENG Xiao-rong，ZHANG Lian，LUO Kang-xian
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
, 百拇医药
FU Ning
(Department of Infectious Diseases, Department of Immunology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective The ratio of Th0/Th1/Th2 cells in chronic HBV-infected individuals was investigated by determining the expression of IL-4/IFN-γ in single CD4+ T cells isolated from peripheral blood, and the role of Th1/Th2 cytokines in chronic HBV-infection was analyzed. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from chronically HBV-infected individuals were isolated routinely, stimulated by PMA, ionomycin and monensin, and the production of IL-4/IFN-γby CD4+ T cells in PBMC was determined by FACS analysis. Results The percentage of IFN-γ-producing T cells and IL-4-producing T cells ranged from 2.3% to 18.6% and from 0.9% to 9.2% respectively in CD4+ cells in non-infected individuals. The majority of CD4+ T cells from PBMCs in chronic HBV-infected individuals were Th0 cells. The percentage of Th1 cells increased significantly with the hepatic inflammation activity. The percentage of Th1 cells was higher in advanced stage than in stationary phase of chronic hepatitis B. The percentage of Th2 cells in CD4+ T cells from HBV-infected individuals showed no significant difference at different stages, but was higher than that from controls. Conclusion The results indicated that Th1 phenotype cytokines were associated with hepatic inflammation activity of chronic hepatitis B and Th2 cells may be associated with the chronicity of HBV infection.
, 百拇医药
Key words: chronic Hepatitis B; IL-4; IFN-γ
小鼠T细胞克隆性分析将Th细胞分为Th1、Th2两类。Th1细胞以分泌白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-2 (IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)为特征，主要参与细胞介导的免疫反应，并在抵御病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用；Th2细胞则以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10为特征，主要调节体液免疫反应，并在抵御细胞外致病因子方面发挥作用，还与细胞内病原所致的进展性疾病相关联[1～3]。
乙型肝炎病毒(HBV)对被感染的肝细胞并没有直接的致细胞病变作用。与HBV感染相关的急慢性肝炎被认为是免疫介导性疾病，而且对自肝脏分离的T细胞克隆的研究认为，T细胞介导的细胞毒性可引起肝细胞的损伤。体外实验也已证实，通过识别肝细胞上HBV编码的HBcAg和HBeAg，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以HLA-1类限制的方式损伤肝细胞，但其确切机制并未阐明[4]。Th1、Th2细胞的失衡在慢性HBV感染中的作用近来备受关注[5]，为阐明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采用流式细胞检测(FCM)分析了慢性HBV感染者外周血单个CD4+ T细胞内IL-4和IFN-γ的产生。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1病人
本研究所有病例均为第一军医大学南方医院感染内科1998年6月至12月门诊及住院患者。按照1995年(北京)传染病与寄生虫病学术会议修订的μ病毒性肝炎防治方案(试行)μ的临床肝炎诊断标准，选择34例慢性HBV感染者，分为3组，即慢性HBV携带者(AsC)、中度及重度慢性乙型肝炎(乙肝)。正常对照12例取自门诊健康体检者。46例受检者，年龄17～54岁(平均32.6岁)；慢性HBV感染者的HBV血清学检查 HBsAg均为阳性，抗HBs阴性(ELISA)，其中25例HBeAg阳性，9例抗HBe阳性；正常对照组HBV血清标志物全部阴性，所有受检者抗-HCV阴性(第二代试剂盒，EIA)。除AsC外的所有慢性HBV感染者均经肝组织活检证实。
1.2 细胞
取新鲜肝素抗凝全血3 ml，常规密度梯度离心分离PBMC，以鼠抗人CD8单克隆抗体(mAb)(Pharmingen Reagent)及新鲜兔血清处理，去除CD8+ T细胞，制备无CD8+ T细胞的PBMC。
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1.3 Reage FACS分析细胞内产生的细胞因子
参照Jung等[6]的方法并进行了改进。新鲜分离的无CD8+T细胞的PBMC，在塑料培养皿上贴附培养1.5 h后，移去贴附细胞。以T细胞刺激剂佛波二酯(PMA，Sigma)1 ng/ml、钙离子导入剂ionomycin 1 μ mol/L (Sigma)、莫能菌素 1 μ mol/L (Sigma)刺激细胞37℃ 4 h；离心，去上清；以含0.5%(m/V)BSA 的PBS洗涤1次，离心，去上清；以固定液处理细胞样品10 min，继之以渗透液处理10 min， 避光冰浴；加入鼠抗人IFN-γ单克隆抗体 (PE)、IL-4 单克隆抗体(FITC，Pharmingen Reagent) 45 min，4℃避光，以含0.5%(m/V)BSA的 PBS洗涤1次，离心，去上清，加500 μ l PBS混匀细胞，作流式细胞检测(FACS)，计算产生IFN-γ、IL-4的细胞百分率。所有样品均同步设一未加刺激剂的细胞样品作为对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 细胞因子的细胞内染色
为了能测定慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ细胞的百分率，我们对文献所述方法进行了改进[6]。通过放弃贴壁的单核细胞以纯化淋巴细胞，并以PMA和ionomycin刺激细胞，测定IL-4、IFN-γ表达阳性的细胞百分率。培养液中未加任何刺激剂时，以任一单抗鉴定均未获得明显的荧光信号，而在PMA和ionomycin 刺激下，部分细胞IL-4、IFN-γ表达阳性，但对照IgG为阴性。莫能菌素能促进新合成的蛋白质在高尔基复合体的聚集，未经PMA和ionomycin刺激的细胞，即使在莫能菌素的作用下，在细胞内也未能检测到这两种细胞因子的表达 (资料未显示)。
2.2 慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ细胞的百分率
正常对照组中2.3%～18.6%的细胞仅表达IFN-γ，为Th1细胞；0.9%～9.2%的细胞只表达IL-4，为Th2细胞。在所有实验，均以正常对照作为内参照。结果见图1。从图1可看出Th1细胞随着肝组织炎症活动的加剧，比例明显增加(P<0.05); 而Th2细胞的百分数在不同类型的慢性乙型肝炎中无明显差异(P>0.05)，但较之对照组明显增高(P<0.05)。
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图1 慢性HBV 感染者及对照组IL-4/IFN-产生的Th 细胞百分数
Fig.1 Percentage of IL-4 and IFN--producing cells in T helper cells from chronic HBV-infected
individuals
3 讨论
Th1/Th2 细胞失调在慢性HBV感染中的作用，日益受到人们的关注。HBV感染的慢性化一直以来被普遍认为主要是人体细胞免疫功能降低所致，但其细胞免疫功能低下的机制尚未阐明。Th1/Th2 类细胞的不平衡似能较合理的解释这一机制。曾有文献报道[7]，急性自限性乙肝急性期产生的Th1类细胞因子明显比对照组高，恢复期病人Th细胞表现为Th0功能，同时分泌Th1/Th2 类细胞因子。Th1细胞可增强机体的细胞免疫应答功能，有利于清除病毒，但同时与肝细胞的炎症损伤相关联。从慢性乙肝患者肝组织分离的Th 细胞克隆，75%为Th0 细胞，25%为Th1细胞[8、9]。但是，对不同类型慢性HBV感染者PBMC中Th0/Th1/Th2 细胞的分布的研究则未见报道。本文结果表明，慢性乙型肝炎PBMC中，Th0占大多数，少部分为Th2细胞，但是随着肝组织炎症活动的加剧，Th1类细胞比例明显增加，提示Th1细胞与肝组织损伤密切关联。我们假设在HBV感染期间存在着Th0→Th1细胞的转化，使得Th1细胞占主导地位，因而直接或间接地增强NK细胞、巨噬细胞、尤其是CTL细胞的活性，促进细胞免疫反应，加重肝组织的炎症损伤。Th2细胞的百分数在不同类型的慢性乙型肝炎中无明显差异，但较之对照组明显增高，提示Th2细胞与HBV感染的慢性化相关。
, http://www.100md.com
作者简介：姜荣龙(1964-)，男，浙江江山人，1987年毕业于第一军医大学，博士，主治医师，讲师，电话：85141944
作者单位：章廉(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
骆抗先(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
富宁(第一军医大学 免疫学教研室, 广东 广州 510515)
参考文献
1，Mosman TR, Coffman RL.Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional property[J]. Annu Rev Immunol, 1989, 7:145～73.
, 百拇医药
2，Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG et al. IL-10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and peripheral blood T cells[J]. J Immunol, 1992, 149: 2378～84.
3，Firestein GS, Roeder WD, Laxer JA et al. A new murine CD4+ T cell subsets with an unrestricted cytokine profile[J]. J Immunol, 1985, 143: 518～25.
4，Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis[J]. Annu Rev Immunol, 1995, 13: 29～60.
, http://www.100md.com
5，Barnaba V, Franco A, Paroli M et al. Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with CD4+ CD56+ surface phenotype and a T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus[J]. J Immunol, 1994, 154: 3074～87.
6，Jung T, U Schauer, C Heusser et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry[J]. J Immunol Methods, 1993, 159: 197～207.
, 百拇医药 7，Penna A, Del Prete G, Cavalli A et al. Predominant T helper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B[J]. Hepatology, 1997, 25: 1022～7.
8，Antonio Bertoletri, Mario M D’Elios, Carolina Boni et al. Different cytokine profiles of intrahepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infection[J]. Gastroenterology, 1997, 112: 193～9.
9，Vingerhoets J, Michielsen P, Vanham G et al. HBV-specific lymphoproliferative and cytokine responses in patients with chronic hepatitis B[J]. J Hepatology, 1998, 28: 8～16.
收稿日期：1999-05-05, http://www.100md.com
单位：姜荣龙(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；卢桥生(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；郭亚兵(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；侯金林(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)；冯筱榕(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
关键词：慢性HBV感染；白细胞介素-4；干扰素-γ
第一军医大学学报000217 摘要：目的 了解慢性HBV感染者外周血单核细胞(PBMC)中CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ的表达情况，以测定Th0/Th1/Th2 细胞的百分数，探明Th1、Th2细胞在慢性HBV感染中的作用。方法 常规分离PBMC，在PMA、ionomycin、莫能菌素的刺激下，采用流式细胞检测(FACS)对慢性HBV感染者PBMC中CD4+T细胞内IL-4和IFN-γ表达进行分析。结果 正常对照组，2.3%～18.6%的CD4+T细胞为Th1细胞，0.9%～9.2%为Th2细胞；在慢性HBV感染者外周血单个CD4+T细胞中，以Th0细胞居多；而Th1细胞则随着慢性乙型肝炎肝脏炎症活动的加剧而明显增多，在炎症活动明显的慢性乙型肝炎患者中，Th1细胞百分数明显高于炎症活动呈静止状态的慢性乙型肝炎；Th2细胞在慢性HBV感染的不同阶段则较为恒定，但明显高于对照组。结论 Th1细胞与炎症活动呈正相关，Th2细胞可能与HBV感染的慢性化相关联。
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中图分类号：R392.12; R512.62 文献标识码：A
文章编号：1000-2588(2000)02-0103-03
Role of T helper cells in chronic hepatitis B virus infection
JIANG Rong-long，LU Qiao-sheng，GUO Ya-bing，HOU Jin-lin，FENG Xiao-rong，ZHANG Lian，LUO Kang-xian
(Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
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FU Ning
(Department of Infectious Diseases, Department of Immunology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective The ratio of Th0/Th1/Th2 cells in chronic HBV-infected individuals was investigated by determining the expression of IL-4/IFN-γ in single CD4+ T cells isolated from peripheral blood, and the role of Th1/Th2 cytokines in chronic HBV-infection was analyzed. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from chronically HBV-infected individuals were isolated routinely, stimulated by PMA, ionomycin and monensin, and the production of IL-4/IFN-γby CD4+ T cells in PBMC was determined by FACS analysis. Results The percentage of IFN-γ-producing T cells and IL-4-producing T cells ranged from 2.3% to 18.6% and from 0.9% to 9.2% respectively in CD4+ cells in non-infected individuals. The majority of CD4+ T cells from PBMCs in chronic HBV-infected individuals were Th0 cells. The percentage of Th1 cells increased significantly with the hepatic inflammation activity. The percentage of Th1 cells was higher in advanced stage than in stationary phase of chronic hepatitis B. The percentage of Th2 cells in CD4+ T cells from HBV-infected individuals showed no significant difference at different stages, but was higher than that from controls. Conclusion The results indicated that Th1 phenotype cytokines were associated with hepatic inflammation activity of chronic hepatitis B and Th2 cells may be associated with the chronicity of HBV infection.
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Key words: chronic Hepatitis B; IL-4; IFN-γ
小鼠T细胞克隆性分析将Th细胞分为Th1、Th2两类。Th1细胞以分泌白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-2 (IFN-γ)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)为特征，主要参与细胞介导的免疫反应，并在抵御病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用；Th2细胞则以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10为特征，主要调节体液免疫反应，并在抵御细胞外致病因子方面发挥作用，还与细胞内病原所致的进展性疾病相关联[1～3]。
乙型肝炎病毒(HBV)对被感染的肝细胞并没有直接的致细胞病变作用。与HBV感染相关的急慢性肝炎被认为是免疫介导性疾病，而且对自肝脏分离的T细胞克隆的研究认为，T细胞介导的细胞毒性可引起肝细胞的损伤。体外实验也已证实，通过识别肝细胞上HBV编码的HBcAg和HBeAg，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以HLA-1类限制的方式损伤肝细胞，但其确切机制并未阐明[4]。Th1、Th2细胞的失衡在慢性HBV感染中的作用近来备受关注[5]，为阐明Th1/Th2细胞在慢性HBV感染中的作用，我们采用流式细胞检测(FCM)分析了慢性HBV感染者外周血单个CD4+ T细胞内IL-4和IFN-γ的产生。
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1 材料与方法
1.1病人
本研究所有病例均为第一军医大学南方医院感染内科1998年6月至12月门诊及住院患者。按照1995年(北京)传染病与寄生虫病学术会议修订的μ病毒性肝炎防治方案(试行)μ的临床肝炎诊断标准，选择34例慢性HBV感染者，分为3组，即慢性HBV携带者(AsC)、中度及重度慢性乙型肝炎(乙肝)。正常对照12例取自门诊健康体检者。46例受检者，年龄17～54岁(平均32.6岁)；慢性HBV感染者的HBV血清学检查 HBsAg均为阳性，抗HBs阴性(ELISA)，其中25例HBeAg阳性，9例抗HBe阳性；正常对照组HBV血清标志物全部阴性，所有受检者抗-HCV阴性(第二代试剂盒，EIA)。除AsC外的所有慢性HBV感染者均经肝组织活检证实。
1.2 细胞
取新鲜肝素抗凝全血3 ml，常规密度梯度离心分离PBMC，以鼠抗人CD8单克隆抗体(mAb)(Pharmingen Reagent)及新鲜兔血清处理，去除CD8+ T细胞，制备无CD8+ T细胞的PBMC。
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1.3 Reage FACS分析细胞内产生的细胞因子
参照Jung等[6]的方法并进行了改进。新鲜分离的无CD8+T细胞的PBMC，在塑料培养皿上贴附培养1.5 h后，移去贴附细胞。以T细胞刺激剂佛波二酯(PMA，Sigma)1 ng/ml、钙离子导入剂ionomycin 1 μ mol/L (Sigma)、莫能菌素 1 μ mol/L (Sigma)刺激细胞37℃ 4 h；离心，去上清；以含0.5%(m/V)BSA 的PBS洗涤1次，离心，去上清；以固定液处理细胞样品10 min，继之以渗透液处理10 min， 避光冰浴；加入鼠抗人IFN-γ单克隆抗体 (PE)、IL-4 单克隆抗体(FITC，Pharmingen Reagent) 45 min，4℃避光，以含0.5%(m/V)BSA的 PBS洗涤1次，离心，去上清，加500 μ l PBS混匀细胞，作流式细胞检测(FACS)，计算产生IFN-γ、IL-4的细胞百分率。所有样品均同步设一未加刺激剂的细胞样品作为对照。
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2 结果
2.1 细胞因子的细胞内染色
为了能测定慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ细胞的百分率，我们对文献所述方法进行了改进[6]。通过放弃贴壁的单核细胞以纯化淋巴细胞，并以PMA和ionomycin刺激细胞，测定IL-4、IFN-γ表达阳性的细胞百分率。培养液中未加任何刺激剂时，以任一单抗鉴定均未获得明显的荧光信号，而在PMA和ionomycin 刺激下，部分细胞IL-4、IFN-γ表达阳性，但对照IgG为阴性。莫能菌素能促进新合成的蛋白质在高尔基复合体的聚集，未经PMA和ionomycin刺激的细胞，即使在莫能菌素的作用下，在细胞内也未能检测到这两种细胞因子的表达 (资料未显示)。
2.2 慢性HBV感染者PBMC中表达IL-4、IFN-γ细胞的百分率
正常对照组中2.3%～18.6%的细胞仅表达IFN-γ，为Th1细胞；0.9%～9.2%的细胞只表达IL-4，为Th2细胞。在所有实验，均以正常对照作为内参照。结果见图1。从图1可看出Th1细胞随着肝组织炎症活动的加剧，比例明显增加(P<0.05); 而Th2细胞的百分数在不同类型的慢性乙型肝炎中无明显差异(P>0.05)，但较之对照组明显增高(P<0.05)。
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图1 慢性HBV 感染者及对照组IL-4/IFN-产生的Th 细胞百分数
Fig.1 Percentage of IL-4 and IFN--producing cells in T helper cells from chronic HBV-infected
individuals
3 讨论
Th1/Th2 细胞失调在慢性HBV感染中的作用，日益受到人们的关注。HBV感染的慢性化一直以来被普遍认为主要是人体细胞免疫功能降低所致，但其细胞免疫功能低下的机制尚未阐明。Th1/Th2 类细胞的不平衡似能较合理的解释这一机制。曾有文献报道[7]，急性自限性乙肝急性期产生的Th1类细胞因子明显比对照组高，恢复期病人Th细胞表现为Th0功能，同时分泌Th1/Th2 类细胞因子。Th1细胞可增强机体的细胞免疫应答功能，有利于清除病毒，但同时与肝细胞的炎症损伤相关联。从慢性乙肝患者肝组织分离的Th 细胞克隆，75%为Th0 细胞，25%为Th1细胞[8、9]。但是，对不同类型慢性HBV感染者PBMC中Th0/Th1/Th2 细胞的分布的研究则未见报道。本文结果表明，慢性乙型肝炎PBMC中，Th0占大多数，少部分为Th2细胞，但是随着肝组织炎症活动的加剧，Th1类细胞比例明显增加，提示Th1细胞与肝组织损伤密切关联。我们假设在HBV感染期间存在着Th0→Th1细胞的转化，使得Th1细胞占主导地位，因而直接或间接地增强NK细胞、巨噬细胞、尤其是CTL细胞的活性，促进细胞免疫反应，加重肝组织的炎症损伤。Th2细胞的百分数在不同类型的慢性乙型肝炎中无明显差异，但较之对照组明显增高，提示Th2细胞与HBV感染的慢性化相关。
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作者简介：姜荣龙(1964-)，男，浙江江山人，1987年毕业于第一军医大学，博士，主治医师，讲师，电话：85141944
作者单位：章廉(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
骆抗先(第一军医大学 南方医院感染内科, 广东 广州 510515)
富宁(第一军医大学 免疫学教研室, 广东 广州 510515)
参考文献
1，Mosman TR, Coffman RL.Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional property[J]. Annu Rev Immunol, 1989, 7:145～73.
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2，Yssel H, De Waal Malefyt R, Roncarolo MG et al. IL-10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and peripheral blood T cells[J]. J Immunol, 1992, 149: 2378～84.
3，Firestein GS, Roeder WD, Laxer JA et al. A new murine CD4+ T cell subsets with an unrestricted cytokine profile[J]. J Immunol, 1985, 143: 518～25.
4，Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis[J]. Annu Rev Immunol, 1995, 13: 29～60.
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5，Barnaba V, Franco A, Paroli M et al. Selective expansion of cytotoxic T lymphocytes with CD4+ CD56+ surface phenotype and a T helper type 1 profile of cytokine secretion in the liver of patients chronically infected with hepatitis B virus[J]. J Immunol, 1994, 154: 3074～87.
6，Jung T, U Schauer, C Heusser et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry[J]. J Immunol Methods, 1993, 159: 197～207.
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8，Antonio Bertoletri, Mario M D’Elios, Carolina Boni et al. Different cytokine profiles of intrahepatic T cells in chronic hepatitis B and hepatitis C virus infection[J]. Gastroenterology, 1997, 112: 193～9.
9，Vingerhoets J, Michielsen P, Vanham G et al. HBV-specific lymphoproliferative and cytokine responses in patients with chronic hepatitis B[J]. J Hepatology, 1998, 28: 8～16.
收稿日期：1999-05-05, http://www.100md.com